七氟烷預處理聯(lián)合后處理對大鼠肺缺血再灌注損傷時核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)及內(nèi)皮素-1(ET-1)的影響

杜 寧,于 飛，常文麗

(濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院，山東 濱州 256600)

減輕肺缺血再灌注損傷治療是目前研究的熱點。七氟烷在臨床麻醉工作中應用廣泛，七氟烷預處理對肺組織的缺血再灌注損傷有減輕作用，但相關(guān)機制不明確。有研究報道，組織損傷時ET-1大量釋放，ET-1介導的炎性反應、氧化應激等加重組織損傷[1]。組織缺血再灌注損傷復雜反應中，NF-κB[2]在這過程中發(fā)揮重要作用，NF-κB能調(diào)控上游的炎性介質(zhì)，其調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物又是缺血再灌注損傷炎性反應的主要炎性介質(zhì)，因而其可能成為缺血再灌注損傷時炎性反應調(diào)節(jié)的樞紐。本研究擬探討肺缺血再灌注損傷對NF-κB p65 mRNA及ET-1表達影響，從而闡述肺組織的缺血再灌注的損傷可能機制。

1 資料與方法

1.1一般資料：實驗動物及分組：選取54只成年并且健康的SD大鼠(由來自新疆醫(yī)科大學的動物實驗室，本次研究經(jīng)過醫(yī)學倫理委員會同意)，體重維持在250～350 g。按照隨機對照原則進行分組，共分為三組(n=18):假手術(shù)組(S組)、肺缺血再灌注組(I/R組)、七氟烷預處理與后處理聯(lián)合組(SPr+o組)。

1.2模型的制備：按照Bellido-Reyee YA提出的改良的Epinger方法[3]制備肺缺血再灌注損傷模型。腹腔注射烏拉坦麻醉，麻醉效果滿意后，大鼠采取仰臥位，用線繩固定四肢，頸部備皮后采取正中切口，玻璃分離鉗分離出氣管、頸靜脈，小號手術(shù)刀謹慎行如下操作：氣管切開、氣管插管以及頸靜脈插管，接呼吸機行機械通氣(成都泰盟科技有限公司)，選擇潮氣量大小為10～15 ml/kg，通氣頻率為70～80次/min，吸∶呼比為4∶5，靜脈輸注0.6 mg/(kg·h)的維庫溴銨，大鼠給予30 min呼吸機輔助通氣，采取右側(cè)臥位，分離鉗從大鼠左側(cè)第5肋間入胸腔，分離出左肺門，注射50 U肝素，5 min后，于肺的呼氣末應用血管夾夾閉左側(cè)肺門。阻斷肺門45 min后，松開血管鉗，恢復血液灌注和通氣從而完成缺血再灌注模型。S組僅暴露大鼠左肺門；I/R組止血鉗阻斷大鼠的左肺門45 min松開止血夾，恢復血液灌注，制備大鼠的肺缺血再灌注的模型；Spr+o組在止血鉗夾閉前即缺血前給予2.1%七氟烷吸入30 min，純氧洗脫10 min，止血鉗阻斷左肺門45 min后，在松開止血鉗恢復血液灌注的同時吸入30 min的2.1%七氟烷，再灌注90 min。實驗結(jié)束后三組分別在再灌注30 min、60 min、120 min這三個時間點做心臟采血；取部分左肺組織進行甲醛固定，用石蠟包埋，液氮速凍后冰箱保存。

1.3左肺組織W/D的測定:切肺組織(約100 g)稱濕重,再放在風箱(80℃)(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)12 h測干重,計算肺組織W/D比。

1.4血漿ET-1含量測定:取部分冰箱保存血液，3 000 r/min離心10 min后取上清，用ELISA法測定ET-1的含量，ET-1測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.5肺組織NF-κB p65 mRNA表達：肺組織在-80℃冰箱保存，取部分肺組織，采用Trizol法處理、分離、RNA沉淀、RNA洗滌、RNA溶解提取總RNA并測定其濃度和純度，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thremo公司)合成反轉(zhuǎn)錄cDNA，然后進行RT-PCR反應。核轉(zhuǎn)錄因子κB(424bp)上游引物：5'-GCGCATCCAGACCAACAATAA-3'，下游引物：5'-GCCGAAGCTGCATGGACACT-3'；β-actin(372bp)上游引物：5'-GCCATGTACGTAGCCATCCA-3'，下游引物：5'-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3'。取5μlPCR產(chǎn)物點樣在2%的瓊脂糖凝膠進行電泳，用凝膠圖像分析系統(tǒng)(Bio—Rad公司，美國)掃描測定PCR擴增條帶的吸光度值，以核轉(zhuǎn)錄因子κB的條帶吸光度值與β-actin的條帶吸光度值的比值來表示NF-κB p65 mRNA的表達水平。

1.6肺組織病理學檢查：取左肺上葉小組織塊，采用10%甲醛予以固定，采用石蠟包埋，組織切片，蘇木精—伊紅染色法染色，光鏡下觀察肺組織形態(tài)學的變化。

2 結(jié)果

2.1七氟烷預處理聯(lián)合后處理對肺組織濕干重比(W/D)的影響：與S組比較，Spr+o組和I/R組在缺血再灌注各時點肺組織W/D比值升高(P<0.05)。與I/R組比較，Spr+o組在缺血再灌注各時點W/D比值降低(P<0.05)。與在缺血再灌注30 min比較，再灌注60 min、120 min時I/R組和Spr+o組肺組織W/D比值均升高(P<0.05)。與在缺血再灌60 min時比較，再灌注120 min時I/R組和Spr+o組肺組織W/D比值升高(P<0.05)。S組上述W/D比值在再灌注30 min、60 min、120 min比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 三組大鼠各時點肺組織W/D表達水平的比較

2.2七氟烷預處理聯(lián)合后處理對肺ET-1及NF-κB p65 mRNA的影響：與S組比較，Spr+o組和I/R組在缺血再灌注30 min、60 min、120 min時點ET-1及NF-κB p65 mRNA增高(P<0.05)。與I/R組比較，Spr+o組在缺血再灌注30 min、60 min、120 min時點ET-1及NF-κB p65 mRNA下降(P<0.05)。與再灌注30 min相比，再灌注60 min，120 min時I/R組和Spr+o組ET-1及NF-κB p65 mRNA都升高(P<0.05)。與再灌60 min時比較，再灌注120 min時I/R組和Spr+o組ET-1及NF-κB p65 mRNA都升高(P<0.05)。S組上述指標在缺血再灌注30 min、60 min、120 min時點比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 三組大鼠各時點血漿ET-1、肺組織NF-κB p65 mRNA表達水平的比較

2.3肺組織形態(tài)學觀察：光鏡下觀察：S組肺組織和肺間隔比較完整，炎性反應滲出比較少，炎性細胞、紅細胞較少。IR組在再灌注后肺組織結(jié)構(gòu)破壞較為嚴重，部分組織細胞壞死，炎性細胞浸潤，肺泡腔內(nèi)有滲出的紅細胞、炎性細胞(見圖1)。Spr+o組肺組織損傷的病理改變較IR組明顯減輕，紅細胞、炎細胞滲出減少。

注：A為S組再灌注30 min時；B為S組再灌注60 min時；C為S組再灌注120 min時；D為I/R組再灌注30 min時；E為I/R組再灌注60 min時；F為I/R組再灌注120 min時；G為SPr+o組再灌注30 min時；H為SPr+o組再灌注60 min時；I為SPr+o組再灌注120 min時

3 討論

目前，缺血再灌注損傷在心、腦、腎等臟器的研究中較廣泛[4-5]，但肺缺血再灌注損傷機理尚不清楚。有研究報道，NF-κB參與了心肌缺血再灌注損傷，同時也證實NF-κB的抑制物在心臟缺血再灌注損傷起到了保護作用[6]。缺血再灌注損傷機理復雜，包括凋亡、炎性反應、氧自由基等機理參與，而最近報道中發(fā)現(xiàn)NF-κB是復雜的機理中的“焦點”，NF-κB 轉(zhuǎn)錄的炎性介質(zhì)和細胞因子，如TNF-α、IL-8，在缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要的作用，且這些炎性因子與 NF-κB構(gòu)成正反饋調(diào)節(jié)環(huán)，即誘導產(chǎn)生的炎性因子可進一步刺激更多NF-κB 通路的開放，這對炎性反應發(fā)揮了級聯(lián)放大的作用，加重了組織的損傷。缺血再灌注損傷中微循環(huán)障礙發(fā)揮重要作用，肺缺血再灌注時，NF-κB介導的大量炎性細胞釋放，破壞了內(nèi)皮細胞的完整性，血管壁通透性增加，導致肺組織的損傷與水腫[7]。NF-κB促進炎性介質(zhì)大量釋放及誘導微循環(huán)障礙，成為缺血再灌注損傷的樞紐。NF-κB調(diào)控的下游基因已證實ET-1等基因的啟動子區(qū)域或其上游臨近區(qū)域存在結(jié)合位點[8],這些證據(jù)都說明能夠直接或間接的在基因轉(zhuǎn)錄水平上，調(diào)控表達。

ET 在肺損傷發(fā)揮重要作用，其機理可能如下：①ET誘導鈣離子內(nèi)流導致鈣超載引起縮血管效應，導致組織缺血、缺氧；②ET 增加氧自由基釋放，一方面促白細胞聚集產(chǎn)生氧自由基，另一方面 ET 引起鈣超載會進一步促進炎性細胞釋放包括氧自由基在內(nèi)的促炎介質(zhì)，導致?lián)p傷組織細胞；③ET 可引起中性粒細胞在組織聚集，造成器官損害。有研究報道，ET-1可以加重肺臟的缺血再灌注損傷[9]。而研究發(fā)現(xiàn)ET-1拮抗劑減輕肺缺血再灌注損傷[10]。

綜上所述，肺缺血再灌注損傷時肺組織的W/D比在再灌注30 min、60 min、120 min時點均升高，提示肺毛細血管的通透性增高。缺血在灌注損傷的肺組織HE染色見IR組再灌注后肺組織結(jié)構(gòu)破壞，炎性細胞浸潤，肺泡腔內(nèi)大量滲出的紅細胞、炎性細胞。NF-κB及ET-1在IR時表達均顯著升高，提示炎性反應在肺組織的缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用。七氟烷預處理聯(lián)合后處理組NF-κB及ET-1表達水平較IR組下降，提示七氟烷預處理聯(lián)合后處理減少肺組織局部中性粒細胞浸潤,減輕炎性反應,減輕肺水腫,從而起到保護肺組織作用。

通過本實驗的研究,我們認為七氟烷預處理聯(lián)合后處理可以減輕大鼠肺的缺血再灌注損傷,其減輕對再灌注后肺組織損傷機制可能與減少 NF-κB及ET-1的表達有關(guān)。