牦牛糞沉積對(duì)青藏高原高寒草甸土壤酶活性的影響

張志陽，張世挺

（草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅蘭州730000）

放牧是草地生態(tài)系統(tǒng)主要的土地利用方式[1]。在放牧草場(chǎng)中，食草動(dòng)物消耗的大部分初級(jí)生產(chǎn)力只有小部分被同化，大量的碳(C)和養(yǎng)分以動(dòng)物糞便的形式返回草地[2]。例如，在新西蘭一個(gè)奶牛牧場(chǎng)中[2]，每年通過糞便返回草地的碳約32000 kg·hm?2，氮約1040 kg·hm?2。因此，牲畜糞便是放牧草地生態(tài)系統(tǒng)中土壤有機(jī)碳和養(yǎng)分的重要來源[3]。

糞便中的碳和養(yǎng)分可以通過有機(jī)質(zhì)的淋溶和分解進(jìn)入土壤[4-5]。有研究表明，在溫帶草原上，兩個(gè)月內(nèi)糞便中有10%～16%的C滲入土壤[6-7]。糞便中大部分氮以銨態(tài)氮的形式進(jìn)入土壤[8]，進(jìn)而增加土壤中的氮含量[5]。此外，糞便也能通過影響土壤的其他理化性質(zhì)，例如水分含量和pH，間接調(diào)節(jié)土壤元素循環(huán)[4,9-10]。

土壤酶在有機(jī)質(zhì)分解和養(yǎng)分循環(huán)中起著關(guān)鍵作用[11]。研究表明酶活性直接受微生物生物量的控制[12-13]。此外，酶活性還受基質(zhì)的可利用性、土壤水分含量和pH的影響[13-14]。牲畜糞便為土壤輸入了大量的外源性可利用碳和養(yǎng)分，可能刺激土壤微生物的生長(zhǎng)和酶的活性[15]。以往的研究表明，牛糞沉積能夠改變土壤微生物生物量[3,5]和酶活性[16-17]。然而，關(guān)于牛糞沉積引起的非生物因素和生物因素如何調(diào)控土壤酶活性的研究相對(duì)較少[18-19]。

牦牛是青藏高原的主要畜種，大約有1330萬頭家養(yǎng)牦牛和2萬頭野生牦牛，通過放牧大量的糞便直接沉積在草地上[20-21]。因此，牦牛糞是該地區(qū)土壤碳和養(yǎng)分輸入的主要來源。在該地區(qū)進(jìn)行的許多研究表明牦牛糞的后續(xù)分解能夠增加土壤肥力和牧草產(chǎn)量[22-24]。然而，很少有研究關(guān)注牦牛糞沉積對(duì)該地區(qū)土壤微生物群落及其功能的影響。因此，在本研究中，主要解決的問題是：1)牦牛糞分解如何影響土壤理化性質(zhì)，微生物生物量和酶活性；2)牦牛糞沉積引起的土壤理化性質(zhì)和微生物生物量的變化如何調(diào)控土壤酶活性。

1 材料與方法

1.1 研究地點(diǎn)

研究地點(diǎn)位于甘肅省合作市境內(nèi)的蘭州大學(xué)高寒草甸與濕地生態(tài)系統(tǒng)定位研究站(34°55′N,102°53′ E, 海拔2910 m)。試驗(yàn)期間日均溫度為11.5℃,總降水量為326 mm。植被類型為亞高山草甸，主要優(yōu)勢(shì)物種為垂穗披堿草(Elymus nutans)和矮嵩草(Kobresia humilis)。研究區(qū)域放牧強(qiáng)度約每公頃3頭牦牛。

1.2 牦牛糞收集

將新鮮的牦牛糞收集到桶中，并將其充分混合以確保均質(zhì)性。添加的牦牛糞堆為直徑20 cm，厚度4 cm，平均鮮重1.5 kg。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在進(jìn)行試驗(yàn)之前，用圍欄圍封了一個(gè)10 m ×20 m的樣地，以防止試驗(yàn)期間牦牛放牧的干擾。該試驗(yàn)于2017年7月20日?10月10日進(jìn)行。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)區(qū)組內(nèi)包括牦牛糞添加和土壤對(duì)照(以直徑為20 cm的鐵絲圈標(biāo)記)兩種處理，總共設(shè)置5個(gè)重復(fù)，相鄰區(qū)組之間間隔2 m。每個(gè)區(qū)組內(nèi)放置了4個(gè)糞堆和4個(gè)鐵絲圈，牦牛糞和/或鐵絲圈間隔2.5 m。整個(gè)試驗(yàn)期間總共進(jìn)行4次采樣。

1.4 采樣

在糞便添加的21、40、60和83 d后分別進(jìn)行采樣。收集牛糞并采集牛糞下方和鐵絲圈內(nèi)的表層土壤(0–15 cm)，將所有樣品混合均勻后裝入自封袋，置于4℃冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室。在確定糞便鮮重后，將其分為兩個(gè)子樣品：一部分在105℃下烘干至恒重測(cè)定牦牛糞質(zhì)量損失；另一部分儲(chǔ)存在4℃冰箱內(nèi)用于理化性質(zhì)分析。將每個(gè)土壤樣品過2 mm的篩子后同樣分成兩個(gè)子樣品：一部分在蔭庇處風(fēng)干用于土壤理化分析；另一部分儲(chǔ)存在4℃冰箱內(nèi)，用于土壤可溶性碳和氮，微生物生物量和酶活性分析。

1.5 指標(biāo)測(cè)定及方法

水分含量：將10 g新鮮樣品(牦牛糞和土壤)均勻地鋪在已知準(zhǔn)確質(zhì)量的鋁盒中，將鋁盒置于105℃的烘箱中烘干至恒重，根據(jù)樣品前后質(zhì)量差計(jì)算水分含量。

糞便質(zhì)量剩余率=采樣時(shí)的糞便干重/初始糞便干重×100%。

土壤pH：土壤pH采用電位法進(jìn)行測(cè)定，即稱取10 g過2 mm篩的風(fēng)干土壤于25 mL去離子水中(土水比為1?2.5，W ?V)，使用恒溫振蕩器搖動(dòng)30 min，然后靜置30 min，用配有甘汞電極的pH計(jì)測(cè)定上清液中的pH。

可溶性有機(jī)碳(DOC)和可溶性有機(jī)氮(DON)的測(cè)定：稱取新鮮樣品(土壤20 g，牦牛糞10 g)于盛有100 mL 0.5 mol·L?1K2SO4提取液的三角瓶中，將其在往復(fù)振蕩器上震蕩1 h，然后在10 000 r·min?1下離心10 min，上清液用0.45μm硝酸纖維素濾膜過濾[25]。使用TOC儀測(cè)定濾液中的DOC和總?cè)芙庑杂袡C(jī)氮(TDN)，流動(dòng)注射分析儀測(cè)定濾液中的N和N。DON計(jì)算為TDN與無機(jī)N(NH4+和N)之差。

土壤微生物生物量碳(MBC)和微生物生物量氮(MBN)測(cè)定：使用氯仿熏蒸提取技術(shù)測(cè)定MBC和MBN含量[26]，即稱取新鮮的土壤20 g于培養(yǎng)皿中，將其置于盛有60 mL氯仿的真空干燥器中并抽至真空。另取等量的土壤置于另一真空干燥器中，但不熏蒸作為對(duì)照。將干燥器在避光條件下在25℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將熏蒸和未熏蒸的土壤用80 mL 0.5 mol·L?1的K2SO4提取液提取，然后離心、過濾。使用TOC儀測(cè)定濾液中總有機(jī)碳和總氮。MBC和MBN的轉(zhuǎn)換因子分別為0.45和0.54。

土壤酶活性測(cè)定：β-1,4-葡萄糖苷酶(BG)活性采用可見風(fēng)光光度法測(cè)定[27]，以ρ-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷為底物，在25℃下培養(yǎng)2 h后在410 nm波長(zhǎng)下測(cè)定催化生成的產(chǎn)物對(duì)硝基苯酚(PNP)；β-1,4-木糖苷酶(BX)活性采用微孔板熒光法測(cè)定[28]，以4-MUB-β-D木糖苷酶為底物，在25℃下培養(yǎng)4 h后在365 nm激發(fā)波長(zhǎng)和450 nm發(fā)射波長(zhǎng)下測(cè)定催化生成的產(chǎn)物4-MUB；脲酶(urease)活性采用靛酚藍(lán)比色法測(cè)定[27]，以4 mmol·L?1尿素用為底物，在25℃下培養(yǎng)24 h后，在578 nm波長(zhǎng)下測(cè)定催化生成的產(chǎn)物N。

1.6 數(shù)據(jù)分析

在進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析之前對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。采用重復(fù)測(cè)量方差分析(RMANOVA)確定牦牛糞添加對(duì)土壤水分含量、pH、可溶性有機(jī)碳和氮、微生物生物量和酶活性的影響。采用t檢驗(yàn)確定各個(gè)變量在不同采樣時(shí)間的顯著性差異。采用冗余分析(RDA)解釋酶活性與土壤理化性質(zhì)和微生物生物量之間的關(guān)系。蒙特卡羅置換檢驗(yàn)用于檢驗(yàn)土壤理化性質(zhì)、微生物生物量和酶活性之間的顯著關(guān)系。所有的統(tǒng)計(jì)分析均在R語言(R Development Core Team, 2020, 4.0.0)軟件中完成。RDA分析使用“vegan”軟件包完成。

2 結(jié)果

2.1 牦牛糞質(zhì)量損失及可溶性碳氮變化

經(jīng)過83 d的分解后，牦牛糞分解了29.4%。DOC和DON的初始含量分別為16.22和3.25 g·kg?1。隨著分解DOC和DON含量持續(xù)降低(圖1)。

2.2 土壤理化性質(zhì)

牛糞添加顯著增加了SMC(P<0.01)(表1)，與對(duì)照相比，第2次采樣時(shí)顯著增加(圖2)。牛糞添加降低了土壤pH(P<0.001)(圖2)，采樣時(shí)間及采樣時(shí)間與牛糞添加的交互作用都不影響pH(表1)。與對(duì)照相比，牛糞添加顯著增加了土壤DOC(P<0.001)和DON(P<0.001)含量，并且在第2次采樣(牛糞添加40 d) 時(shí)達(dá)到了最大值，隨后持續(xù)減小(圖2)。采樣時(shí)間及采樣時(shí)間與牛糞添加的交互作用都顯著影響了DOC和DON (表1)。

2.3 土壤微生物生物量和土壤酶活性

圖1 試驗(yàn)期內(nèi)牦牛糞質(zhì)量剩余率和可溶性有機(jī)碳(DOC)和可溶性有機(jī)氮(DON)的平均值Figure 1 Mean valuesof yak dung mass remaining and dissolved organic carbon(DOC)and dissolved organic nitrogen(DON)during experiment period

表1 糞便添加和采樣時(shí)間及其交互作用對(duì)土壤理化性質(zhì)、微生物生物量和酶活性影響的方差分析(RMANOVA)Table 1 Repeated measures analysis of variance (RMANOVA)testing of the effects of dung deposition sampling time,and their interactions on soil physicochemical properties,microbial biomass,and enzyme activities,respectively

牛糞添加，采樣時(shí)間及其交互作用均顯著影響所有檢測(cè)的微生物變量(P<0.05)(表1)。與對(duì)照相比，牛糞添加處理下MBC和MBN含量分別顯著增加了14.24%(P<0.001)和20.29%(P<0.001)，并且在第2次采樣(牛糞添加40 d)增加的幅度最大(圖3)。牛糞添加，采樣時(shí)間及其交互作用也顯著影響了BG(P<0.001)，BX(P<0.001)和URE(P<0.001)的活性(表1)。與對(duì)照相比，牛糞添加顯著增加了BG、BX和URE活性，增幅分別為8.4%、8.2%和6.6%，并且在第2次采樣時(shí)增加的幅度最大(圖3)。

2.4 土壤理化性質(zhì)，微生物生物量和酶活性之間的關(guān)系

冗余分析(RDA)的結(jié)果表明(圖4)，土壤理化性質(zhì)和土壤微生物生物量顯著影響了土壤酶活性(F=31.03,P=0.001)，這些因素總共解釋了土壤酶活性84.18%的變異。RDA的第一軸和第二軸分別解釋了酶活性變異的81.5%和2.5%。DOC，DON，MBC和MBN與土壤酶活性呈正相關(guān)關(guān)系(R2= 0.22,P< 0.001；R2= 0.26,P< 0.001；R2= 0.16,P< 0.001；R2=0.11,P< 0.001)，pH與土壤酶活性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(R2=0.069,P<0.034)。SMC與土壤酶活性之間沒有顯著相關(guān)性(R2= 0.008，P= 0.23)。

3 討論

3.1 牦牛糞質(zhì)量損失及可溶性碳氮?jiǎng)討B(tài)變化

圖2 牦牛糞添加對(duì)土壤水分含量、p H、可溶性有機(jī)碳和可溶性有機(jī)氮的影響Figure 2 Effects of yak dung deposition on soil moisture content,p H ,dissolved organic carbon and dissolved organic nitrogen

本研究表明，在野外分解83 d后牦牛糞質(zhì)量損失了29.4%，這與以前的研究結(jié)果一致[29]。Li等[30]的研究結(jié)果表明牦牛糞完全分解需要3年左右的時(shí)間。因此，本研究牦牛糞在一個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)的分解相對(duì)較少(29.4%)。另外，糞便的沉積季節(jié)會(huì)影響其分解。例如，由于秋季和冬季的溫度較低，質(zhì)量損失率會(huì)降低[21]。在整個(gè)研究過程中，牛糞中DOC和DON的含量隨著分解而不斷降低，這可能是由于降水將可溶性有機(jī)物質(zhì)和礦質(zhì)養(yǎng)分逐漸浸出到土壤中所致，特別是在分解的早期。此外，大型無脊椎動(dòng)物如糞甲蟲和蠅類是牦牛糞分解的兩個(gè)主要功能群體[31]，它們主要以新鮮的糞便液體和較小的糞便顆粒為食[32]。研究期間觀察到，當(dāng)牦牛糞置于草地不久后就有糞甲蟲和蠅類定殖。在第1次采樣時(shí)，由于牛糞水分含量的下降和“糞殼”的形成，蠅類已經(jīng)完全消失，僅剩下糞甲蟲。因此，在牛糞分解的早期，溫度、降水和無脊椎土壤動(dòng)物在牛糞其分解和養(yǎng)分釋放過程中起著重要作用。

3.2 牦牛糞添加對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

本研究表明，牦牛糞添加顯著增加了SMC，這與以前的研究結(jié)果一致[10,33-34]，主要是由于糞便吸收了強(qiáng)烈的太陽熱輻射從而阻止了土壤中水分的蒸發(fā)。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)牛糞添加顯著降低了土壤的pH。Aarons等[35]也觀察到牛糞添加降低了表層土壤(0?5 cm)的pH。相反，一些研究結(jié)果表明，糞便沉積增加了土壤的pH[36-37]，并且認(rèn)為增加的原因是由于糞便中的堿性元素(鈣和鎂等)釋放到土壤中所致[35]。在本研究中，一方面，由于環(huán)境溫度較低和糞便分解時(shí)間較短，糞便中的堿性元素釋放較慢，這可能不足以增加土壤的pH；另一方面，牦牛糞在植物生長(zhǎng)季節(jié)的沉積會(huì)造成活體植物窒息死亡，這些植物殘?bào)w的分解可能向土壤中釋放大量的酸性物質(zhì)[3,38]。另外，牦牛糞添加顯著增加了土壤DOC和DON含量。在初始分解階段，牦牛糞中的大部分DOC和DON通過淋溶進(jìn)入土壤，牛糞窒息的植物中一些易分解的物質(zhì)以DOC和DON的形式釋放進(jìn)入土壤[39-40]，從而增加了土壤DOC和DON的含量。隨著分解時(shí)間的推移，牦牛糞可以通過提供外源有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分來改善土壤結(jié)構(gòu)和肥力，從而刺激土壤微生物活性[41]。增強(qiáng)的微生物活性可以進(jìn)一步促進(jìn)土壤中原有的和新進(jìn)入的有機(jī)質(zhì)分解，從而釋放出DOC和DON[42]。

圖3 牦牛糞添加對(duì)土壤微生物生物量碳、微生物生物量氮、β-1,4-葡萄糖苷酶、β-1,4-木糖苷酶和脲酶的影響Figure 3 Effects of yak dung deposition on soil microbial biomass carbon, microbial biomass nitrogen,β-1,4-glucosidase,β-1,4-xylosidase, and soil urease

3.3 牦牛糞添加對(duì)微生物生物量和酶活性的影響

本研究表明，牦牛糞添加顯著增加了土壤MBC和MBN含量，表明微生物利用牦牛糞便提供的碳和養(yǎng)分用于其生長(zhǎng)和代謝的底物。牦牛糞為土壤提供了大量外源性養(yǎng)分和易于利用的碳，從而增加了微生物生物量碳/氮。同時(shí)，牦牛糞添加顯著增加了BG，BX和URE酶活性，其他研究也得到了類似的結(jié)果[16,43]。土壤酶活性的增加主要?dú)w因于牦牛糞添加的可利用性有機(jī)物[43]。因此，牦牛糞沉積可以促進(jìn)放牧高寒草地土壤碳的礦化和養(yǎng)分循環(huán)。

3.4 土壤理化性質(zhì)，微生物量和酶活性之間的關(guān)系

土壤水分含量和pH在調(diào)節(jié)微生物活性方面起著重要的作用[44]。然而，在本研究中，土壤水分含量的變化并未引起酶活性的變化。可能是因?yàn)樵谡麄€(gè)研究期間，降水相對(duì)充足，盡管牦牛糞的添加總體上增加了土壤水分含量，但僅在第2次采樣時(shí)才出現(xiàn)顯著增加。此外，在本研究中土壤pH對(duì)土壤酶活性變化的影響較小，可能是因?yàn)殛笈＜S添加對(duì)土壤pH的影響較小。

圖4 土壤理化性質(zhì)及微生物生物量與酶活性冗余分析(RDA)Figure 4 Redundancy analysis(RDA)of soil physicochemical properties,microbial biomass,and enzymeactivities

通過RDA分析發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)的可利用性(DOC和DON)是土壤酶活性變異的重要控制因子。這可能是因?yàn)镈OC和DON包含了不同分子量的酶促反應(yīng)的底物和最終產(chǎn)物[45]。糞便中的DOC和DON滲入土壤增加了微生物生長(zhǎng)所需的底物并提高了酶的活性[46-47]。微生物生物量也是酶活性變異的重要控制因子。在其他研究中也得到了相同的結(jié)果[18]。此外，牦牛糞添加導(dǎo)致的基質(zhì)可利用性的變化比土壤微生物生物量的變化在調(diào)控土壤酶活性中起著更重要的作用。在高寒草地，可溶性碳和養(yǎng)分含量相對(duì)有限，基質(zhì)的可利用性可能是限制微生物生長(zhǎng)及酶活性的最重要因素[48]。但值得注意的是，本次僅研究了短期內(nèi)牦牛糞的分解，將來的研究應(yīng)擴(kuò)展至完全分解周期，以便全面深入了解牦牛糞分解在青藏高原放牧高寒草地土壤過程中的作用。

4 結(jié)論

牦牛糞添加顯著增加了土壤水分含量以及土壤DOC和DON含量，降低了土壤的pH。同時(shí)，牦牛糞添加顯著增加了土壤微生物生物量和酶活性。本研究結(jié)果表明，基質(zhì)的可利用性和微生物生物量是控制土壤酶活性的關(guān)鍵因素?？傊?，牦牛糞的短期分解能夠增加土壤可利用性基質(zhì)和養(yǎng)分，促進(jìn)土壤微生物活性及其酶的產(chǎn)生，對(duì)青藏高原高寒草地生態(tài)系統(tǒng)功能的維持具有重要的作用。