藁本內(nèi)酯對血管緊張素Ⅱ誘導損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細胞中miR-122表達的影響及其作用機制

楊銳，謝青，江華，毛玉娟，王莉，何亞麗，申進增，伊琳

甘肅中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合學院,甘肅蘭州730000

高血壓是一種慢性疾病,可導致多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展,如心力衰竭、血管性癡呆及中風等,這些疾病均與高血壓改變動脈壁的結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)［1］。血管內(nèi)皮細胞通過釋放旁分泌信號分子NO和前列環(huán)素來控制血管反應性,從而控制血壓［1］。microRNAs(miRs)是一種小的非編碼RNA,轉(zhuǎn)錄后通過與目標信使RNA(mRNAs)結(jié)合來調(diào)控基因的表達,從而誘導mRNA 降解或阻斷翻譯［2］。在前期研究中,發(fā)現(xiàn)當歸可對自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織miR-122的表達產(chǎn)生影響,可能是通過調(diào)控miR-122 靶基因,即陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運體1(solutecarrierfamily7member1,Slc7a1)基因的表達來影響內(nèi)皮功能［3］。

藁本內(nèi)酯是從中藥當歸、川芎等傘形科植物中提取的主要活性成分。研究表明,藁本內(nèi)酯具有舒張血管、抗炎、抗氧化、抑制腫瘤細胞增殖等作用［4］。本研究采用血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)建立人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)損傷模型,并檢測藁本內(nèi)酯對損傷HUVECs 中miR-122 表達及精氨酸轉(zhuǎn)運通路miR-122 ／ 陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白-1(cationic amino acid transporter-1,CAT-1)／ NO 的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞株 HUVECs 購自上海傳秋生物科技有限公司。

1.2 主要試劑 藁本內(nèi)酯購自蘭州化學物理研究所；AngⅡ(批號:1220G031)、纈沙坦(批號:724A021)及NO 檢測試劑盒(批號:201812110)購自中國北京索萊寶科技有限公司；ECM 培養(yǎng)基(批號:26327)、青-鏈霉素(批號:25862)、人內(nèi)皮細胞生長因子(endothelial cell growth supplement,ECGS)(批號:26130)及胎牛血清(批號:26313)購自美國ScienCell 公司；胰酶(批號:2042337)購自美國Gibco 公司；CCK8 試劑盒(批號:KR675)購自日本同仁公司；兔抗CAT-1單克隆抗體(批號:00616770)、兔抗GAPDH 多克隆抗體(批號:00068668)及熒光標記的山羊抗兔IgG(H + L)(批號:20000003)購自美國 Proteintech 公司；超純RNA 提取試劑盒、HiFiScript cDNA Synthesis Kit 及UltraSYBR Mixture(Low ROX)購自江蘇康為世紀生物科技股份有限公司；RIPA 裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 細胞培養(yǎng) 從液氮罐中取出HUVECs,37 ℃水浴1 min,加入ECM 培養(yǎng)基5 mL,1 000×g 離心5 min,棄上清,加入含5%胎牛血清、1%青-鏈霉素、1%ECGS的ECM 完全培養(yǎng)基,吹打混勻,移至培養(yǎng)瓶,于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。穩(wěn)定傳代2 ～3 代后,取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)試驗。

1.4 AngⅡ?qū)UVECs 存活率影響的檢測 將對數(shù)生長期 HUVECs 按 7.5 × 103個 ／ 孔接種至 96 孔板,加入含5%胎牛血清、1% 青-鏈霉素,1% ECGS 的ECM 完全培養(yǎng)基,100 μL ／ 孔,37 ℃培養(yǎng) 12 h；待細胞貼壁后,分別加入含不同終濃度AngⅡ(分別為1 ×10-4、1 × 10-5、1 × 10-6mol ／ L)的 ECM 完全培養(yǎng)基,同時設(shè)空白組(不加AngⅡ),每組均設(shè)6 個復孔,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。采用CCK8 試劑盒檢測A450,并按下式計算細胞存活率。選取存活率為60% ～70%的濃度為最適建模濃度,用于后續(xù)試驗。

細胞存活率(%)= 試驗組 A450／ 空白組 A450× 100%

1.5 藁本內(nèi)酯對AngⅡ誘導損傷HUVECs 活性影響的檢測 將對數(shù)生長期HUVECs 按1.4 項方法加入96 孔板,37 ℃培養(yǎng)12 h 后,分為空白組(不給藥)、模型組(1 × 10-5mol ／ L AngⅡ)、纈沙坦組(1 ×10-5mol／L AngⅡ +1 × 10-4mol／L 纈沙坦)及藁本內(nèi)酯低劑量組(1 × 10-5mol ／ L AngⅡ + 1 × 10-5mol ／ L藁本內(nèi)酯)、中劑量組(1 × 10-5mol ／ L AngⅡ + 1 ×10-4mol ／ L 藁本內(nèi)酯)、高劑量組(1 × 10-5mol ／ L AngⅡ + 1 × 10-3mol ／ L 藁本內(nèi)酯),每組均設(shè) 6 個復孔,于37 ℃培養(yǎng)24 h。采用CCK8 試劑盒檢測A450。

1.6 藁本內(nèi)酯對AngⅡ誘導損傷HUVECs 分泌NO 影響的檢測 按1.5 項進行細胞培養(yǎng)及分組,每組設(shè) 3 個重復,于 37 ℃培養(yǎng) 24 h；2 000 × g 離心5 min,取上清液,采用NO 檢測試劑盒檢測NO含量。

1.7 藁本內(nèi)酯對AngⅡ誘導損傷HUVECs 中miR-122 表達及Slc7a1 基因mRNA 轉(zhuǎn)錄水平影響的檢測 根據(jù)NCBI 中登錄的Slc7a1 mRNA 序列(NM_003045.5),應用Primer 軟件設(shè)計引物,引物序列見表1,由蘇州泓迅生物科技股份有限公司合成。按1.5 項進行細胞培養(yǎng)及分組,采用超純RNA 提取試劑盒提取各組細胞RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,以其為模板進行RT-qPCR 檢測。PCR 擴增條件為:95 ℃預變性 10 min；95 ℃變性 10 s,56 ℃退火 30 s,72 ℃延伸35 s,共 40 個循環(huán)。miR-122 表達水平及Slc7a1 基因mRNA 轉(zhuǎn)錄水平均以與β-action 的Ct 值比值表示。

表1 用于RT-qPCR 擴增的引物序列Tab.1 Primer sequences used for amplification by RT-qPCR

1.8 藁本內(nèi)酯對AngⅡ誘導損傷HUVECs 中CAT-1蛋白表達水平影響的檢測 按1.5 項進行細胞培養(yǎng)及分組,用RIPA 裂解液提取各組細胞的總蛋白,BCA 法蛋白定量。經(jīng)10% SDS-PAGE 分離蛋白后,濕法轉(zhuǎn)移至PVDF 膜,用5%脫脂牛奶于4 ℃封閉1.5 h；加入兔抗 CAT-1 單克隆抗體(1 ∶2 000 稀釋)及兔抗 GAPDH 單克隆抗體(1 ∶1 000 稀釋),4 ℃孵育過夜；TBST 洗滌3 次,加入熒光標記的山羊抗兔IgG(H + L)(1 ∶5 000 稀釋),室溫孵育 2 h；TBST 洗滌3 次,用化學發(fā)光成像系統(tǒng)進行檢測。

1.9 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 23.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。所得數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布檢驗,若數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布,計量資料采用均數(shù) ± 標準差(± s)表示,多組間比較采用ANOVA 方差分析,兩組間比較采用LSD-t 檢驗；若不服從正態(tài)分布,計量資料采用中位數(shù)或四分位數(shù)進行統(tǒng)計描述,多組間比較采用秩和檢驗。均以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 AngⅡ?qū)UVECs 存活率的影響 空白組及1 × 10-4、1 × 10-5、1 × 10-6mol ／ L AngⅡ組 A450分別為 0.830 ± 0.011、0.481 ± 0.152、0.559 ± 0.328、0.661 ± 0.135。與空白組比較,1 × 10-4、1 × 10-5、1 × 10-6mol／L AngⅡ組 A450明顯下降(t 分別為-32.136、-24.839、-15.539,P ＜ 0.01)。1 × 10-4、1 × 10-5、1 ×10-6mol ／ L AngⅡ組細胞存活率分別約為57.93%、68.08%、79.66%。AngⅡ濃度為 1 × 10-5mol ／ L 時,存活率為60% ～70%,因此選擇AngⅡ濃度1 ×10-5mol ／ L 為最適建模濃度。

2.2 藁本內(nèi)酯對AngⅡ誘導損傷HUVECs 活性的影響 空白組、模型組、纈沙坦組及藁本內(nèi)酯低、中、高劑量組的A450分別為0.863±0.037、0.571±0.025、0.730 ± 0.028、0.747 ± 0.029、0.726 ± 0.035 及0.671 ± 0.009。與空白組比較,模型組 HUVECs 活性顯著降低(t = -17.648,P ＜0.01)；與模型組比較,纈沙坦組及藁本內(nèi)酯低、中、高劑量組HUVECs活性顯著提高(t 分別為 9.624、10.630、9.370、6.036,P 均 ＜ 0.01)。

2.3 藁本內(nèi)酯對AngⅡ誘導損傷HUVECs 分泌NO的影響 空白組、模型組、纈沙坦組及藁本內(nèi)酯低、中、高劑量組細胞上清中的NO 含量分別為(15.815±0.354)、(8.721 ± 0.823)、(15.190 ± 0.341)、(17.804 ± 0.752)、(20.388 ± 0.621)、(20.752 ±0.543) μmol ／ L。與空白組比較,模型組細胞分泌NO 水平明顯降低(t = -20.454,P ＜ 0.01)；與模型組比較,纈沙坦組及藁本內(nèi)酯低、中、高劑量組分泌NO 水平明顯上升(t 分別為 18.652、26.191、33.640、34.691,P 均 ＜ 0.01)。

2.4 藁本內(nèi)酯對AngⅡ誘導損傷HUVECs 中miR-122表達及Slc7a1 基因mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的影響 與空白組比較,模型組miR-122 表達水平明顯升高(t =10.673,P ＜ 0.01),Slc7a1 基因 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平明顯降低(t = -3.656,P ＜0.01)；與模型組比較,纈沙坦組及藁本內(nèi)酯低、中、高劑組miR-122 表達水平明顯降低(t 分別為-7.596、-7.698、-9.583、-10.819,P 均＜0.01),纈沙坦組及藁本內(nèi)酯中、高劑量組Slc7a1基因mRNA 轉(zhuǎn)錄水平明顯升高(t 分別為3.823、3.953、6.789,P 均 ＜ 0.01)。見表 2。

表 2 各組HUVECs 中 miR-122 表達及Slc7a1 基因mRNA 轉(zhuǎn)錄水平(± s,n = 6)Tab.2 The miR-122 expression and Slc7a1 mRNA transcription levels in HUVECs of various groups(± s,n = 6)

表 2 各組HUVECs 中 miR-122 表達及Slc7a1 基因mRNA 轉(zhuǎn)錄水平(± s,n = 6)Tab.2 The miR-122 expression and Slc7a1 mRNA transcription levels in HUVECs of various groups(± s,n = 6)

注:aa 表示與空白組比較,P ＜0.01；bb 表示與模型組比較,P ＜ 0.01。

組別 miR-122 表達水平 Slc7a1 基因mRNA 轉(zhuǎn)錄水平空白組 1.000 ± 0.096 1.014 ± 0.187模型組 1.807 ± 0.130aa 0.750 ± 0.066aa纈沙坦組 1.233 ± 0.086bb 1.026 ± 0.114bb藁本內(nèi)酯組低劑量 1.225 ± 0.144bb 0.774 ± 0.139中劑量 1.083 ± 0.133bb 1.035 ± 0.124bb高劑量 0.989 ± 0.176bb 1.239 ± 0.079bb

2.5 藁本內(nèi)酯對AngⅡ誘導損傷HUVECs 中CAT-1蛋白表達水平的影響 空白組、模型組、纈沙坦組及藁本內(nèi)酯低、中、高劑量組的CAT-1 表達水平分別為(0.937 ± 0.080)、(0.758 ± 0.040)、(1.253 ± 0.250)、(1.113 ± 0.018)、(1.189 ± 0.027)、(1.115 ± 0.020)。與空白組比較,模型組的CAT-1 表達水平明顯降低(t = -16.394,P ＜0.01)；與模型組比較,纈沙坦組及藁本內(nèi)酯低、中、高劑量組細胞CAT-1 表達水平明顯升高(t 分別為 45.368、32.529、39.530、32.681,P 均 ＜ 0.01),見圖 1。

圖 1 Western blot 法檢測各組HUVECs 中CAT-1 蛋白的表達Fig.1 Western blotting of CAT-1 expressoin in HUVECs of various groups

3 討 論

NO 生物利用度降低可導致內(nèi)皮功能障礙和高血壓,NO 由內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)在內(nèi)皮細胞中產(chǎn)生［5］。內(nèi)皮功能在較大程度上取決于eNOS 的功能和活性,L-精氨酸是eNOS 的合成NO 的底物,L-精氨酸缺乏可導致eNOS 功能障礙［6］。研究表明,L-精氨酸的轉(zhuǎn)運不取決于細胞內(nèi)外精氨酸的濃度,而是通過CAT-1 轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)［7］。本研究發(fā)現(xiàn),AngⅡ誘導損傷的HUVECs分泌NO 水平及細胞活性均明顯降低(P ＜0.01),與其他研究結(jié)果一致［8-9］,給予纈沙坦及各劑量藁本內(nèi)酯干預后,分泌NO 水平明顯升高(P ＜0.01)。表明藁本內(nèi)酯可提高AngⅡ誘導損傷HUVECs 產(chǎn)生NO 的水平。

KISHIKAWA 等［10］沉默了肝癌細胞內(nèi)的miR-122,可通過 miR-122 ／ CAT-1 ／ NO 通路使肝癌細胞內(nèi)產(chǎn)生的NO 水平增高,這與精氨酸轉(zhuǎn)運密切相關(guān)。SHASHAR 等［11］在妊娠期高血壓病的研究中發(fā)現(xiàn),該病的發(fā)病機制與CAT-1 蛋白功能受到抑制及細胞內(nèi)L-精氨酸水平降低導致NO 生成減少有關(guān)。內(nèi)皮間連接在維持內(nèi)皮完整性和調(diào)節(jié)血管功能方面發(fā)揮重要作用,CAT-1 是一種內(nèi)皮細胞間黏附分子(cell adhesion molecule,CAM),直接參與調(diào)節(jié)內(nèi)皮完整性,對內(nèi)皮具有保護作用［12］。本研究采用AngⅡ誘導損傷HUVECs 后,細胞內(nèi)miR-122 水平明顯升高(P ＜ 0.01),Slc7a1 基因 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平、CAT-1蛋白表達水平、細胞活性及NO 水平均明顯降低(P ＜0.01),給予藁本內(nèi)酯治療后,miR-122 水平明顯降低(P ＜ 0.01),Slc7a1 基因 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平、CAT-1 蛋白表達水平、細胞活性及NO 水平均明顯升高(P ＜0.01)。表明藁本內(nèi)酯可緩解AngⅡ誘導的HUVECs損傷。

L-精氨酸轉(zhuǎn)運增強可預防心力衰竭患者的腎纖維化、炎癥和腎功能衰竭［13］。在神經(jīng)母細胞瘤的研究中,通過阻斷CAT-1 依賴的體外精氨酸攝取可延緩了腫瘤的發(fā)展［14］。慢性淋巴細胞白血病的研究中,腫瘤細胞CAT-1 轉(zhuǎn)運體的下調(diào)顯著降低精氨酸的攝取,抑制細胞增殖,降低細胞活力［15］。表明L-精氨酸轉(zhuǎn)運增強,亦可能導致腫瘤的進展。

綜上所述,藁本內(nèi)酯可降低AngⅡ誘導損傷的HUVECs 細胞miR-122 表達水平,提高其靶基因Slc7a1轉(zhuǎn)錄及其蛋白CAT-1 表達的水平,增強細胞L-精氨酸轉(zhuǎn)運,促進NO 的合成,保護內(nèi)皮細胞功能。