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    七氟烷預處理聯(lián)合后處理對大鼠肺缺血再灌注損傷時核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)及內(nèi)皮素-1(ET-1)的影響

    2021-06-18 00:47:30常文麗
    吉林醫(yī)學 2021年6期
    關(guān)鍵詞:后處理

    杜 寧,于 飛,常文麗

    (濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院,山東 濱州 256600)

    減輕肺缺血再灌注損傷治療是目前研究的熱點。七氟烷在臨床麻醉工作中應用廣泛,七氟烷預處理對肺組織的缺血再灌注損傷有減輕作用,但相關(guān)機制不明確。有研究報道,組織損傷時ET-1大量釋放,ET-1介導的炎性反應、氧化應激等加重組織損傷[1]。組織缺血再灌注損傷復雜反應中,NF-κB[2]在這過程中發(fā)揮重要作用,NF-κB能調(diào)控上游的炎性介質(zhì),其調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物又是缺血再灌注損傷炎性反應的主要炎性介質(zhì),因而其可能成為缺血再灌注損傷時炎性反應調(diào)節(jié)的樞紐。本研究擬探討肺缺血再灌注損傷對NF-κB p65 mRNA及ET-1表達影響,從而闡述肺組織的缺血再灌注的損傷可能機制。

    1 資料與方法

    1.1一般資料:實驗動物及分組:選取54只成年并且健康的SD大鼠(由來自新疆醫(yī)科大學的動物實驗室,本次研究經(jīng)過醫(yī)學倫理委員會同意),體重維持在250~350 g。按照隨機對照原則進行分組,共分為三組(n=18):假手術(shù)組(S組)、肺缺血再灌注組(I/R組)、七氟烷預處理與后處理聯(lián)合組(SPr+o組)。

    1.2模型的制備:按照Bellido-Reyee YA提出的改良的Epinger方法[3]制備肺缺血再灌注損傷模型。腹腔注射烏拉坦麻醉,麻醉效果滿意后,大鼠采取仰臥位,用線繩固定四肢,頸部備皮后采取正中切口,玻璃分離鉗分離出氣管、頸靜脈,小號手術(shù)刀謹慎行如下操作:氣管切開、氣管插管以及頸靜脈插管,接呼吸機行機械通氣(成都泰盟科技有限公司),選擇潮氣量大小為10~15 ml/kg,通氣頻率為70~80次/min,吸∶呼比為4∶5,靜脈輸注0.6 mg/(kg·h)的維庫溴銨,大鼠給予30 min呼吸機輔助通氣,采取右側(cè)臥位,分離鉗從大鼠左側(cè)第5肋間入胸腔,分離出左肺門,注射50 U肝素,5 min后,于肺的呼氣末應用血管夾夾閉左側(cè)肺門。阻斷肺門45 min后,松開血管鉗,恢復血液灌注和通氣從而完成缺血再灌注模型。S組僅暴露大鼠左肺門;I/R組止血鉗阻斷大鼠的左肺門45 min松開止血夾,恢復血液灌注,制備大鼠的肺缺血再灌注的模型;Spr+o組在止血鉗夾閉前即缺血前給予2.1%七氟烷吸入30 min,純氧洗脫10 min,止血鉗阻斷左肺門45 min后,在松開止血鉗恢復血液灌注的同時吸入30 min的2.1%七氟烷,再灌注90 min。實驗結(jié)束后三組分別在再灌注30 min、60 min、120 min這三個時間點做心臟采血;取部分左肺組織進行甲醛固定,用石蠟包埋,液氮速凍后冰箱保存。

    1.3左肺組織W/D的測定:切肺組織(約100 g)稱濕重,再放在風箱(80℃)(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)12 h測干重,計算肺組織W/D比。

    1.4血漿ET-1含量測定:取部分冰箱保存血液,3 000 r/min離心10 min后取上清,用ELISA法測定ET-1的含量,ET-1測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

    1.5肺組織NF-κB p65 mRNA表達:肺組織在-80℃冰箱保存,取部分肺組織,采用Trizol法處理、分離、RNA沉淀、RNA洗滌、RNA溶解提取總RNA并測定其濃度和純度,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thremo公司)合成反轉(zhuǎn)錄cDNA,然后進行RT-PCR反應。核轉(zhuǎn)錄因子κB(424bp)上游引物:5'-GCGCATCCAGACCAACAATAA-3',下游引物:5'-GCCGAAGCTGCATGGACACT-3';β-actin(372bp)上游引物:5'-GCCATGTACGTAGCCATCCA-3',下游引物:5'-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3'。取5μlPCR產(chǎn)物點樣在2%的瓊脂糖凝膠進行電泳,用凝膠圖像分析系統(tǒng)(Bio—Rad公司,美國)掃描測定PCR擴增條帶的吸光度值,以核轉(zhuǎn)錄因子κB的條帶吸光度值與β-actin的條帶吸光度值的比值來表示NF-κB p65 mRNA的表達水平。

    1.6肺組織病理學檢查:取左肺上葉小組織塊,采用10%甲醛予以固定,采用石蠟包埋,組織切片,蘇木精—伊紅染色法染色,光鏡下觀察肺組織形態(tài)學的變化。

    2 結(jié)果

    2.1七氟烷預處理聯(lián)合后處理對肺組織濕干重比(W/D)的影響:與S組比較,Spr+o組和I/R組在缺血再灌注各時點肺組織W/D比值升高(P<0.05)。與I/R組比較,Spr+o組在缺血再灌注各時點W/D比值降低(P<0.05)。與在缺血再灌注30 min比較,再灌注60 min、120 min時I/R組和Spr+o組肺組織W/D比值均升高(P<0.05)。與在缺血再灌60 min時比較,再灌注120 min時I/R組和Spr+o組肺組織W/D比值升高(P<0.05)。S組上述W/D比值在再灌注30 min、60 min、120 min比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表1。

    表1 三組大鼠各時點肺組織W/D表達水平的比較

    2.2七氟烷預處理聯(lián)合后處理對肺ET-1及NF-κB p65 mRNA的影響:與S組比較,Spr+o組和I/R組在缺血再灌注30 min、60 min、120 min時點ET-1及NF-κB p65 mRNA增高(P<0.05)。與I/R組比較,Spr+o組在缺血再灌注30 min、60 min、120 min時點ET-1及NF-κB p65 mRNA下降(P<0.05)。與再灌注30 min相比,再灌注60 min,120 min時I/R組和Spr+o組ET-1及NF-κB p65 mRNA都升高(P<0.05)。與再灌60 min時比較,再灌注120 min時I/R組和Spr+o組ET-1及NF-κB p65 mRNA都升高(P<0.05)。S組上述指標在缺血再灌注30 min、60 min、120 min時點比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表2。

    表2 三組大鼠各時點血漿ET-1、肺組織NF-κB p65 mRNA表達水平的比較

    2.3肺組織形態(tài)學觀察:光鏡下觀察:S組肺組織和肺間隔比較完整,炎性反應滲出比較少,炎性細胞、紅細胞較少。IR組在再灌注后肺組織結(jié)構(gòu)破壞較為嚴重,部分組織細胞壞死,炎性細胞浸潤,肺泡腔內(nèi)有滲出的紅細胞、炎性細胞(見圖1)。Spr+o組肺組織損傷的病理改變較IR組明顯減輕,紅細胞、炎細胞滲出減少。

    注:A為S組再灌注30 min時;B為S組再灌注60 min時;C為S組再灌注120 min時;D為I/R組再灌注30 min時;E為I/R組再灌注60 min時;F為I/R組再灌注120 min時;G為SPr+o組再灌注30 min時;H為SPr+o組再灌注60 min時;I為SPr+o組再灌注120 min時

    3 討論

    目前,缺血再灌注損傷在心、腦、腎等臟器的研究中較廣泛[4-5],但肺缺血再灌注損傷機理尚不清楚。有研究報道,NF-κB參與了心肌缺血再灌注損傷,同時也證實NF-κB的抑制物在心臟缺血再灌注損傷起到了保護作用[6]。缺血再灌注損傷機理復雜,包括凋亡、炎性反應、氧自由基等機理參與,而最近報道中發(fā)現(xiàn)NF-κB是復雜的機理中的“焦點”,NF-κB 轉(zhuǎn)錄的炎性介質(zhì)和細胞因子,如TNF-α、IL-8,在缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要的作用,且這些炎性因子與 NF-κB構(gòu)成正反饋調(diào)節(jié)環(huán),即誘導產(chǎn)生的炎性因子可進一步刺激更多NF-κB 通路的開放,這對炎性反應發(fā)揮了級聯(lián)放大的作用,加重了組織的損傷。缺血再灌注損傷中微循環(huán)障礙發(fā)揮重要作用,肺缺血再灌注時,NF-κB介導的大量炎性細胞釋放,破壞了內(nèi)皮細胞的完整性,血管壁通透性增加,導致肺組織的損傷與水腫[7]。NF-κB促進炎性介質(zhì)大量釋放及誘導微循環(huán)障礙,成為缺血再灌注損傷的樞紐。NF-κB調(diào)控的下游基因已證實ET-1等基因的啟動子區(qū)域或其上游臨近區(qū)域存在結(jié)合位點[8],這些證據(jù)都說明能夠直接或間接的在基因轉(zhuǎn)錄水平上,調(diào)控表達。

    ET 在肺損傷發(fā)揮重要作用,其機理可能如下:①ET誘導鈣離子內(nèi)流導致鈣超載引起縮血管效應,導致組織缺血、缺氧;②ET 增加氧自由基釋放,一方面促白細胞聚集產(chǎn)生氧自由基,另一方面 ET 引起鈣超載會進一步促進炎性細胞釋放包括氧自由基在內(nèi)的促炎介質(zhì),導致?lián)p傷組織細胞;③ET 可引起中性粒細胞在組織聚集,造成器官損害。有研究報道,ET-1可以加重肺臟的缺血再灌注損傷[9]。而研究發(fā)現(xiàn)ET-1拮抗劑減輕肺缺血再灌注損傷[10]。

    綜上所述,肺缺血再灌注損傷時肺組織的W/D比在再灌注30 min、60 min、120 min時點均升高,提示肺毛細血管的通透性增高。缺血在灌注損傷的肺組織HE染色見IR組再灌注后肺組織結(jié)構(gòu)破壞,炎性細胞浸潤,肺泡腔內(nèi)大量滲出的紅細胞、炎性細胞。NF-κB及ET-1在IR時表達均顯著升高,提示炎性反應在肺組織的缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用。七氟烷預處理聯(lián)合后處理組NF-κB及ET-1表達水平較IR組下降,提示七氟烷預處理聯(lián)合后處理減少肺組織局部中性粒細胞浸潤,減輕炎性反應,減輕肺水腫,從而起到保護肺組織作用。

    通過本實驗的研究,我們認為七氟烷預處理聯(lián)合后處理可以減輕大鼠肺的缺血再灌注損傷,其減輕對再灌注后肺組織損傷機制可能與減少 NF-κB及ET-1的表達有關(guān)。

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