枸杞子中玉米黃素雙棕櫚酸酯及枸杞酸的測(cè)定

周慧吉，彭 博，李廷釗,，陳 亮，李 波,,

（1.安利（中國(guó)）研發(fā)中心，上海 201203；2.安利（中國(guó)）植物研發(fā)中心，江蘇無錫 214145）

枸杞子為茄科植物寧夏枸杞（Lycium barbarumL.）的干燥成熟果實(shí)，主要分布在我國(guó)西北的青海、寧夏、甘肅和新疆等地。枸杞子是我國(guó)傳統(tǒng)藥材，具有滋補(bǔ)肝腎，益精明目的作用[1]?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)其具有調(diào)節(jié)免疫、保肝[2?3]、抗氧化損傷[4]、保護(hù)視力[5]等作用。枸杞子中的化學(xué)成分分為脂溶性和水溶性成分。脂溶性成分主要是類胡蘿卜素類等[6?7]，又以玉米黃素雙棕櫚酸酯（C72H116O4，ZDP）為主以及少量玉米黃素[8?9]等。ZDP 在體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化成玉米黃素[10?11]，是預(yù)防黃斑病變和保護(hù)肝臟的主要成分[12?14]。枸杞子中的水溶性成分主要是2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗壞血酸（C12H18O11，枸杞酸，AA2βG）、甜菜堿[15]和枸杞多糖[16]等物質(zhì)。其中枸杞酸是天然的維生素C 前體物質(zhì)[17?18]，具有美白、抗氧化、抗衰老、保肝等功效[19?21]。

枸杞子原料的產(chǎn)地來源多，質(zhì)量也存在較大差異。目前，市場(chǎng)上枸杞聲稱以枸杞多糖為主要成分，且藥典中以多糖和甜菜堿作為指標(biāo)。然而，一方面枸杞中多糖檢測(cè)繁瑣，專屬性不強(qiáng)，誤差大；另一方面，甜菜堿的合成價(jià)格便宜，且甜菜根中含有大量甜菜堿[22?23]，專屬性較差，不能很好的用于枸杞子品質(zhì)評(píng)價(jià)。ZDP 和枸杞酸在枸杞子中含量豐富，且枸杞酸僅存在枸杞子中[24?25]。兩種成分的含量均隨著枸杞子成熟度升高而增高，其含量高低也是枸杞子品質(zhì)的最直接反映[26?27]。已有文獻(xiàn)報(bào)道過ZDP 檢測(cè)方法[28]，前處理步驟多，易產(chǎn)生系統(tǒng)誤差，且流動(dòng)相體系復(fù)雜。枸杞酸已用于枸杞子提取物的品質(zhì)評(píng)價(jià)[16]，但未應(yīng)用于枸杞子原藥材的研究。

由于ZDP 和枸杞酸的極性相差太大，暫不適合一起制備和分析（結(jié)構(gòu)圖見圖1）[29]。針對(duì)ZDP 成分，本文采用先去除枸杞子水溶性成分再提取ZDP的方法，減少轉(zhuǎn)移次數(shù)，且流動(dòng)相僅為丙酮及甲醇，前處理和液相條件均相對(duì)簡(jiǎn)單。另外，本文采用UPLC檢測(cè)枸杞原料中枸杞酸的含量，分析速度快，分離度好，可在很大程度上縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)效率。本實(shí)驗(yàn)以ZDP 和枸杞酸作為枸杞子藥材的指標(biāo)成分進(jìn)行品質(zhì)評(píng)價(jià)，既兼顧脂溶性和水溶性成分，又體現(xiàn)了活性和特征性成分，還能有效檢測(cè)枸杞子藥材染色、摻假等情況，為日后提高枸杞子及其制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

圖1 玉米黃素雙棕櫚酸酯（1）和枸杞酸（2）結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structure of zeaxanthin dipalmitate (1) and 2-O-(β-D-Glucopyranosyl) ascorbic acid (2)

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枸杞子 共22 批，分別采自寧夏、甘肅、青海，具體信息見表1，經(jīng)上海安利研發(fā)中心中藥學(xué)專業(yè)陳亮博士鑒定為茄科植物寧夏枸杞（Lycium barbarumL.）的干燥成熟果實(shí)；正己烷、乙腈、甲醇 色譜級(jí)，美國(guó)Fisher 公司；丙酮 AR 級(jí)別，Greagent 公司；對(duì)照品枸杞酸（批號(hào)8030，CAS 號(hào)562043-82-7） 上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；玉米黃素雙棕櫚酸酯（批號(hào)12） 上海甄選生物；醋酸銨 分析純，上海泰坦科技有限公司。

表1 22 批枸杞子信息Table 1 Information of 22 batches of Lycium barbarum

超純水系統(tǒng) 上海技舟化工科技有限公司；WF-600EHT 型超聲波清洗機(jī) 寧波海曙五方超聲設(shè)備有限公司；XS2051/10 萬分之一電子天平、MS3002S 型電子分析天平 梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司；高效液相色譜儀HPLC（配PDA 檢測(cè)器）、超高效液相色譜儀UPLC（配PDA 檢測(cè)器） 美國(guó)Waters 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液制備

1.2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取ZDP 標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，加正己烷-丙酮（1:1）混合溶劑制成5 mg/mL對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密稱取枸杞酸對(duì)照品5 mg 左右，用水溶解，制成5 mg/mL 枸杞酸對(duì)照品儲(chǔ)備液。

1.2.1.2 供試品溶液的制備 ZDP 提取方法參考文獻(xiàn)[29]并進(jìn)行調(diào)整。將枸杞子放在液氮中迅速冷凍后打粉，取枸杞子粉末（過40 目篩）約500.000 mg，精密稱定，加蒸餾水50 mL，超聲處理20 min。樣品溶液高速離心后棄去上清液。殘?jiān)屑诱和?丙酮（1:1）混合溶劑20 mL，超聲處理5 次至殘?jiān)鼰o色，每次20 min，過濾，合并濾液，用正己烷-丙酮混合溶劑定容至100 mL，搖勻，0.45 μm 濾膜過濾，即得枸杞子提取液。注意提取過程在避光條件下進(jìn)行。

枸杞酸提取方法參考文獻(xiàn)[19]并進(jìn)行調(diào)整。將枸杞子在液氮中迅速冷凍后打粉，取枸杞子粉末（過40 目篩）約500.000 mg，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入蒸餾水25 mL，稱定重量，超聲處理40 min，放冷至室溫，用蒸餾水補(bǔ)足減失重量，搖勻。取清液1 mL 至25 mL 容量瓶中，用流動(dòng)相定容，0.45 μm 濾膜過濾，即得枸杞酸提取液。

1.2.2 色譜條件 ZDP 檢測(cè)：Luna C18（2）色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相丙酮:甲醇=55:45，等度洗脫，流速1 mL/min，柱溫25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm，進(jìn)樣量10 μL。

枸杞酸檢測(cè)：Waters 二醇基柱Torus TM Diol Column（100 mm×3 mm，1.7 μm）；進(jìn)樣量2 μL；流動(dòng)相為乙腈?66.7 mmol/L 醋酸銨（體積比85:15），等度洗脫，流速為0.4 mL/min，柱溫40 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm。

1.2.3 含量計(jì)算

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 用正己烷-丙酮（1:1）混合溶劑稀釋“1.2.1.1”項(xiàng)下ZDP 的對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別配制成10、20、40、60、80、100 μg/mL 的ZDP 對(duì)照品溶液，依次精密吸取對(duì)照品溶液10 μL 注入液相色譜儀，按照“1.2.2”項(xiàng)下ZDP 色譜條件下進(jìn)行測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）擬合，得到線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

用流動(dòng)相乙腈-66.7 mmol/L 醋酸銨溶液（體積比85:15）稀釋“1.2.1.1”項(xiàng)下枸杞酸對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別配制成3.125、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL的枸杞酸對(duì)照品溶液，依次精密吸取對(duì)照品溶液2 μL 注入液相色譜儀，按照“1.2.2”項(xiàng)下枸杞酸色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）擬合，得到線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.2.3.2 結(jié)果計(jì)算 試樣中ZDP、枸杞酸的含量按下式計(jì)算：

式中：X-試樣中ZDP 和枸杞酸的含量，%；c-根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的試樣中ZDP 和枸杞酸的濃度，μg/mL；D-稀釋倍數(shù)；V-定容液的體積，mL；m-試樣的稱樣量，mg。

1.2.4 方法學(xué)考察實(shí)驗(yàn) 通過線性度、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加標(biāo)回收率等考察方法的可行性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采集和分析軟件分別為Waters e2695 自帶的Empower 3FR3 和Excel 2016。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系

將ZDP 和枸杞酸的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，各自按照實(shí)驗(yàn)色譜條件依次進(jìn)樣，根據(jù)濃度與峰面積的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。ZDP 的線性方程為y=4×107x+1646.9，r=0.9990。表明ZDP 在質(zhì)量濃度10～100 μg/mL 范圍內(nèi)線性良好。枸杞酸的線性方程為y=11264x?1005，r=1.0000。表明枸杞酸當(dāng)質(zhì)量濃度為3.125～100 μg/mL 范圍內(nèi)時(shí)線性良好。

2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

由于丙酮溶劑揮發(fā)性極強(qiáng)，取ZDP 對(duì)照品溶液分裝到6 個(gè)液相小瓶中，精密吸取對(duì)照品溶液10 μL注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄ZDP 的峰面積；精密吸取枸杞酸對(duì)照品溶液2 μL 注入液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6 次，記錄枸杞酸的峰面積，結(jié)果如表2。兩者的RSD 分別為0.85%、0.83%，表明儀器精密度良好。

表2 玉米黃素雙棕櫚酸酯對(duì)照品及枸杞酸對(duì)照品精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 2 Precision test results of zeaxanthin dipalmitate and ascorbic acid (n=6)

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一ZDP 供試品溶液，分裝在6 個(gè)液相小瓶中，分別于0、2、4、8、12、24、48、72 h 精密吸取供試品溶液10 μL 注入液相色譜儀，記錄ZDP 的峰面積，0～24 h 內(nèi)ZDP 峰面積RSD 為1.06%，結(jié)果表明樣品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。ZDP 在48 h 后開始出現(xiàn)小范圍的降解，72 h 后降解程度達(dá)6.92%。因此，ZDP 供試品前處理結(jié)束后宜在24 h 內(nèi)盡快檢測(cè)。

取同一枸杞酸供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24、48、72 h 精密吸取2 μL 注入液相色譜儀，記錄枸杞酸的峰面積，0～72 h 內(nèi)枸杞酸峰面積RSD 為1.956%，表明樣品在72 h 內(nèi)穩(wěn)定（見表3）。

表3 ZDP 供試樣品及枸杞酸供試樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Stability test results of ZDP and ascorbic acid

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次枸杞子粉末（批號(hào)：20190908）6 份，按照“1.2.1.2”項(xiàng)下制備供試品溶液依法測(cè)定，結(jié)果見表計(jì)算ZDP 含量的RSD 為1.88%，表明該方法的重復(fù)性良好。結(jié)果如表3。

取同一批次枸杞子粉末（批號(hào)：20190908）6 份，按照“1.2.1.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，依法測(cè)定，計(jì)算枸杞酸含量的RSD 為1.82%，表明方法的重復(fù)性良好（見表4）。

2.5 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取ZDP 含量已知的枸杞子粉末樣品（批號(hào)：20190908），共9 份，加入適量的ZDP 對(duì)照品，按照“1.2.1.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，依法測(cè)定，并計(jì)算回收率，結(jié)果如表5。RSD 小于5%，表明ZDP 檢測(cè)方法有良好的回收率。

精密稱取已知枸杞酸含量的枸杞子粉末樣品（批號(hào)：20190908），共9 份，分別添加適量的枸杞酸對(duì)照品，按照“1.2.1.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，依法測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果如表6。RSD 小于5%，表明枸杞酸檢測(cè)方法有良好的回收率。

2.6 樣品測(cè)定

按建立的方法，對(duì)22 批枸杞子樣品進(jìn)行ZDP及枸杞酸含量的測(cè)定，結(jié)果見表7。ZDP 對(duì)照品及ZDP 供試品溶液高效液相色譜圖譜見圖2。枸杞酸對(duì)照品及枸杞酸供試品溶液超高效液相色譜圖見圖3。

本文對(duì)不同產(chǎn)地不同年份的22 批次枸杞子樣品進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，ZDP 與枸杞酸穩(wěn)定存在各批次樣品中，ZDP 含量在0.14%～0.51%之間，枸杞酸含量在0.45%～1.33%之間。不同地區(qū)枸杞子中的ZDP 并沒有明顯的差異性（見圖4）。寧夏枸杞子中的枸杞酸相比較青海枸杞子含量更高，且存在顯著性差異（P<0.05），但與甘肅枸杞子并無顯著性差異（見圖5）。

3 討論與結(jié)論

本研究分別采用HPLC 及UPLC 檢測(cè)枸杞子脂溶性活性成分ZDP 及水溶性活性成分枸杞酸含量。ZDP 極性小且對(duì)光熱較為敏感，所以用“正己烷-丙酮”提取，實(shí)驗(yàn)全程低溫避光穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)ZDP 在48 h 后開始出現(xiàn)小范圍的降解，72 h 后降解明顯。因此，ZDP 供試品前處理結(jié)束后宜在24 h 內(nèi)盡快檢測(cè)。本文的檢測(cè)結(jié)果與白光燦[26]的結(jié)果相差近10 倍，但與陳敏等[28]報(bào)道結(jié)果接近。枸杞酸極性大且穩(wěn)定性非常好，所以用水超聲提取。平行測(cè)定6 次，ZDP 及枸杞酸的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為1.88%、1.82%，加樣回收率分別在92.48%～104.31%，90.345%～100.743%。表明2 種方法均重現(xiàn)性良好、準(zhǔn)確可行。

表4 供試樣品中ZDP 含量及枸杞酸含量的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Repeatability test results of ZDP and ascorbic acid content

表5 玉米黃素雙棕櫚酸酯加樣回收試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of recovery tests for ZDP

表6 枸杞酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results of recovery tests for ascorbic acid

表7 枸杞中玉米黃素雙棕櫚酸酯及枸杞酸的含量測(cè)定結(jié)果Table 7 Results of content assay for ZDP and ascorbic acid in fruits of Lycium barbarum L.

圖2 玉米黃素雙棕櫚酸酯（A）和供試品（B）溶液高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of zeaxanthin dipalmitate (A) and test substance (B) solution

圖3 枸杞酸（A）和供試品（B）溶液超高效液相色譜圖Fig.3 UPLC chromatograms of Lycium barbarum acid (A) and test substance (B) solution

圖4 玉米黃素雙棕櫚酸酯（ZDP）在不同產(chǎn)地枸杞子中的分布Fig.4 Distribution of ZDP in Lycium barbarum L.from different areas

圖5 枸杞酸在不同產(chǎn)地枸杞子中的分布Fig.5 Distribution of AA2βG in Lycium barbarum L.from different areas

本文對(duì)不同產(chǎn)地不同年份的22 批次枸杞子樣品進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，ZDP 與枸杞酸穩(wěn)定存在各批次樣品中，ZDP 含量在0.14%～0.51%之間，枸杞酸含量在0.45%～1.33%之間。該方法操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)結(jié)果能夠較好地反映枸杞子的品質(zhì)，為枸杞子樣品的品質(zhì)評(píng)價(jià)提供參考。

盡管本文對(duì)ZDP 的方法進(jìn)行了改進(jìn)，但提取及液相分析時(shí)間仍然很長(zhǎng)。后期可進(jìn)一步簡(jiǎn)化提取步驟，并采用超合相色譜進(jìn)行分析。超合相色譜在分析極強(qiáng)的親脂性化合物時(shí)可得到與反相LC 類似的保留特征，且流動(dòng)相換為超臨界或亞臨界狀態(tài)的壓縮CO2，減少正相流動(dòng)相中有害溶劑的使用。