綠原酸對(duì)肉兔生長(zhǎng)性能、空腸結(jié)構(gòu)與抗氧化的影響

劉靜慧，李 沖，徐美利，牛志平，劉亞娟，陳寶江*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北保定 071000；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京 100081；3.晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司，河北邯鄲 057250；4.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)山區(qū)研究所，河北保定 071001；5.河北省山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，河北保定 071001）

中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第194 號(hào)文件宣告，退出除中藥外的所有促生長(zhǎng)類藥物飼料添加劑品種，飼料生產(chǎn)企業(yè)停止生產(chǎn)含有促生長(zhǎng)類藥物飼料添加劑的商品飼料?？股靥娲罚绕涫侵参锾崛∥锍蔀檠芯繜狳c(diǎn)。綠原酸（Chlorogenic Acid）是由咖啡酸（Caffeic Acid）與奎尼酸（Quinic Acid）生成的縮酚酸，是植物有氧呼吸過程中經(jīng)莽草酸途徑產(chǎn)生的一種苯丙素類化合物，其廣泛存在于多種植物中，在金銀花、杜仲中含量較高。綠原酸具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、保肝利膽、抗腫瘤等多種生物活性[1]，在動(dòng)物生產(chǎn)中有一定應(yīng)用。賴星等[2]報(bào)道，綠原酸和橙皮苷能顯著提高仔豬的生長(zhǎng)性能，其中綠原酸具有抗菌、抗炎和抗氧化作用，并能參與維持腸道微生物多樣性。李乃順等[3]報(bào)道，在草魚飼糧中添加綠原酸能顯著提高草魚的生長(zhǎng)性能和非特異性免疫功能，改善草魚的肌肉品質(zhì)。綠原酸在兔生產(chǎn)中的研究報(bào)道較少，因此，本試驗(yàn)旨在研究不同水平綠原酸對(duì)伊拉肉兔生長(zhǎng)性能、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率、腸道結(jié)構(gòu)形態(tài)及其抗氧化性能的影響，為其在兔生產(chǎn)中的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 綠原酸（有效含量≥80%）由晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司提供，由甜葉菊提取，有效成分為3,5-二咖啡?；G原酸和4,5-二咖啡?；G原酸。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)日糧 選擇35 日齡的斷奶伊拉兔72 只，體重（950±25）g，公、母各半，隨機(jī)分為6 個(gè)處理組，每組12 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1 只。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，抗生素組在基礎(chǔ)飼糧中添加18.80 mg/kg 桿菌肽鋅和15.51 mg/kg 喹烯酮，綠原酸組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加500、1 000、2 000、3 000 mg/kg 綠原酸。基礎(chǔ)飼糧參照谷子林[4]推薦的兔營(yíng)養(yǎng)需要進(jìn)行配制，飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.3 飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧教學(xué)基地進(jìn)行，試驗(yàn)前對(duì)兔舍和籠具進(jìn)行清理和消毒，采用育成兔三層階梯式金屬籠單獨(dú)飼養(yǎng)，對(duì)每只兔籠進(jìn)行單獨(dú)編號(hào)，自然通風(fēng)和光照，試驗(yàn)期間平均溫度23℃，平均濕度55%，自由采食和飲水，每天08:00 和18:00 進(jìn)行飼喂，投料后2 h 后對(duì)兔舍進(jìn)行糞便清理、衛(wèi)生清掃。預(yù)試期7 d，正試期28 d。

1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.4.1 生產(chǎn)性能 正式試驗(yàn)開始后，稱量各組試驗(yàn)兔的體重獲得初始重，于第28 天稱量記錄試驗(yàn)?zāi)┲?，根?jù)試驗(yàn)天數(shù)計(jì)算平均日增重，統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)期間試驗(yàn)兔的采食量，計(jì)算平均日采食量和耗料增重比。

統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)期間試驗(yàn)兔的腹瀉情況，計(jì)算獲得腹瀉頻率，公式：

腹瀉頻率=［試驗(yàn)期內(nèi)腹瀉只日數(shù)/（試驗(yàn)天數(shù)×試驗(yàn)只數(shù)）］×100%

1.4.2 消化試驗(yàn) 飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，將試驗(yàn)兔于消化代謝籠內(nèi)單籠飼養(yǎng)，每天飼喂2 次，自由采食和飲水。根據(jù)家兔消化試驗(yàn)規(guī)程操作，采用全收糞法進(jìn)行消化試驗(yàn)，每天10:00 收集濾網(wǎng)上的全部新鮮糞便，清除糞球上的兔毛后稱重，將新鮮糞便分成2 份，一份用10% 鹽酸溶液固定揮發(fā)性氮，用于粗蛋白質(zhì)測(cè)定；剩余部分不做處理，用于其他常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定。將每天收集的糞便放入-20℃儲(chǔ)存，連續(xù)收集7 d。把同一兔子7 d 的糞便充分混勻，放入65～70℃烘箱內(nèi)烘48 h，取出后回潮24 h。烘干后的糞便粉碎、過篩、待測(cè)。

分別測(cè)定飼糧和糞便樣品中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量。計(jì)算表觀消化率：

某營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化率=（食入某營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)量－對(duì)應(yīng)糞中某營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)量）/食入某營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)量×100%

1.4.3 空腸抗氧化性能 正試期結(jié)束后，每組挑選接近平均體重的6 只試驗(yàn)兔屠宰，迅速找到并剪取所需腸段，用冷生理鹽水輕輕沖洗掉其內(nèi)容物后置于冰臺(tái)上，在鑷子的輔助下用剪刀剪開小腸，暴露出腸黏膜，用吸水紙輕輕拭干小腸內(nèi)部，利用玻片刮取小腸黏膜置于凍存管中，-80℃保存。取出黏膜，研磨后按1:9 比例與PBS緩沖液混勻，4 000 r/min 離心10 min，分裝上清，于-80℃保存待測(cè)，采用生化法測(cè)定超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、總抗氧化能力（Total Antioxidant Capacity，T-AOC）和丙二醛（Malondialdehyde，MDA）的活性和水平，試劑盒購(gòu)自北京百智生物科技有限公司，貨號(hào)分別為BCEA002、BCBU-011、BCOS-009，具體操作按說明書指示進(jìn)行。

1.4.4 空腸結(jié)構(gòu) 取試驗(yàn)兔空腸放于10% 福爾馬林固定，HE 染色制作石蠟切片，在光鏡下觀察腸黏膜結(jié)構(gòu)，使用Moditec 照相處理軟件和和病理分析圖像系統(tǒng)測(cè)量各試驗(yàn)兔腸段的腸絨毛高度、隱窩深度，并計(jì)算腸絨毛高度與隱窩深度比。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan's 法進(jìn)行多重比較，以P＜0.05 為差異顯著，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 綠原酸對(duì)肉兔生長(zhǎng)性能的影響 由表2 可知，對(duì)照組和抗生素組各指標(biāo)差異不顯著。與對(duì)照組和抗生素組相比，2 000 mg/kg 綠原酸組肉兔的末重分別升高了9.90%、9.82%（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，2 000 mg/kg綠原酸組肉兔的平均日增重升高了18.73%（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，2 000 mg/kg 綠原酸組肉兔的耗料增重比降低了7.84%（P＞0.05），與抗生素組相比，2 000 mg/kg綠原酸組肉兔的耗料增重比降低了6.74%（P＞0.05）。對(duì)照組腹瀉率最高，綠原酸組其次，抗生素組最低。

表2 綠原酸對(duì)肉兔生長(zhǎng)性能的影響

2.2 綠原酸對(duì)飼料主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化率的影響 由表3 可知，與對(duì)照組和抗生素組相比，2 000 mg/kg綠原酸組 粗脂肪的消化率分別升高了2.07%和7.71%，（P＞0.05），與500 mg/kg 綠原酸組和3 000 mg/kg 綠原酸組相比，2 000 mg/kg 綠原酸組粗脂肪的消化率分別升高了11.18% 和11.08%（P＜0.05）。與對(duì)照組及抗生素組相比，2 000 mg/kg 綠原酸組鈣的消化率分別提高了7.41% 和8.47%（P＞0.05）。與3 000 mg/kg 綠原酸組相比，2 000 mg/kg 綠原酸組鈣的消化率升高了12.27%（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，2 000 mg/kg 綠原酸組磷的消化率升高了13.92%（P＞0.05），與抗生素組相比，2 000 mg/kg 綠原酸組磷的消化率降低了6.54%（P＞0.05），與抗生素組相比，3 000 mg/kg 綠原酸組磷的消化率降低了30.16%（P＜0.05）。

表3 綠原酸對(duì)肉兔飼料主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響 %

2.3 綠原酸對(duì)肉兔空腸抗氧化性能的影響 由表4 可知，與對(duì)照組相比，綠原酸組和抗生素組肉兔空腸黏膜T-AOC、SOD 活性及MDA 水平均無顯著差異。

表4 綠原酸對(duì)肉兔空腸抗氧化指標(biāo)的影響

2.4 綠原酸對(duì)肉兔空腸結(jié)構(gòu)的影響 由圖1 可知，添加綠原酸可以改善肉兔的腸道結(jié)構(gòu)形態(tài)，使空腸絨毛高度增加，隱窩深度變淺。由表5 可知，與對(duì)照組相比，綠原酸組肉兔空腸的絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度分別升高了8.43%、11.10%、11.5%、2.80%以及18.31%、14.85%、18.31%、0.99%（P＜0.05）。綠原酸組肉兔空腸結(jié)構(gòu)形態(tài)的改善效果優(yōu)于抗生素組。

表5 綠原酸對(duì)肉兔空腸結(jié)構(gòu)的影響

圖1 綠原酸對(duì)肉兔空腸絨毛結(jié)構(gòu)的影響

3 討 論

3.1 綠原酸對(duì)肉兔生長(zhǎng)性能的影響 飼糧中添加綠原酸可以改善動(dòng)物的生長(zhǎng)性能。劉則學(xué)等[5]報(bào)道，在仔豬飼糧中添加250 g/t 綠原酸使耗料增重比顯著降低，腹瀉頻率有降低趨勢(shì)，改善了仔豬的生長(zhǎng)性能。Chen 等[6]發(fā)現(xiàn)在斷奶仔豬飼糧中添加1 000 mg/kg 綠原酸可顯著提高飼料轉(zhuǎn)化率。陳鵬等[7]發(fā)現(xiàn)在斷奶仔豬飼糧中添加綠原酸可顯著提高仔豬平均日增重，改善生長(zhǎng)性能。本試驗(yàn)中，與對(duì)照組和抗生素組相比，2 000 mg/kg 綠原酸組肉兔末重和平均日增重顯著升高，可能是添加綠原酸改善了肉兔空腸的結(jié)構(gòu)形態(tài)，使腸絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度值均顯著升高，提高了肉兔對(duì)養(yǎng)分的消化吸收能力，且2 000 mg/kg 綠原酸組對(duì)總能、粗蛋白質(zhì)、粗纖維等營(yíng)養(yǎng)素的消化率均有升高趨勢(shì)，從而提高了肉兔的生長(zhǎng)性能。同時(shí)，綠原酸還具有抗菌、消炎以及增強(qiáng)免疫力等作用，對(duì)肉兔具有益生作用[8]。

3.2 綠原酸對(duì)肉兔營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率的影響 飼料表觀消化率在一定程度上可反映動(dòng)物對(duì)飼料養(yǎng)分的利用情況。王多伽[9]研究發(fā)現(xiàn)，吉戎兔飼糧中添加0.03%～0.27%綠原酸對(duì)粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗纖維、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維消化率均顯著提高。陳鵬等[10]報(bào)道，杜仲提取物中綠原酸含量大于5%，添加后可以提高斷奶仔豬對(duì)干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、總能的消化率。其可能原因是，添加綠原酸增強(qiáng)了消化酶的分泌能力，改善了腸道的結(jié)構(gòu)形態(tài)，從而促進(jìn)對(duì)營(yíng)養(yǎng)素的吸收效率[11]。本試驗(yàn)中各組肉兔對(duì)各營(yíng)養(yǎng)素的消化率差異并不顯著，可能與動(dòng)物畜種與機(jī)體的生理特點(diǎn)和消化機(jī)制有關(guān)。

3.3 綠原酸對(duì)肉兔空腸抗氧化性能的影響 腸道是動(dòng)物主要的消化吸收器官，其有著自己的抗氧化系統(tǒng)，過程中有自由基的產(chǎn)生，過量的自由基與較低的抗氧化酶活性打破了氧化還原狀態(tài)的平衡，損傷腸道。Chen 等[12]研究表明，飼喂1 000 mg/kg 綠原酸可顯著提高斷奶仔豬十二指腸和空腸谷胱甘肽過氧化酶、過氧化氫酶活性，降低空腸和回腸MDA 活性。周艷[13]研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠飼糧中添加60 mg/kg 綠原酸能顯著提高慢性內(nèi)毒素應(yīng)激大鼠回腸組織SOD 活性和T-AOC，降低組織和線粒體MDA 含量。其原因可能是綠原酸在代謝過程中伴隨著新的酚酸產(chǎn)生，有良好的抗氧化能力，使腸道系統(tǒng)的抗氧化系統(tǒng)發(fā)生變化[14]。綠原酸具有特殊的分子結(jié)構(gòu)，可以通過捐贈(zèng)氫原子減少自由基，抑制氧化反應(yīng)。也可能是綠原酸可抑制TLR4/NF-κB 信號(hào)通路并激活Nrf2/HO-1 信號(hào)通路，增強(qiáng)抗氧化酶活性[15]。本試驗(yàn)中，各組空腸抗氧化性能差異并不顯著，可能是試驗(yàn)兔在屠宰時(shí)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，胃腸道黏液分泌不足。

3.4 綠原酸對(duì)肉兔空腸結(jié)構(gòu)的影響 Zhang 等[16]報(bào)道，在仔豬飼糧中添加綠原酸，可以使其十二指腸絨毛高度及絨毛高度/隱窩深度值均升高，隱窩深度顯著降低，也可以使空腸絨毛高度升高。Chen 等[17]發(fā)現(xiàn)，在仔豬飼糧中添加1 000 mg/kg 綠原酸可顯著提高絨毛高度和絨毛高度/ 隱窩深度值。黃芳等[18]報(bào)道，綠原酸可以緩解鎘導(dǎo)致的大鼠腸道黏膜損傷，使絨毛高度增大隱窩深度變淺。本試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，抗生素組和綠原酸組的絨毛高度和絨毛高度/隱窩深度值均顯著增高，說明綠原酸可以改善肉兔空腸的結(jié)構(gòu)形態(tài)，增加空腸對(duì)營(yíng)養(yǎng)的吸收面積。其可能的原因是綠原酸能降低生長(zhǎng)過程的氧化應(yīng)激水平，絨毛長(zhǎng)度增加，保護(hù)腸道形態(tài)，抵御細(xì)菌侵入。也可能增加腸道緊密連接蛋白的表達(dá)，改變腸道的通透性，維持腸道微生物群落的多樣性及微生態(tài)平衡[19]。綠原酸的多種生物學(xué)功能減少了各種應(yīng)激、致病菌、病毒對(duì)腸道的影響，有益于腸道發(fā)育。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)中，添加綠原酸可改善肉兔的空腸結(jié)構(gòu)形態(tài)，改善肉兔的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率來提高肉兔的生長(zhǎng)性能，推薦綠原酸添加量為2 000 mg/kg。