海洋來源產(chǎn)低溫幾丁質(zhì)酶菌株的誘變選育及酶學(xué)性質(zhì)研究

陳立功，吳家葳，張金平，張慶芳，遲乃玉，王曉輝，王夢雨

（大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，大連市合成生物學(xué)重點實驗室，遼寧大連 116600）

幾丁質(zhì)（chitin）是地球上含量僅次于纖維素的可再生資源，在海洋當(dāng)中含量十分豐富[1-3]。它廣泛存在于動植物及微生物中，在蝦蟹殼中的含量極高，隨著海洋中蝦蟹的死亡逐步累積，主要靠海洋中微生物分泌的幾丁質(zhì)酶完成降解[4-7]。但由于自然狀態(tài)下，幾丁質(zhì)多以晶體狀態(tài)存在，性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于水，自然狀態(tài)下不易降解，所以降解速度遠遠趕不上產(chǎn)生的速度[8-9]。幾丁質(zhì)酶（chitinase，EC 3.2.1.14）廣泛存在于自然界的各種生物體中，能夠降解幾丁質(zhì)生成幾丁寡糖、幾丁單糖及其衍生物，這些降解產(chǎn)物由于具有良好的組織兼容性及免疫抗菌作用被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[10-12]。

從自然環(huán)境中篩選到的野生菌往往產(chǎn)酶活性不高，人們往往通過誘變育種的方式來選育產(chǎn)酶活性高的菌株。根據(jù)方式不同分為物理誘變和化學(xué)誘變，物理誘變中比較常用的為輻射誘變，即用β射線等射線、粒子或紫外照射誘發(fā)菌株變異[13-15]。化學(xué)誘變是利用化學(xué)誘變劑對菌株進行處理，使其發(fā)生基因突變，常用的化學(xué)誘變劑有硫酸二乙酯、乙烯亞胺、亞硝酸鈉等[16]。為達到更好的誘變效果，往往選擇兩種或多種方法進行誘變，稱之為復(fù)合誘變。

本研究對產(chǎn)低溫幾丁質(zhì)酶菌株P(guān)hotobacteriumsp.LG-1進行了BIOLOG生理生化實驗，確定了菌株對碳源的利用嗜好性和對化學(xué)物質(zhì)的敏感程度，為提高其產(chǎn)酶活性，對菌株進行了誘變選育，并對菌株LG-1酶學(xué)性質(zhì)及抑菌特性進行了初步研究，為低溫幾丁質(zhì)酶在工、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

產(chǎn)低溫幾丁質(zhì)酶菌株 實驗室前期從中國遼寧大連渤海海域5～100 m（123°391′E，39°6972′N）篩選得到，命名為Photobacteriumsp.LG-1[17]；篩選培養(yǎng)基 膠體幾丁質(zhì)1.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，K2HPO45.0 g/L，KH2PO45.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，MgSO4·7H2O 5.0 g/L, ZnSO4·7H2O 5.0 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 5.0 g/L，瓊脂1.5%～2.0%，海水，pH 7.0；2216E種子培養(yǎng)基牛肉膏5.0 g/L，胰蛋白胨5.0 g/L，原地海水配制，pH自然；粉狀幾丁質(zhì)培養(yǎng)基 粉狀幾丁質(zhì)5.0 g/L，胰蛋白胨5.0 g/L，原地海水配制，pH自然；幾丁質(zhì)粉（chitin）、N-乙酰氨基葡萄糖 美國Sigma公司；胰蛋白胨（Tryptone） 生工生物工程（上海）股份有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 北京索萊寶科技有限公司；其它試劑 均為國產(chǎn)分析純試劑。

LTI-700低溫恒溫培養(yǎng)箱 上海愛朗儀器有限公司；DK-S26電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；CRY-2112恒溫搖床 上海茸研儀器有限公司；Thermo Multiskan1510酶標(biāo)儀 芬蘭Labsystems公司；GEN III Microstation全自動微生物鑒定儀 美國BIOLOG公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 LG-1的BIOLOG生理生化實驗 將LG-1劃線到BUG培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后，用無菌棉簽蘸取單菌落至培養(yǎng)液B中，透光度98%，接入GenⅢ微孔板于33 ℃培養(yǎng)37 h，使用BIOLOG MicroStation儀器進行讀數(shù)，根據(jù)最終獲得的表型指紋同BIOLOG數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行比較，以判斷菌株對碳源的利用嗜好性和對化學(xué)物質(zhì)的敏感程度。

1.2.2 酶活測定 取發(fā)酵液10000 r/min離心5 min，取0.5 mL上清，與0.5 mL 1%膠體幾丁質(zhì)混合，25 ℃下保溫15 min，10000 r/min離心5 min，取上清200 μL煮沸5 min，冷卻后，加入200 μL DNS溶液煮沸5 min，冷卻后加入600 μL超純水，10000 r/min離心10 min，取200 μL于96空板中測定OD520，設(shè)3個重復(fù)，取平均值，酶活單位定義（U）：在上述條件下，催化產(chǎn)生l μmol N-乙酰-D-氨基葡萄糖所需的酶量[17]。

1.2.3 膠體幾丁質(zhì)的制備 根據(jù)王曉輝等[18]的方法進行1%膠體幾丁質(zhì)的制備：取10 g幾丁質(zhì)置于研缽，緩慢加入100 mL濃鹽酸并不斷攪拌1 h，保鮮膜封口后于冰箱4 ℃下過夜。大量超純水反復(fù)洗至中性，離心后用0.1 moL/L磷酸緩沖液定容為1 L。

1.2.4 酶活曲線測定 挑取LG-1單菌落接種于5 mL種子培養(yǎng)基，20 ℃、160 r/min培養(yǎng)24 h。種子液以1%的接種量轉(zhuǎn)接于100 mL粉狀幾丁質(zhì)培養(yǎng)基，20 ℃、160 r/min培養(yǎng)，每隔24 h取樣測定酶活性。三組平行實驗。

1.2.5 菌株誘變育種

1.2.5.1 菌懸液制備 挑取單菌落接種于5 mL種子培養(yǎng)基，20 ℃、160 r/min培養(yǎng)24 h。種子液以1%的接種量轉(zhuǎn)接于100 mL 2216E培養(yǎng)基，20 ℃、160 r/min培養(yǎng)，由實驗室前期試驗[17]可知菌株LG-1在該培養(yǎng)條件下，12～52 h為對數(shù)生長期，此階段菌株生長情況良好，取36 h菌液4000 r/min離心10 min，沉淀用無菌海水稀釋至菌體濃度為105cell/mL，作為菌株誘變育種的初始菌懸液。

1.2.5.2 紫外誘變 實驗前將紫外燈功率調(diào)至20 W并打開預(yù)熱20 min，吸取10 mL菌懸液至無菌培養(yǎng)皿中，并將培養(yǎng)皿置于100 r/min磁力攪拌器上使用無菌轉(zhuǎn)子緩慢攪拌。將紫外燈置于無菌培養(yǎng)皿上方30 cm處照射，每隔1 min取100 μL菌懸液均勻涂布至篩選培養(yǎng)基上，20 ℃培養(yǎng)3 d[19-20]。以未照射的菌懸液作為對照組，統(tǒng)計誘變前后的菌落數(shù)量，計算致死率，選擇致死率80%～90%的平板挑取透明圈較大的菌株接種于5 mL種子培養(yǎng)基，20 ℃、160 r/min培養(yǎng)24 h。種子液以1%的接種量轉(zhuǎn)接于100 mL粉狀幾丁質(zhì)培養(yǎng)基，20 ℃、160 r/min培養(yǎng)96 h，測酶活并計算酶活提高率。致死率及酶活提高率計算公式如下：

1.2.5.3 化學(xué)誘變 在3.5 mL菌懸液中加入1 mL的硫酸二乙酯和0.5mL的無水乙醇，混合均勻后每隔5 min加入0.5 mL 25%硫代硫酸鈉溶液終止反應(yīng)，對照組加入等量無菌水處理。取100 μL菌懸液均勻涂布至篩選培養(yǎng)基上，20 ℃培養(yǎng)3 d，統(tǒng)計菌落數(shù)量[20]，按照式（1）計算致死率，選擇致死率80%～90%的平板，挑取透明圈較大的菌株接種于5 mL種子培養(yǎng)基，20 ℃、160 r/min培養(yǎng)24 h。種子液以1%的接種量轉(zhuǎn)接于100 mL粉狀幾丁質(zhì)培養(yǎng)基，20 ℃、160 r/min培養(yǎng)96 h，測酶活并按照式（2）計算酶活提高率。

1.2.5.4 復(fù)合誘變 以方法1.2.5.2中紫外誘變所得產(chǎn)低溫幾丁質(zhì)酶活最高的菌株作為出發(fā)菌株，按照方法1.2.5.1制備菌懸液，菌體濃度為105cell/mL；按照方法1.2.5.3進行化學(xué)誘變，計算致死率并選擇致死率80%～90%的平板，挑取透明圈較大的菌株發(fā)酵測酶活。

1.2.5.5 遺傳穩(wěn)定性測定 分別選擇紫外誘變、化學(xué)誘變和復(fù)合誘變后酶活最高的菌株進行連續(xù)傳代培養(yǎng)，測其酶活，確定誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.6 低溫幾丁質(zhì)酶的酶學(xué)性質(zhì)研究 菌株LG-1在粉狀幾丁質(zhì)培養(yǎng)基中20 ℃、160 r/min培養(yǎng)96 h，10000 r/min離心5min，取上清液進行酶學(xué)性質(zhì)研究。

1.2.6.1 最適溫度和溫度穩(wěn)定性 為研究溫度對幾丁質(zhì)酶活的影響，在0～65 °C溫度下反應(yīng)后測酶活。以酶活最大值為100%，根據(jù)酶在不同溫度下相對活性繪制曲線，確定酶的最適反應(yīng)溫度。同時，將粗酶液分別置于0～65 °C下保溫1 h，然后在最適反應(yīng)pH和最適反應(yīng)溫度下檢測殘余酶活，與未經(jīng)過處理的酶液進行比較，繪制相對活性曲線。

1.2.6.2 最適pH和pH穩(wěn)定性 在最適反應(yīng)溫度，pH3～12的50 mmol/L緩沖液（pH3.0～5.0 phosphatecitrate、pH6.0～10.0 Tris-HCl、pH11.0～12.0 Na2HPO4-NaOH）中測定酶活，以酶活最大值為100%，根據(jù)酶在不同pH下的相對活性繪制曲線，確定酶的最適反應(yīng)pH。同時，將粗酶液分別置于50 mmol/L不同pH緩沖液（pH3.0～5.0 phosphate-citrate、pH6.0～10.0 Tris-HCl、pH11.0～12.0 Na2HPO4-NaOH）中，20 °C下保溫1 h，然后在最適反應(yīng)pH和最適反應(yīng)溫度下檢測殘余酶活，與未經(jīng)過處理的酶液進行比較，繪制相對活性曲線。

1.2.6.3 不同濃度金屬離子及化學(xué)試劑對酶活的影響 在酶活測定反應(yīng)體系中分別加入終濃度為1 或5 mmol/L的Ni2+、Mn2+、Ag+、Fe3+、Ca2+、K+、Mg2+、Cu2+、Fe2+、Na+、Zn2+等金屬離子或β-mercaptoethanol（β-巰基乙醇）、尿素（Urea）、EDTA、Triton-100、Tween-80、2,3-butanedione（2,3-丁二酮）、保險粉、SDS、DTT等化學(xué)試劑。對照組加入相應(yīng)體積的無菌水，測定酶活，計算相對活性。

1.2.7 抑菌性試驗 參照Han等[21]和Mehmoo等[22]的方法，通過研究抑制孢子萌發(fā)實驗測定LG-1抑菌活性。具體方法如下：將長有毛霉、青霉、根霉、黑曲霉、玉米腐爛病、稻瘟病、棉花枯萎病的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基挑碎，用鑷子（滅菌）夾一塊至盛有1 mL無菌水的離心管中，劇烈震蕩2 min，制成孢子懸液。吸取100 μL孢子懸液涂布在固體發(fā)酵培養(yǎng)基上，然后用滅菌的玻璃棒蘸取LG-1菌體分別點接在培養(yǎng)基中央，20 ℃恒溫倒置培養(yǎng)5～7 d，觀察生長情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均為三組平行。使用GraphPad Prism 8.0.1軟件對誘變育種數(shù)據(jù)進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株LG-1的BIOLOG生理生化實驗

傳統(tǒng)菌株的生理生化實驗方法主要是依靠人操作進行的，該方法存在操作復(fù)雜、耗時長等問題。BIOLOG全自動微生物鑒定儀可檢測菌株對碳源的利用嗜好性和對化學(xué)物質(zhì)的敏感程度，操作簡單且迅速高效?；瘜W(xué)物質(zhì)敏感性試驗結(jié)果表明該菌適合在高鹽環(huán)境中生長，可能是因為菌株來源于海洋；微弱耐受醋竹桃霉素和萬古霉素，對低pH、D-絲氨酸、二甲胺四環(huán)素、林肯霉素、萘啶酮酸、氨曲南、及丁酸鈉不耐受。GenⅢ微孔板對該菌進行碳源的利用程度試驗陽性結(jié)果如下表1。可見該菌對糊精、D-麥芽糖、D-海藻糖、蔗糖、β-甲酰-D-葡糖苷、N-乙酰-D-葡糖胺、D-果糖、肌苷、D-甘露糖、甘油、明膠、氨基乙酰-L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-組氨酸、L-絲氨酸、D-葡糖酸、檸檬酸、L-蘋果酸、吐溫40、β-羥基-D,L丁酸、丙酸和乙酸利用良好，對α-D-葡萄糖、D-山梨醇、D-阿拉伯醇、果膠、葡糖醛酰胺、丙酮酸甲酯、溴-丁二酸、α-酮-丁酸及乙酰乙酸利用較佳，對其余的碳源利用不佳。由此可知該菌株可廣泛利用部分單糖、羧酸和脂肪酸，以及大部分氨基酸碳源。

2.2 菌株LG-1酶活曲線

自然界中幾丁質(zhì)含量十分豐富，大多以晶體結(jié)構(gòu)存在，相比于膠體幾丁質(zhì)，粉狀晶體幾丁質(zhì)因其結(jié)構(gòu)特性更不易被降解[23-25]。如圖1所示，在該培養(yǎng)條件下，菌株LG-1在24～96 h內(nèi)酶活急劇升高，96 h時酶活達到最大值為1.134 U/mL，比實驗室前期用膠體幾丁質(zhì)培養(yǎng)基測的最大酶活0.932 U/mL高20%以上[17]。96 h后，隨著培養(yǎng)時間增加，酶活逐步下降，但在240 h時，酶活仍為最大酶活的50%以上，360 h時，酶活仍為最大酶活的25%以上，說明菌株LG-1在該培養(yǎng)條件下可較長時間持續(xù)作用。確定菌株LG-1在該條件下的最適培養(yǎng)時間為96 h。

圖1 產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株LG-1酶活曲線Fig.1 Chitinase-producing LG-1 enzyme production

2.3 菌株誘變育種

2.3.1 紫外誘變 對菌株LG-1進行紫外誘變，致死率結(jié)果如圖2所示。隨著紫外燈照射時間的延長，菌株致死率不斷增加，照射14 min時，菌株致死率已高于60%，照射20 min后菌株致死率超過80%，照射22 min時致死率為85.19%。通常情況下致死率在80%～90%時正突變率較高[20]，因此選擇紫外照射22 min時平板上7株透明圈較大的單菌落進行發(fā)酵培養(yǎng)，測定幾丁質(zhì)酶活性。

由表2可知，7株紫外誘變后的菌株中，有4株菌酶活明顯提高，其中菌株LG-1-U-4酶活最高，為1.899 U/mL，與原始菌株LG-1相比，酶活提高率高達69.22%；誘變后有兩株菌酶活降低，其中菌株LG-1-U-6酶活降低最多，比原始菌株降低了30.57%。

圖2 菌株LG-1紫外誘變致死率Fig.2 Lethality rate of LG-1 induced by ultraviolet radiation

表2 紫外誘變菌株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活性Table 2 Chitinase activity of strain after UV mutagenesis

2.3.2 化學(xué)誘變 菌株LG-1經(jīng)化學(xué)誘變后，致死率如圖3所示。隨著化學(xué)試劑對菌株作用時間的延長，菌株致死率不斷增加，作用超過15 min后，菌株致死率急劇升高。誘變30 min后菌株致死率超過80%，誘變35 min時，致死率為86%。因此選擇誘變35 min時平板上6株透明圈較大的單菌落進行發(fā)酵培養(yǎng)，測定幾丁質(zhì)酶活性。

圖3 菌株LG-1化學(xué)誘變致死率Fig.3 Lethality rate of LG-1 induced by chemical mutagenesis

由表3可知，6株化學(xué)誘變后的菌株中，有5株菌酶活得到提高，與原始菌株LG-1相比，其中有4株菌酶活提高率超過20%。菌株LG-1-H-1酶活最高，為1.848 U/mL，酶活提高率高達64.74%；與紫外誘變相比，酶活提高率略有降低。

2.3.3 復(fù)合誘變 菌株LG-1-U-4比菌株LG-1-H-1酶活更高，因此對菌株LG-1-U-4進行化學(xué)誘變，完成菌株LG-1的復(fù)合誘變過程。按照式（1）計算致死率，結(jié)果如圖4所示。與菌株LG-1化學(xué)誘變致死率曲線相比，菌株LG-1-U-4在進行化學(xué)誘變時致死率更高、更快，誘變25 min時，致死率為84.34%，當(dāng)誘變時間超過35min后，菌株致死率為100%。所以菌株LG-1-U-4進行化學(xué)誘變時，不能選擇菌株LG-1化學(xué)誘變最佳時間35 min，而應(yīng)該為25 min。挑取透明圈較大的7株菌進行發(fā)酵培養(yǎng)，測酶活并按照式（2）計算酶活提高率。

表3 化學(xué)誘變菌株產(chǎn)GOD酶活Table 3 GOD activity of strain after chemical mutagenesis

圖4 菌株LG-1-U-4復(fù)合誘變致死率Fig.4 Lethality rate of LG-1-U-4 induced by composite mutagenesis

由表4可知，菌株LG-1-U-4經(jīng)化學(xué)誘變后，7株菌中有4株菌酶活降低，有3株菌酶活升高，其中菌株LG-1-F-4酶活最高，達2.690 U/mL。與菌株LG-1-U-4相比，菌株LG-1-F-4酶活提高率為41.65%，與原始菌株LG-1相比，酶活提高率高達139.78%。

表4 復(fù)合誘變菌株產(chǎn)GOD酶活Table 4 GOD activity of strain after composite mutagenesis

2.3.4 誘變菌株產(chǎn)酶遺傳穩(wěn)定性實驗 為獲得產(chǎn)酶穩(wěn)定的誘變菌株，對其進行連續(xù)10次傳代培養(yǎng)，確定其產(chǎn)酶遺傳穩(wěn)定性，結(jié)果如圖5所示。紫外誘變菌株LG-1-U-4遺傳穩(wěn)定性較差，在連續(xù)傳代4次后，酶活逐漸降低?；瘜W(xué)誘變菌株LG-1-H-1和復(fù)合誘變菌株LG-1-F-4遺傳穩(wěn)定性良好，在10次連續(xù)傳代過程中，酶活雖稍有波動，但均分別維持在1.848 和2.690 U/mL左右。

圖5 菌株遺傳穩(wěn)定性Fig.5 Genetic stability of strains

2.4 低溫幾丁質(zhì)酶的酶學(xué)性質(zhì)分析

2.4.1 最適溫度和溫度穩(wěn)定性

2.4.1.1 最適反應(yīng)溫度分析 由圖6最適溫度曲線可知，該酶在25～40 °C溫度內(nèi)有較高酶活，達到80%以上，最適反應(yīng)溫度為35°C；溫度低于或高于35℃，酶活都降低，但相對于升高溫度來說，降低溫度時，酶活降低的速度更慢。10°C時，酶活為最適溫度下酶活的30%以上，且在0°C時仍有酶活。在40～65°C溫度內(nèi)，隨著溫度的升高酶活力快速降低，50 °C時酶活力不足最適溫度下酶活的40%。

圖6 幾丁質(zhì)酶的最適溫度和溫度穩(wěn)定性Fig.6 Optimum temperature and thermal stability of the chitinase

2.4.1.2 熱穩(wěn)定性分析 由圖6熱穩(wěn)定性曲線可知，該酶在低于30 °C的環(huán)境下具有較好的熱穩(wěn)定性，保溫1 h處理后，酶活保留80%以上；在30 °C的環(huán)境下溫育1 h后，酶活仍保留65%以上。當(dāng)溫度高于40 °C時，酶的熱穩(wěn)定性急劇下降，50 °C溫育后，酶活僅剩余20%左右。

2.4.2 最適pH和pH穩(wěn)定性

2.4.2.1 最適反應(yīng)pH分析 由圖7最適pH曲線可知，該幾丁質(zhì)酶在pH 7.0～8.0環(huán)境下酶活性較高，達到85%以上，pH為8.0時，酶活性最高；當(dāng)pH小于7.0或大于8.0時，酶活急劇下降，但pH為9.0時，酶活仍為最大值的75%以上；pH為6.0時，酶活驟降至40%左右，pH為3.0～5.0時酶活低于40%；所以該幾丁質(zhì)酶在弱堿性環(huán)境中能更好的發(fā)揮作用。

圖7 幾丁質(zhì)酶的最適pH和pH穩(wěn)定性Fig.7 Optimum pH and pH stability of the chitinase

2.4.2.2 pH穩(wěn)定性分析 由圖7 pH穩(wěn)定性曲線可知，該幾丁質(zhì)酶在pH 7.0～9.0間較為穩(wěn)定，剩余酶活力在80%以上，當(dāng)pH為10.0時，相對酶活力剩余60%以上，pH為6.0時，相對酶活力剩余50%左右。當(dāng)pH小于5.0或大于11.0時，殘余酶活均小于35%，所以該酶適合保存在偏弱堿性的環(huán)境中。

2.4.3 不同濃度金屬離子及化學(xué)試劑對酶活的影響

如表5所示，Ca2+、K+、Mg2+、Cu2+、Na+均對幾丁質(zhì)酶活性有促進作用，Ca2+、K+、Mg2+和Na+在海洋中含量豐富，研究表明其對海洋低溫酶活性有顯著促進作用[18-19]。且Ca2+、K+、Na+濃度越高促進作用越明顯，濃度為5 mmol/L的Ca2+提高了將近60%的酶活性。而 5mmol/L的Mg2+和Cu2+對酶活的促進作用沒有濃度為1 mmol/L效果好，但濃度1 mmol/L的Cu2+提高了85%的酶活性。Ni2+、Mn2+、Ag+、Fe3+、Zn2+均對幾丁質(zhì)酶活性有不同程度的抑制作用，其中5 mmol/L的Fe3+和Zn2+抑制效果最明顯。由表5中不同濃度化學(xué)試劑對酶活的影響實驗結(jié)果可 知，不 同 濃 度 的β-mercaptoethanol、EDTA、Triton-100、Tween-80、2,3-butanedione、SDS和DTT對幾丁質(zhì)酶活性均有抑制作用，其中5 mmol/L的SDS幾乎使酶失活。高濃度的保險粉對酶活性抑制效果明顯，Urea對酶活性幾乎沒有影響。

2.5 LG-1抑菌性的定性研究

由圖8可知，菌株LG-1在涂有霉菌的培養(yǎng)基上生長7 d后，在根霉、黑曲霉、毛霉和玉米腐爛病的平板上產(chǎn)生明顯的抑菌圈，說明菌株LG-1對根霉、黑曲霉、毛霉和玉米腐爛病的生長有抑制效果。

3 結(jié)論與討論

目前，幾丁質(zhì)酶研究報道中多為中高溫幾丁質(zhì)酶，最適反應(yīng)溫度在40～50 ℃，在高溫下易失活，低溫下活性很低或無酶活[26-27]。本研究對實驗室前期篩選到的產(chǎn)低溫幾丁質(zhì)酶菌株P(guān)hotobacteriumsp.LG-1進行了BIOLOG生理生化實驗，確定該菌株可廣泛利用部分單糖、羧酸和脂肪酸，以及大部分氨基酸等碳源。化學(xué)物質(zhì)敏感性試驗結(jié)果表明該菌適合在高鹽環(huán)境中生長，對低pH不耐受。

表5 金屬離子及化學(xué)試劑對酶活的影響Table 5 Effects of metal ions and reagent on enzyme activity

圖8 菌株LG-1抑菌能力測定Fig.8 Antifungal activity of LG-1

為提高菌株LG-1產(chǎn)酶活性，對其進行了誘變育種，其中復(fù)合誘變效果最好，誘變后菌株LG-1-F-4酶活達2.690 U/mL，酶活提高率為139.78%，且菌株產(chǎn)酶遺傳穩(wěn)定性良好。紫外誘變比化學(xué)誘變酶活提高率略高，但菌株產(chǎn)酶遺傳穩(wěn)定性差，在傳代培養(yǎng)過程中，酶活降低。酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明，該幾丁質(zhì)酶最適反應(yīng)溫度為35 ℃，0 ℃仍具有催化活性，符合低溫酶特性；最適反應(yīng)pH為8.0，在偏堿性環(huán)境中有較好的穩(wěn)定性。金屬離子Ca2+、K+、Mg2+、Cu2+、Na+均對幾丁質(zhì)酶活性有促進作用。抑菌性試驗證明該菌對根霉、曲霉、毛霉和玉米腐爛病等有抑制活性。本研究可以為今后幾丁質(zhì)酶在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上實現(xiàn)生物防治及工業(yè)應(yīng)用等提供參考。