狂犬病病毒滴度直接免疫熒光檢測法的建立及驗證

劉宏偉，田玉玲，朱琨瑩，張巖，楊帆，劉銀星，石亮，閆昆明

1.長春百克生物科技股份公司,吉林長春130012；2.長春市兒童醫(yī)院,吉林長春130000；3.吉林大學(xué)第一醫(yī)院艾滋病與病毒研究所,吉林長春130021

狂犬病是由狂犬病病毒感染導(dǎo)致的以侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)為主的急性人獸共患傳染?。?］,多見于犬、狼、貓等動物,人類多由于被患病動物咬傷而感染,一旦發(fā)病,死亡率幾乎100%。目前,接種疫苗是有效預(yù)防狂犬病的主要手段之一,人用狂犬病疫苗是將狂犬病病毒經(jīng)滅活后制備而成［2-3］。糖蛋白刺突是位于狂犬病毒表面的保護性抗原,也是唯一能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體的蛋白［4-5］,因此病毒含量決定了保護性抗原的含量,與疫苗質(zhì)量密切相關(guān)。

病毒滴度可反映疫苗中的病毒含量,是狂犬病疫苗生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵質(zhì)量控制參數(shù)。病毒滴度的傳統(tǒng)檢測方法為小鼠腦內(nèi)滴定法,該方法對檢測人員熟練程度要求較高,動物狀態(tài)也會影響檢測結(jié)果,導(dǎo)致結(jié)果不穩(wěn)定,重復(fù)性差,且耗時較長(14 d)［6-7］。直接免疫熒光技術(shù)是利用熒光素標(biāo)記的已知抗體,與細(xì)胞中狂犬病病毒特異性結(jié)合,經(jīng)紫外光激發(fā)可產(chǎn)生熒光,以檢測狂犬病病毒含量［8］,該方法避免了小鼠腦內(nèi)滴定法的諸多缺點。因此,本研究采用MRC-5 細(xì)胞建立狂犬病病毒滴度的直接免疫熒光檢測法,以期應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制。

1 材料與方法

1.1 病毒及細(xì)胞 20 批狂犬病病毒Pitman-Moore株(PM 株)病毒液和MRC-5 細(xì)胞均由長春百克生物科技股份公司藥物研究院提供。

1.2 主要試劑 MEM 培養(yǎng)基購自美國HyCLone 公司；新生牛血清購自蘭州民海生物工程有限公司；胰酶購自美國Gibco 公司；FITC 標(biāo)記的抗狂犬病病毒特異性抗體購自美國Millipore 公司。

1.3 實驗動物 SPF 級 ICR 小鼠,雌性,2 ～ 3 周齡,體重11 ～13 g,購自長春億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司,動物合格證號:201900030820。

1.4 方法的建立 將病毒液進行5 倍系列稀釋(5-1～5-12),加入 96 孔板,200 μL ／ 孔,每個稀釋度設(shè) 2 個復(fù)孔,再加入 1 × 106個 ／mL 的 MRC-5 細(xì)胞,50 μL ／孔,于 37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 ～ 30 h；棄培養(yǎng)液,PBS 洗滌 1 次,加入 80%冷丙酮,100 μL ／ 孔,4 ℃固定30 min；棄丙酮,室溫放置待丙酮揮發(fā)后,加入FITC 標(biāo)記的抗狂犬病病毒特異性抗體(1 ∶200 稀釋),50 μL ／ 孔,37 ℃孵育 2 h；PBS 洗滌 3 次,加入80%甘油,50 μL ／ 孔,倒置熒光顯微鏡下觀察,取每孔熒光灶數(shù) ＜30 的孔,記錄相鄰4 孔熒光灶數(shù),取平均值,并按下式計算病毒滴度,取其對數(shù)。

病毒滴度(FFU／mL)=(最高稀釋倍數(shù)孔熒光灶平均值×5+相鄰孔稀釋倍數(shù)較低的熒光灶平均值)／ 2 × 稀釋倍數(shù)較低孔病毒稀釋倍數(shù)× 5

1.5 方法的驗證

1.5.1 重復(fù)性 取同1 批PM 株病毒液,由同1 名檢測者于不同時間點檢測3 次,每個時間點重復(fù)檢測6 次,計算平均值()、標(biāo)準(zhǔn)差(SD)及變異系數(shù)(CV)。

1.5.2 中間精密度 取3 批PM 株病毒液,由2 名檢測者(A 和B)于不同時間檢測,每次重復(fù)3 次,計算、SD 和 CV。

1.5.3 線性范圍 取1 份PM 株病毒液,進行5 倍系列稀釋(50～5-7),分別測定病毒滴度。以病毒稀釋度為橫坐標(biāo),病毒滴度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 與其他方法的比較 取20 批PM 株病毒液,用含2%新生牛血清的PBS 進行10 倍系列稀釋(10-3～10-8),經(jīng)腦內(nèi)接種小鼠,0.03 mL ／ 只,每個稀釋度6只。逐日觀察,3 d 內(nèi)死亡者不計(動物死亡數(shù)量應(yīng)不超過試驗動物總數(shù)的20%),連續(xù)觀察14 d,記錄死亡情況,并按下式計算病毒滴度(LgLD50)。同時應(yīng)用建立的直接免疫熒光法進行檢測。以LgFFU 為橫坐標(biāo),LgLD50為縱坐標(biāo),進行線性回歸,分析兩者間的相關(guān)性。

距離比 =(高于50%的死亡率 - 50%)／(高于50%的死亡率- 低于50%的死亡率)；

病毒滴度 = Lg 高于50%死亡率的稀釋度 + 距離比 ×Lg 稀釋倍數(shù) + Lg1 ／ 0.03

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用IBM SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,GraphPad Prism 6 軟件作圖,計量資料采用進行集中趨勢統(tǒng)計描述,SD、CV 進行離散趨勢統(tǒng)計描述。兩種檢測方法檢測結(jié)果的比較分析應(yīng)用R-Square 描述回歸模型,采用方差分析檢驗回歸模型的統(tǒng)計學(xué)意義,t 檢驗分析判斷回歸模型中自變量系數(shù)的統(tǒng)計學(xué)意義。所有統(tǒng)計學(xué)檢驗均為雙側(cè)檢驗,檢驗水準(zhǔn)α = 0.05,以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 方法的驗證結(jié)果

2.1.1 重復(fù)性 各時間點6 次重復(fù)檢測的CV 均＜2%,見表1。表明該方法具有良好的重復(fù)性。

表1 重復(fù)性驗證結(jié)果(LgFFU,,n = 6)Tab.1 Verification for reproducibility(LgFFU,,n = 6)

表1 重復(fù)性驗證結(jié)果(LgFFU,,n = 6)Tab.1 Verification for reproducibility(LgFFU,,n = 6)

試驗次數(shù) 病毒滴度 SD CV(%)1 6.62 0.03 0.45 2 6.63 0.12 1.81 3 6.65 0.08 1.20 x 6.63 0.07 1.16

2.1.2 中間精密度 2 名檢測者于不同時間點3 次重復(fù)檢測的CV 均 ＜2%,見表2。表明該檢測方法具有良好的中間精密度。

2.1.3 線性范圍 狂犬病病毒滴度直接免疫熒光檢測法的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。病毒稀釋倍數(shù)在50～5-7范圍內(nèi),與病毒滴度呈良好的線性關(guān)系,線性回歸方程為Y=-0.739 2 X+8.031,R2=0.986 6。

表2 中間精密度的驗證結(jié)果(LgFFU,,n=3)Tab.2 Verification for intermediate precision(LgFFU,,n=3)

表2 中間精密度的驗證結(jié)果(LgFFU,,n=3)Tab.2 Verification for intermediate precision(LgFFU,,n=3)

檢測者 檢測次數(shù) 病毒滴度 SD CV(%)A 1 4.525 0.082 1.81 2 6.678 0.096 1.44 3 7.075 0.126 1.78 B 1 4.468 0.079 1.77 2 6.572 0.089 1.35 3 7.106 0.132 1.86

圖1 狂犬病病毒滴度直接免疫熒光檢測法的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve for determination of rabies virus titer by direct IFA

2.2 與其他方法的比較 20 批PM 株病毒液兩種方法的檢測結(jié)果趨勢相同,回歸方程為Y=-0.642+1.088 X,R-Square=0.905,表明兩種方法具有良好的相關(guān)性,且自變量對回歸模型有顯著意義(t=13.071,P ＜0.001),回歸關(guān)系具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=170.863,P ＜ 0.001)。見表 3 和圖 2。

表3 兩種方法的檢測結(jié)果Tab.3 The determination results of two mothods

圖2 兩種方法檢測結(jié)果的相關(guān)性Fig.2 Correlation of determination results by two methods

3 討 論

狂犬病病毒自暴露傷口后,潛伏期一般為1 ～3個月,少數(shù)患者可長至1 年以上,發(fā)病時可出現(xiàn)狂躁、怕風(fēng)、怕水、怕光等臨床癥狀,目前尚無有效治療手段,及時接種狂犬病疫苗和免疫球蛋白可有效預(yù)防狂犬?。?］。病毒滴度是評價疫苗質(zhì)量的重要指標(biāo)?！吨袊幍洹啡?2020 版)［10］中規(guī)定,狂犬病病毒滴度檢測可采用小鼠腦內(nèi)滴定法或細(xì)胞培養(yǎng)法。小鼠腦內(nèi)滴定法的原理是狂犬病病毒能夠在小鼠腦內(nèi)大量增殖并在一定時間內(nèi)導(dǎo)致小鼠死亡,根據(jù)小鼠死亡情況,計算病毒滴度(LgLD50)。該方法檢測結(jié)果的影響因素較多,因此,尋找快速、穩(wěn)定、準(zhǔn)確的檢測方法顯得尤為重要。本實驗采用MRC-5 細(xì)胞建立了狂犬病病毒滴度的直接免疫熒光檢測法,各時間點6 次重復(fù)檢測結(jié)果的CV 均＜2%,表明該方法具有良好的重復(fù)性；于不同時間點3 次重復(fù)檢測結(jié)果的CV 均＜2%,表明該檢測方法具有良好的中間精密度；PM株病毒稀釋倍數(shù)在50～5-7范圍內(nèi),與病毒滴度呈良好的線性關(guān)系,線性回歸方程為Y = -0.739 2 X +8.031,R2= 0.986 6。

本實驗采用直接免疫熒光法和小鼠腦內(nèi)滴定法同時檢測20 批PM 株病毒液,兩種方法檢測結(jié)果趨勢相同,回歸方程為Y=-0.642 + 1.088 X,R-Square =0.905,表明兩種方法具有良好的相關(guān)性。與小鼠腦內(nèi)滴定法比較,直接免疫熒光法還具有檢測周期短、重復(fù)性好、操作簡便等優(yōu)勢,且可1 次檢測大量樣品,提高檢測效率［11］。

目前,世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)和世界動物衛(wèi)生組織(Office International Des Epizooties,OIE)推薦采用直接免疫熒光試驗作為檢測狂犬病病毒滴度的標(biāo)準(zhǔn)方法,國際上已將該方法廣泛應(yīng)用于狂犬病病毒滴度的檢測［12］,國內(nèi)也開始逐步采用該方法檢測病毒滴度［13］。另外,從動物試驗的減少、細(xì)化和替換角度出發(fā),開發(fā)和引入無動物替代試驗十分必要［14］。在狂犬病疫苗生產(chǎn)過程中采用直接免疫熒光法檢測病毒滴定進行質(zhì)量監(jiān)控,有利于提高疫苗的生產(chǎn)效率及降低生產(chǎn)成本［15］。