第1 代Sabin 株脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗D 抗原含量國際標(biāo)準(zhǔn)品的國際協(xié)作標(biāo)定

江征，朱文慧，宋彥麗，劉婷，張雪子，英志芳，王劍鋒，李長貴

中國食品藥品檢定研究院,北京102629

全球根除脊髓灰質(zhì)炎(簡稱脊灰)認(rèn)證委員會(Global Commission for The Certification of Poliomyelitis,GCC)于2015 年9 月20 日宣布全球已根除Ⅱ型野生脊灰病毒(wild polio virus typeⅡ,WPVⅡ)。2016 年,口服脊灰減毒活疫苗(oral poliomyelitis vaccine,OPV)中去除了Ⅱ型成分,由三價OPV(trivalent OPV,tOPV)轉(zhuǎn)換為二價OPV(bivalent OPV,bOPV),目的是消除OPVⅡ型衍生病毒導(dǎo)致的相關(guān)病例。同時在計劃免疫程序要求引入至少一劑脊灰滅活疫苗(inactivated poliomyelitis vaccine,IPV),以維持兒童對Ⅱ型脊灰病毒的免疫力。隨著根除脊灰的進(jìn)展,實(shí)驗(yàn)室暫存和使用野生脊灰病毒將受到嚴(yán)格控制,因此,采用Sabin 減毒株生產(chǎn)脊灰滅活疫苗更安全。目前,對IPV 的需求不斷增加,許多制造商正在或計劃生產(chǎn)sIPV,且已有sIPV 在中國和日本上市使用［1-3］。

IPV 的效力在體外采用經(jīng)驗(yàn)證的ELISA 法及合適的參考物質(zhì)進(jìn)行測定,以D 抗原單位(DU)表示。目前,制造商和質(zhì)控實(shí)驗(yàn)室將WHO 以野毒株生產(chǎn)的第3 代傳統(tǒng)脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗(conventional inactivated poliomyelitis vaccine,cIPV)國際標(biāo)準(zhǔn)品(international standard,IS)12 ／ 104 用于校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室參考品,來檢測WPV IPV 產(chǎn)品中的D 抗原含量和體內(nèi)大鼠效力評價［4］。在缺乏具體的sIPV 參考標(biāo)準(zhǔn)和明確規(guī)定劑量要求的情況下,sIPV 產(chǎn)品抗原標(biāo)識含量差異較大。隨著sIPV 生產(chǎn)和需求不斷增長,建立適用于sIPV 抗原含量檢測的國際標(biāo)準(zhǔn)品尤為重要,以實(shí)現(xiàn)sIPV 產(chǎn)品的全球標(biāo)準(zhǔn)化。2015 — 2016年的一項(xiàng)國際合作研究發(fā)現(xiàn),IPV 國際標(biāo)準(zhǔn)品12 ／104 作為參考來測量sIPV 產(chǎn)品的效價時,無效試驗(yàn)的比例較高,且實(shí)驗(yàn)室結(jié)果間差異較大；當(dāng)以sIPV樣品作為參考來確定sIPV 研究樣本的效力時,試驗(yàn)有效性和實(shí)驗(yàn)室間的一致性得到了改善［5］,因此WHO 決定建立專門針對sIPV 產(chǎn)品的新國際標(biāo)準(zhǔn)品。2017—2018 年,WHO 和NIBSC 組織開展了第1 代sIPV D 抗原含量國際標(biāo)準(zhǔn)品的協(xié)作研究,中國食品藥品檢定研究院(簡稱中檢院)呼吸道病毒疫苗室受邀參加此次協(xié)作標(biāo)定,現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 樣品 sIPV 候選標(biāo)準(zhǔn)品 17 ／ 130(復(fù)樣,編號為17002 和 17005)和 17 ／ 160(復(fù)樣,編號為 17004 和17007)分別為已批準(zhǔn)上市的制造商提供的商業(yè)生產(chǎn)規(guī)模的濃縮三價sIPV 原液,由NIBSC 分裝為0.5 mL ／安瓿(未添加任何成分),分裝過程隨機(jī)抽樣進(jìn)行裝量和無菌檢查,均符合規(guī)定；監(jiān)測樣品17 ／ 134(編號為 17001)來源與 17 ／ 160 相同,由 NIBSC 稀釋制成疫苗劑量樣品；樣品17 ／ 131(編號為17003)為不同于sIPV 候選標(biāo)準(zhǔn)品的第三家生產(chǎn)廠家提供疫苗原液,由NIBSC 手動無菌分裝；樣品17 ／ 161(編號為17006)由與候選標(biāo)準(zhǔn)品17 ／ 130 相同制造商生產(chǎn)的原液制備的國家參考品,在NIBSC 匯集后重新分裝；cIPV IS 12 ／ 104 的Ⅰ型、Ⅱ型及Ⅲ型標(biāo)識效價分別為 277、65 和 248 DU ／ mL；cIPV IS 的替代參考制劑08／143 的Ⅰ型、Ⅱ型及Ⅲ型標(biāo)識效價分別為381、82 和288 DU ／ mL。所有樣品干冰運(yùn)輸至各參加協(xié)作標(biāo)定單位,于-70 ℃保存。

1.2 主要試劑及儀器 BD-Difco?脫脂奶粉(貨號:232100)購自BD 美國公司；Sigma?牛血清白蛋白(貨號:HZB0148)購自美國Sigma 公司；Tween 20(貨號:85113)、GibcoTM磷酸鹽緩沖液PBS(pH 7.4,貨號:10010031)、CorningCostar?96 孔酶標(biāo)板和 ThermoMultiskan Ascent 酶標(biāo)儀均購自美國ThermoFisher 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計 選擇歐洲、美洲和亞洲共13 家單位(7 家制造商實(shí)驗(yàn)室和6 家國家質(zhì)控實(shí)驗(yàn)室,大部分單位參加過2015—2016 年NIBSC 組織的sIPV疫苗D 抗原效力檢測標(biāo)準(zhǔn)化第一次國際協(xié)作研究)進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定。要求各單位分別采用統(tǒng)一方法和自建方法對編號 17001 ～ 17007 的 sIPV 樣品和 12 ／104、08 ／ 143 進(jìn)行 ELISA 試驗(yàn),NIBSC 提供統(tǒng)一方法的標(biāo)準(zhǔn)操作程序和各檢測樣品的推薦稀釋度。每個血清型進(jìn)行3 次獨(dú)立檢測,每次試驗(yàn)包含所有的樣品,并使用新打開的安瓿制劑。以12 ／ 104 及兩種候選標(biāo)準(zhǔn)品為參考標(biāo)準(zhǔn)計算樣品的D 抗原含量。每次檢測原始數(shù)據(jù)、效力計算結(jié)果和試驗(yàn)有效性統(tǒng)計標(biāo)準(zhǔn)按要求統(tǒng)一報告給NIBSC 進(jìn)行匯總統(tǒng)計分析。

1.4 統(tǒng)一方法 所用試劑均由NIBSC 統(tǒng)一提供,并按NIBSC 推薦配制方案自行配備,試驗(yàn)過程按照NIBSC提供的SOP 進(jìn)行操作。用碳酸鹽緩沖液包被羊源多克隆捕獲抗體,50 μL ／ 孔,2 ～ 8 ℃反應(yīng)過夜；用洗液1(PBS + 2%脫脂奶粉+ 0.5% Tween 20)洗滌4次,室溫封閉30 min；加入稀釋樣品(按NIBSC 推薦稀釋度進(jìn)行稀釋),50 μL ／ 孔,每個稀釋度設(shè) 2 個復(fù)孔,37 ℃反應(yīng)2 h；用洗液1 洗滌3 次,加入鼠源單克隆檢測抗體(按NIBSC 推薦稀釋度進(jìn)行稀釋),50 μL ／ 孔,37 ℃反應(yīng) 1 h；用 PBS 洗滌 3 次,加入顯色試劑 OPD,50 μL ／ 孔,室溫黑暗放置 30 min；用1 mol ／ L 硫酸終止反應(yīng),用酶標(biāo)儀檢測 A492值。

1.5 自建方法 各參加單位使用自建ELISA 體系進(jìn)行檢測。中檢院自建方法中各試劑均由本實(shí)驗(yàn)室保存。用碳酸鹽緩沖液包被牛源多克隆捕獲抗體,100 μL ／ 孔,2 ～ 8 ℃孵育過夜；用洗液 2(PBS + 1%牛血清白蛋白+ 0.5% Tween 20)洗滌3 次,室溫封閉 1 min；加入稀釋樣品,100 μL ／ 孔,每個稀釋度設(shè)2 個復(fù)孔,37 ℃反應(yīng)過夜；用洗液2 洗滌3 次,加入兔源多克隆檢測抗體,100 μL ／ 孔,37 ℃反應(yīng) 2 h；用洗液 2 洗滌 3 次,加入二抗,100 μL ／孔,37 ℃反應(yīng)2 h；用洗液 2 洗滌 4 次,加入 TMB,100 μL ／ 孔,室溫黑暗放置 30 min；1 mol ／ L 硫酸終止反應(yīng),用酶標(biāo)儀檢測A450和A620值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 依據(jù)第1 次國際協(xié)作研究經(jīng)驗(yàn),不同實(shí)驗(yàn)室不同型別反應(yīng)數(shù)據(jù)可能需要不同類型的分析模型:保證反應(yīng)線性部分保留至少3 個稀釋度的前提下,大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用平行線法計算樣品相對參考標(biāo)準(zhǔn)效力；為獲取線性劑量反應(yīng)關(guān)系,有的實(shí)驗(yàn)室反應(yīng)數(shù)據(jù)可能需做對數(shù)轉(zhuǎn)換處理,且在同一實(shí)驗(yàn)室同一檢測方法下所有型別數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換要保持一致；另外有的實(shí)驗(yàn)室自建方法使用四參數(shù)模型計算相對效力。

所有數(shù)據(jù)統(tǒng)一采用NIBSC 官方軟件CombiStats進(jìn)行有效性分析和結(jié)果計算［6-7］。平行線模型的適用以試驗(yàn)有效性成立為前提,判定試驗(yàn)無效或不適用平行線法計算的依據(jù)包括:劑量反應(yīng)數(shù)據(jù)目視明顯不呈線性；測試樣本劑量-反應(yīng)范圍與協(xié)標(biāo)參考標(biāo)準(zhǔn)不重疊；測試樣本與參考標(biāo)準(zhǔn)呈非平行關(guān)系。其中對樣品和參考標(biāo)準(zhǔn)平行關(guān)系成立的有效性標(biāo)準(zhǔn)是通過采用重復(fù)樣本相對于彼此的斜率比(即候選標(biāo)準(zhǔn)17 ／ 130樣品編碼17002 與17005 的相互比,候選標(biāo)準(zhǔn)17／160樣品編碼17004 與17007 的相互比)分別定義每種血清型的平行性接受標(biāo)準(zhǔn)。通過公式m = max(s,1 ／ s)計算m 的非參數(shù)上限值(95%置信度),其中s 表示一個試驗(yàn)中復(fù)樣的斜率比,取該界值及其倒數(shù)值定義為一個可接受的呈平行關(guān)系的斜率比范圍。

匯總所有有效的結(jié)果計算產(chǎn)生每個實(shí)驗(yàn)室和總體未加權(quán)D 抗原含量幾何平均值(geometric mean,GM)。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)和實(shí)驗(yàn)間的結(jié)果變異程度用幾何變異系數(shù)(geometric coefficient of variation,GCV)表示,按下列公式計算。

GCV(%)=(10 s - 1)× 100%

式中s 為log10 轉(zhuǎn)換效力的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié) 果

2.1 平行關(guān)系成立的有效性標(biāo)準(zhǔn) 規(guī)定時間內(nèi)共收到12 個實(shí)驗(yàn)室的檢測數(shù)據(jù),采用前10 個按時間順序提交的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)計算樣品和參考標(biāo)準(zhǔn)呈平行關(guān)系的斜率比范圍,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的斜率比范圍分別為0.66 ～ 1.51、0.70 ～ 1.43、0.65 ～ 1.54。

2.2 試驗(yàn)有效性分析 呈現(xiàn)非線性的樣本數(shù)據(jù)(約3%)被排除計算,見表1。采用上述平行性判定標(biāo)準(zhǔn),在 08 ／ 143 與 12 ／ 104 之間未發(fā)現(xiàn)不平行情況。當(dāng)采用候選參考標(biāo)準(zhǔn)時對比12 ／ 104,平行性未發(fā)生一致性改善,但對所有Ⅱ型測定具有較好的提升。當(dāng)實(shí)驗(yàn)室采用自建方法時,排除計算的數(shù)據(jù)比例較采用統(tǒng)一方法時更少。以17 ／ 160 作為參考標(biāo)準(zhǔn)時,采用任一方法的平行性均比采用17 ／ 130 更好。

2.3 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)變異 自建方法Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型實(shí)驗(yàn)室內(nèi)變異范圍分別為2.6% ～43.6%、2.0% ～21.6%及2.7% ～20.4%,統(tǒng)一方法Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部變異范圍分別為2.2% ～55.2%、2.2% ～46.5%和3.0% ～45.8%?？傮w上,有91.8%實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果的重復(fù)性高于20%,67%實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果的重復(fù)性高于10%,個別高變異值可能是由于單一的異常結(jié)果。當(dāng)使用候選標(biāo)準(zhǔn)17 ／ 160 作為參考時結(jié)果略好。

2.4 實(shí)驗(yàn)室間變異 當(dāng)采用自建方法,并以12／104為參考標(biāo)準(zhǔn)時,一些極端差異(最大GCV 為91.8%)集中來自兩個實(shí)驗(yàn)室,因此這兩個實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果被排除在最終效力計算之外。當(dāng)采用自建方法,以兩個sIPV 候選標(biāo)準(zhǔn)為參考時,未出現(xiàn)極端差異,且與12／104的參考標(biāo)準(zhǔn)相比,實(shí)驗(yàn)室間一致性有所提升。各實(shí)驗(yàn)室采用統(tǒng)一方法測定的sIPV 樣本D 抗原效力在實(shí)驗(yàn)室間差異較小,結(jié)果均納入最終計算中。當(dāng)采用12 ／ 104 作為參考無論采用何種方法,各實(shí)驗(yàn)室測量08 ／ 143 的效力差異均較小(最大 GCV 為 20.9%)。當(dāng)采用sIPV 參考標(biāo)準(zhǔn)和檢測樣本來自同一制造商時,實(shí)驗(yàn)室間檢測結(jié)果的一致性更優(yōu)(GCV 平均低于10%)。無論采用何種檢測方法,候選標(biāo)準(zhǔn)復(fù)樣的檢測結(jié)果間一致性均良好:各型別17 ／ 130 復(fù)樣間相對比值范圍為0.935 ～ 1.040,最大 GCV 為21.1%；各型別 17 ／160復(fù)樣間相對比值范圍為0.961 ～1.018,最大GCV 為11.0%,后者略優(yōu)于前者。見表1。

2.5 候選標(biāo)準(zhǔn)的D 抗原效力 以12 ／ 104 為參考標(biāo)準(zhǔn)時,候選標(biāo)準(zhǔn)品 17 ／ 130 的 I、Ⅱ和Ⅲ型 D 抗原含量幾何平均值分別為 50、608 和 450 DU ／ mL,17 ／160 的Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型D 抗原含量幾何平均值分別為239、136 和 237 DU ／ mL,見圖 1。

表1 試驗(yàn)有效性及實(shí)驗(yàn)室間變異情況(%)Tab.1 Assay validity and inter-laboratory variability(%)

圖1 以不同標(biāo)準(zhǔn)品檢測各樣品的D 抗原含量GMFig.1 Geometric mean of D-Ag contentdetermined by using various standards

2.6 中檢院檢測情況 采用自建方法的Ⅲ型檢測結(jié)果與總體平均估計值有較大偏離,因此未納入研究統(tǒng)計評價中。采用統(tǒng)一方法檢測的所有結(jié)果均滿足平行性可接受標(biāo)準(zhǔn),納入最終賦值統(tǒng)計計算,實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部變異為5.6% ～9.9%,表明本實(shí)驗(yàn)室操作精準(zhǔn)度良好。

3 討 論

在2015—2016 年第1 次sIPV 標(biāo)準(zhǔn)化國際協(xié)作研究的基礎(chǔ)上,確定了本次協(xié)作標(biāo)定的研究方案和候選標(biāo)準(zhǔn)材料,并沿用了第1 次協(xié)作研究的各參加單位。本次研究結(jié)果證實(shí)了第1 次協(xié)作研究的結(jié)論,即現(xiàn)行國際cIPV 標(biāo)準(zhǔn)品12 ／ 104 作為標(biāo)準(zhǔn)測定sIPV 產(chǎn)品中D 抗原含量的做法并不是最佳選擇,主要由于檢測結(jié)果在實(shí)驗(yàn)室自建方法間變異度較高。當(dāng)采用兩種sIPV 候選標(biāo)準(zhǔn)材料作為標(biāo)準(zhǔn)時,sIPV 產(chǎn)品D 抗原結(jié)果的實(shí)驗(yàn)室間一致性得到了明顯提升。另外,兩個候選標(biāo)準(zhǔn)的重復(fù)樣品的D 抗原含量GM在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)和實(shí)驗(yàn)室間均有較好的一致性。上述結(jié)果表明,兩種sIPV 候選標(biāo)準(zhǔn)材料均具有作為sIPV D抗原含量測定的國際標(biāo)準(zhǔn)品的潛力。

NIBSC 開展的穩(wěn)定性研究表明,這兩種候選標(biāo)準(zhǔn)材料在長期儲存(-70 ℃)和短期實(shí)驗(yàn)室操作的溫度下(4 ～20 ℃)均是穩(wěn)定的。但兩種材料在-20 ℃儲存期間的穩(wěn)定性較差,特別是17 ／ 160 保存9 個月后基本檢測不到D 抗原。在4 ℃儲存9 個月,17／130的效力有所下降,但17 ／ 160 的效力保持相對穩(wěn)定。因此,綜合協(xié)作標(biāo)定和穩(wěn)定性研究結(jié)果得出結(jié)論:候選材料 17 ／ 130 和 17 ／ 160 均適合作為 sIPV D 抗原含量檢測國際標(biāo)準(zhǔn)；目前17 ／ 160 在試驗(yàn)有效性、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)和實(shí)驗(yàn)室間的一致性和整體熱穩(wěn)定性方面的總體結(jié)果略好,因此被選定為第1 代sIPV D 抗原含量檢測的國際標(biāo)準(zhǔn)品,標(biāo)識的效價Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型分別為 239、136 和 237 DU ／ mL［8］。

目前各sIPV 實(shí)驗(yàn)室自建的ELISA 檢測方法形式多種多樣,包括不同的捕獲和檢測抗體組合、重復(fù)樣品數(shù)量和每個樣品的稀釋度數(shù)目、不同的檢測用底物和計算D 抗原量的統(tǒng)計分析方法等。采用統(tǒng)一檢測方法之后,無論使用何種材料作為標(biāo)準(zhǔn)去檢測sIPV 抗原含量,實(shí)驗(yàn)室間的差異大幅減小,原因可能是統(tǒng)一方法的操作在一定程度上避免了不同檢測方法差異帶來的影響。另外,無論是否統(tǒng)一檢測方法,以cIPV 或sIPV 作為標(biāo)準(zhǔn)檢測sIPV 樣品時,不同實(shí)驗(yàn)室間均顯示良好的一致性,尤其是當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)和樣品來自同一生產(chǎn)廠家時,實(shí)驗(yàn)室間一致性最好,可能是由于生產(chǎn)工藝不同,如不同的蛋白質(zhì)-甲醛相對濃度等,導(dǎo)致來源相同毒株的不同產(chǎn)品一些表位結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了微小差異。因此,建立sIPV 國際標(biāo)準(zhǔn)品后的標(biāo)準(zhǔn)化研究,可考慮進(jìn)一步優(yōu)化協(xié)調(diào)實(shí)驗(yàn)室間的D 抗原ELISA 檢測方法,或建立適用于不同sIPV 產(chǎn)品的放行檢測方法,如建立對不同sIPV 產(chǎn)品和 ／ 或cIPV 產(chǎn)品具有相似反應(yīng)活性的抗體試劑等。

基于cIPV 和sIPV 的抗原特性差異及建立同源參考物質(zhì)以精確測量有效成分的必要性,防止未來使用sIPV 國際標(biāo)準(zhǔn)賦值與cIPV 產(chǎn)生混淆,國際上提議一個獨(dú)立于cIPV 效力的D 抗原單位(DU)的新抗原單位,即Sabin D 抗原單位(SDU),專門用于定義sIPV 產(chǎn)品。2019 年WHO 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)委員會同意將推薦的候選標(biāo)準(zhǔn)材料17 ／ 160 作為第1 個sIPV D抗原含量的國際標(biāo)準(zhǔn)品,并賦予Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型效價分別為100 SDU ／ mL,用于校準(zhǔn)sIPV 的二級參考品。目前該新國際標(biāo)準(zhǔn)僅被驗(yàn)證用于體外試驗(yàn),WHO 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)委員會提議將進(jìn)一步研究評估其用于大鼠體內(nèi)效力測定的適用性,并根據(jù)全球現(xiàn)狀提出了有效的使用建議:現(xiàn)有已獲得許可和處于后期開發(fā)階段的sIPV 產(chǎn)品制造商,已根據(jù)其使用DU 表示了效力值,在獲得國家監(jiān)管機(jī)構(gòu)(National Regulation Authority,NRA)批準(zhǔn)的情況下可繼續(xù)使用已經(jīng)標(biāo)識DU 的內(nèi)部參考效力值；同時建議根據(jù)sIPV 國際標(biāo)準(zhǔn)品測定其sIPV 產(chǎn)品的SDU 效力值,并建立“SDU”與“DU”之間的相關(guān)性,作為一個關(guān)鍵的質(zhì)量屬性,確保產(chǎn)品間的可比性［9-10］。