龍牙楤木中酚類物質(zhì)提取方法的比較

朱定波，徐 衛(wèi)

（重慶市第九人民醫(yī)院藥劑科，重慶 400700）

龍牙楤木（Aralia elata（Miq.） Seem.），別稱刺老芽，刺龍芽，是五加科（Araliaceae）楤木屬（Aralia）植物，廣泛分布于亞洲地區(qū)，在我國(guó)東北三省儲(chǔ)量極為豐富[1]。龍牙楤木是藥，食兼用植物，其根，樹皮，葉具有補(bǔ)氣安神，活血通絡(luò)，除濕止痛等功效[2]。常用于滋補(bǔ)，治療關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)衰弱、糖尿病、肝炎、心肌缺血等癥[3]。其嫩芽中含有人體必需的多種氨基酸和微量元素[4-5]。近年來(lái)，關(guān)于龍牙楤木的研究，主要集中在對(duì)其皂苷類化合物的分離、鑒定及藥理活性等相關(guān)研究[6-10]，以及具有抗輻射損傷、抗腫瘤及抗氧化等作用的多糖[11-12]，而對(duì)其酚類物質(zhì)研究較少[13-14]。

多酚是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的復(fù)雜酚類次生代謝產(chǎn)物，具有獨(dú)特化學(xué)結(jié)構(gòu)，在抗氧化、抑菌、延緩衰老、抑制心血管疾病及抗癌等方面表現(xiàn)出顯著功效[15-16]。因多酚在自然界分布的廣泛、儲(chǔ)量的豐富、生理功能的多樣，農(nóng)業(yè)、林業(yè)、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的眾多學(xué)者對(duì)多酚進(jìn)行了基礎(chǔ)和應(yīng)用研究[17]，其在醫(yī)藥、食品、保健品及日用化學(xué)品等方面得到了廣泛應(yīng)用。

本文采用溶劑浸提法、溶劑回流法、超聲輔助法、微波輔助法及復(fù)合酶法，提取龍牙楤木中酚類物質(zhì)，分析不同提取方法對(duì)龍牙楤木中酚類物質(zhì)得率的影響，并利用正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，確定最佳提取工藝參數(shù)，為開發(fā)利用龍牙楤木中酚類物質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

龍牙楤木嫩葉 于2019年5月中旬采自吉林白山長(zhǎng)白朝鮮族自治縣，由西北農(nóng)林科技大學(xué)生物學(xué)博士后徐洪宇鑒定為五加科植物龍牙楤木（Aralia elata(Miq.) Seem.）的葉片，45 ℃干燥、粉碎，過(guò)80目篩備用；復(fù)合植物水解酶ViscozymeL（非淀粉復(fù)合糖酶，含果膠酶和各種碳水化合物酶，包括阿拉伯聚糖酶、纖維素酶、半纖維素酶和木聚糖酶等）諾維信中國(guó)生物技術(shù)有限公司；福林酚 天津市大茂化學(xué)試劑廠；沒(méi)食子酸、蘆丁 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；亞硝酸鈉、無(wú)水乙醇、硝酸鋁、氫氧化鈉等

均為分析純。

FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；KQ3200DE型數(shù)控超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；722s可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；FA1004A型分析天平 上海精天電子儀器；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；DK-98-ⅡA型恒溫水浴鍋 天津泰斯特儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同提取方法對(duì)龍牙楤木中酚類物質(zhì)含量的影響

1.2.1.1 溶劑浸提法提取 參考Paz等[18]方法略作修改。稱取龍牙楤木粉末0.500 g于錐形瓶中，加10 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液（料液比1:20 g/mL），在室溫條件下浸提12 h，抽濾，收集提取液。重復(fù)上述提取3次，合并提取液，定容至50 mL，備用，測(cè)其總酚、總黃酮得率。

1.2.1.2 溶劑回流法提取 參考Paz等[18]方法，略作修改。稱取龍牙楤木粉末0.500 g于250 mL圓底燒瓶中，加100 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液（料液比為1:200 g/mL），加沸石，在80 ℃恒溫水浴鍋中回流1 h，抽濾，收集提取液。重復(fù)上述提取3次，合并提取液，濃縮，定容至50 mL，備用，測(cè)其總酚、總黃酮得率。

1.2.1.3 超聲輔助法提取 參考Persic等[19]方法，略作修改。稱取龍牙楤木粉末0.500 g于錐形瓶中，加10 mL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液（料液比1:20 g/mL），超聲（150 W）提取30 min，超聲溫度50 ℃，抽濾，收集提取液。重復(fù)上述提取3次，合并提取液，定容至50 mL，備用，測(cè)其總酚、總黃酮得率。

1.2.1.4 微波輔助法提取 參考Alonso-Castro等[20]加10 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液（料液比為1:20 g/mL），將錐形瓶置于微波爐中，在微波功率480 W，微波時(shí)間40 s，待樣品溶液冷卻至室溫，抽濾，收集提取液。重復(fù)上述提取3次，合并提取液，定容至50 mL，備用，測(cè)其總酚、總黃酮得率。

1.2.1.5 復(fù)合酶法提取 參考朱建星等[21]方法，略作修改。稱取龍牙楤木粉末0.500 g于錐形瓶中，加10 mL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液（料液比1:20 g/mL），pH為4.0，加入復(fù)合植物水解酶120 μL/g（酶量/樣品量），50 ℃條件下酶解2 h，90 ℃水浴滅酶10 min，抽濾，收集提取液，濾渣中加入10 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，室溫浸提1 h，抽濾，收集提取液。重復(fù)上述提取3次，合并提取液，濃縮，定容至50 mL，備用，測(cè)其總酚、總黃酮得率。

1.2.2 復(fù)合酶法提取單因素實(shí)驗(yàn) 在酶解pH為4.0，分別加入80、100、120、140、160 μL/g復(fù)合植物水解酶，50 ℃條件下酶解1 h，70%乙醇溶液浸提濾渣，考察酶用量對(duì)酚類物質(zhì)得率的影響。

在酶解pH為4.0，酶用量120 μL/g，分別在20、30、40、50、60 ℃條件下酶解1 h，70%乙醇溶液浸提濾渣，考查酶解溫度對(duì)酚類物質(zhì)得率的影響。

在酶解pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，酶用量120 μL/g，50 ℃條件下酶解1 h，70%乙醇溶液浸提濾渣，考查pH對(duì)酚類物質(zhì)得率的影響。

在酶解pH為5.0，酶用量120 μL/g，50 ℃條件下酶解0.5、1、1.5、2、2.5 h，70%乙醇溶液浸提濾渣，考查酶解時(shí)間對(duì)酚類物質(zhì)得率的影響。

在酶解pH為5.0，酶用量120 μL/g，50 ℃條件下酶解1.5 h，體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液浸提濾渣，考查乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)酚類物質(zhì)得率的影響。

1.2.3 復(fù)合酶法提取正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以總酚、總黃酮得率為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)L16（35）正交試驗(yàn)，確定最優(yōu)酶解提取工藝。因素水平見表1。

1.2.4 酚類物質(zhì)含量測(cè)定

1.2.4.1 總酚含量的測(cè)定 采用Folin-Ciocalteu測(cè)定法[22]：分別取0.2 mL樣品或不同濃度的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中（空白組用70%乙醇代替），加入0.1 mol/L的福林酚2.5 mL，5 min后加入7.5% Na2CO3溶液2.5 mL，在室溫避光下反應(yīng)2 h，于725 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，繪制不同濃度的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（x）與對(duì)應(yīng)吸光度（y）之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線y=2.105x+0.1538（R2=0.9992）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，按公式（1）計(jì)算總酚得率（%）。

表1 正交試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels of extraction experiment

式中：C為沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度，mg/mL；n為提取液稀釋倍數(shù)；V為提取液的總體積，mL；m為龍牙楤木樣品質(zhì)量，g。

1.2.4.2 總黃酮含量的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[23]，吸取1 mL樣品或不同濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中（空白組用70%乙醇代替），加入4 mL 70%的乙醇溶液，0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液；6 min后加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液；6 min后再加4 mL 1 mol/L的氫氧化鈉溶液，0.4 mL水，放置15 min，于510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，繪制不同濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（a）與對(duì)應(yīng)吸光度（b）之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.6446x+0.1726（R2=0.9991）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，按公式（2）計(jì)算總黃酮得率（%）。

式中：C為蘆丁質(zhì)量濃度，mg/mL；n為提取液稀釋倍數(shù)；V為提取液的總體積，mL；m為龍牙楤木樣品質(zhì)量，g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 22軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用SNK法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)（P＜0.05），每個(gè)樣品重復(fù)3次試驗(yàn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法比較

采用溶劑浸提法、溶劑回流法、超聲輔助法、微波輔助法及復(fù)合酶法，共5種方法提取龍牙楤木中酚類物質(zhì)，以總酚和總黃酮得率作為考察指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

不同提取方法提取酚類物質(zhì)的原理不同，溶劑浸提和溶劑回流法提取均是利用相似相溶原理對(duì)目標(biāo)成分進(jìn)行提取的方法。溶劑回流法相較于溶劑浸提法增加了提取溫度，有利于酚類物質(zhì)的溶出，表2中，溶劑回流法得到的總酚、總黃酮得率（2.38%，1.05%）高于溶劑浸提法（1.95%，0.96%）；超聲輔助法提取是利用超聲波形成的空化效應(yīng)，使植物組織細(xì)胞產(chǎn)生破裂，釋放內(nèi)容物，加速提取過(guò)程，提高提取效率，本實(shí)驗(yàn)中總酚得率為4.32%，總黃酮得率為1.52%；微波輔助法是利用微波在傳遞過(guò)程中穿透植物體，植物體吸收微波產(chǎn)生熱能，使細(xì)胞內(nèi)部水分氣化，產(chǎn)生的壓力使細(xì)胞膜破裂，內(nèi)容物溶出，此方法得到的總酚得率為5.93%、總黃酮得率為2.25%；而復(fù)合酶法提取是利用植物復(fù)合酶（由纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶等組成的混合酶系），使細(xì)胞壁在酶的作用下軟化、膨脹和崩潰等，進(jìn)而改變細(xì)胞壁的通透性，從而提高目標(biāo)物質(zhì)的提取效率，通過(guò)復(fù)合酶法得到的總酚得率為7.09%、總黃酮得率為2.96%。

表2 不同提取方法中龍牙楤木的總酚、總黃酮得率Table 2 Extraction rate of total phenol and flavonoids from Aralia elata by different extraction methods

由表2中可知，不同提取方法得到的總酚、總黃酮得率差異顯著（P＜0.05），其得率大小為：復(fù)合酶法＞微波輔助法＞超聲輔助法＞溶劑回流法＞溶劑浸提法。本實(shí)驗(yàn)中復(fù)合酶法提取效果強(qiáng)于其他4種方法，此結(jié)果與王超等[24]比較了纖維素酶法和超聲波法提取雀兒舌頭中多酚，得出酶法較超聲波法多酚得率提高，以及付曉燕等[25]也證明了酶輔助提取燕麥中酚類物質(zhì)較溶劑法提取總酚含量更高，結(jié)果一致。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)5種提取方法的比較，得出復(fù)合酶法提取的酚類物質(zhì)得率高，故選用復(fù)合酶法為最佳的提取龍牙楤木中酚類物質(zhì)的方法，采用正交試驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)復(fù)合酶法提取的工藝進(jìn)行優(yōu)化。

2.2 復(fù)合酶法提取單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 酶用量對(duì)酚類物質(zhì)得率的影響 酶用量對(duì)龍牙楤木中酚類物質(zhì)得率的影響，如圖1所示，隨著酶用量的增加，植物細(xì)胞壁破裂更徹底，酚類物質(zhì)向溶劑中的擴(kuò)散作用增強(qiáng)，總酚、總黃酮得率增大；當(dāng)酶加入量增加到一定量后，其總酚、總黃酮得率達(dá)到最大，繼續(xù)增加酶用量后，酶吸附在物料表面，影響酚類物質(zhì)的擴(kuò)散，總酚、總黃酮得率下降。因此，酶用量為120 μL/g時(shí)，酚類物質(zhì)提取效果最佳。

2.2.2 酶解溫度對(duì)酚類物質(zhì)得率的影響 酶解溫度對(duì)龍牙楤木中酚類物質(zhì)得率的影響，由圖2可知，隨酶解溫度升高，龍牙楤木中總酚、總黃酮得率增大，且在50 ℃時(shí)得率最高。這是由于復(fù)合酶酶解活力在一定溫度范圍內(nèi)隨溫度升高而增強(qiáng)，酶反應(yīng)速率加快；當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，酶活性降低，酚類物質(zhì)得率下降[26]。故選取50 ℃為最佳酶解溫度。

圖1 酶用量對(duì)酚類物質(zhì)得率的影響Fig.1 Effect of enzyme dosage on extraction rate of phenolic compounds

圖2 酶解溫度對(duì)酚類物質(zhì)得率的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on extraction rate of phenolic compounds

2.2.3 pH對(duì)酚類物質(zhì)得率的影響 pH過(guò)低或者過(guò)高都會(huì)影響酶的活力，從而影響酶對(duì)植物細(xì)胞壁的降解作用，最終影響酚類物質(zhì)的提取。pH對(duì)龍牙楤木中酚類物質(zhì)得率的影響，由圖3可知，當(dāng)酶解pH小于5時(shí)，隨pH增大龍牙楤木中總酚、總黃酮得率增大，當(dāng)pH繼續(xù)增大后，可能影響酶結(jié)構(gòu)和底物的解離，影響總酚、總黃酮的得率。故本實(shí)驗(yàn)最佳酶解pH為5。

圖3 pH對(duì)酚類物質(zhì)得率的影響Fig.3 Effect of pH on extraction rate of phenolic compounds

2.2.4 酶解時(shí)間對(duì)酚類物質(zhì)得率的影響 酶解時(shí)間對(duì)龍牙楤木中酚類物質(zhì)得率的影響，由圖4可知，隨酶解時(shí)間的增加，酚類物質(zhì)得率呈先增加后降低，達(dá)到1.5 h時(shí)，酚類物質(zhì)得率達(dá)到最大值；當(dāng)繼續(xù)延長(zhǎng)酶解時(shí)間，總酚、總黃酮得率變化較小，這是因?yàn)閺?fù)合酶在作用一定時(shí)間后，細(xì)胞內(nèi)外的酚類物質(zhì)濃度達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，綜合考慮，選擇最佳酶解時(shí)間1.5 h。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)酚類物質(zhì)得率的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis time on extraction rate of phenolic compounds

2.2.5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)酚類物質(zhì)得率的影響 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)酚類物質(zhì)得率的影響，由圖5可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%～80%范圍內(nèi)，總酚、總黃酮得率呈先增加后減小的趨勢(shì)，主要是因?yàn)楫?dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到50%后，一些醇溶性雜質(zhì)溶出增加，色素等親脂性強(qiáng)的成分，影響了酚類物質(zhì)的浸出，致使總酚、總黃酮得率下降，故選用體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇為最佳。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)酚類物質(zhì)得率的影響Fig.5 Effect of ethanol volume fraction on extraction rate of phenolic compounds

2.3 復(fù)合酶法提取正交試驗(yàn)結(jié)果

以總酚得率為指標(biāo)，得到正交試驗(yàn)結(jié)果（表3，表4），由表3中極差分析可知，各因素對(duì)復(fù)合酶法提取龍牙楤木中總酚，其影響得率的大小次序?yàn)椋篈＞B＞E＞D＞C，即加酶量＞酶解溫度＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞酶解時(shí)間＞酶解pH。通過(guò)K值大小得到，最佳工藝組合為A2B2C3D2E2，即酶用量120 μL/g，酶解溫度50 ℃，酶解pH 6，酶解時(shí)間為1.5 h，乙醇濃度為50%；方差分析結(jié)果如表4所示，因素A加酶量、因素B酶解溫度對(duì)總酚得率有極顯著的影響（P＜0.01），因素D酶解時(shí)間、因素E乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總酚得率有顯著影響（0.01≤P＜0.05），因素C酶解pH對(duì)總酚得率無(wú)顯著影響。因此，采用復(fù)合酶法提取龍牙楤木中總酚時(shí)，為達(dá)到最佳提取效果，需要重點(diǎn)控制加酶量和酶解溫度，其次酶解時(shí)間以及乙醇體積分?jǐn)?shù)。

表4 方差分析Table 4 Variance analyses

以總黃酮得率為指標(biāo)，得到正交試驗(yàn)結(jié)果（表3，表4），由表3中，極差分析可知，各因素對(duì)復(fù)合酶法提取龍牙楤木中總黃酮，其影響得率的大小次序?yàn)椋篈＞B＞C＞E＞D，即加酶量＞酶解溫度＞酶解pH＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞酶解時(shí)間。通過(guò)K值大小得到，最佳工藝組合為A2B2C3D2E2，即酶用量120 μL/g，酶解溫度50 ℃，酶解pH6，酶解時(shí)間為1.5 h，乙醇濃度為50%；方差分析結(jié)果（表4）顯示顯示因素A加酶量對(duì)黃酮得率有極顯著的影響（P＜0.01），因素B酶解溫度、因素C酶解pH、因素E乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮得率有顯著影響（0.01≤P＜0.05），因素D酶解時(shí)間對(duì)總黃酮得率無(wú)顯著影響。因此，采用復(fù)合酶法提取龍牙楤木中總黃酮時(shí)，為達(dá)到最佳提取效果，需要重點(diǎn)控制加酶量，其次酶解溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)以及酶解pH。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按照優(yōu)化得到的最佳工藝組合A2B2C3D2E2進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)3次，總酚、總黃酮的平均得率分別為7.24%、3.17%，RSD值分別為0.73%、0.36%，高于按正交試驗(yàn)中的最高值7.04%、3.08%，RSD值分別為0.57%、0.32%。

3 結(jié)論

采用5種不同的提取方法對(duì)龍牙楤木中酚類物質(zhì)進(jìn)行提取，以總酚、總黃酮得率為考察指標(biāo)，得率依次為：復(fù)合酶法＞微波輔助法＞超聲輔助法＞溶劑回流法＞溶劑浸提法。利用正交試驗(yàn)優(yōu)化復(fù)合酶法提取工藝，得到酶用量120 μL/g，酶解溫度50 ℃，酶解pH6，酶解時(shí)間1.5 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，此工藝條件下，龍牙楤木中總酚得率為7.24%，總黃酮得率為3.17%，提取過(guò)程中需要重點(diǎn)控制加酶量和酶解溫度。

本研究利用復(fù)合酶法提取龍牙楤木中酚類物質(zhì)，提取過(guò)程溫度低，對(duì)酚類物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)影響小，酚類物質(zhì)得率高，具有一定的實(shí)際價(jià)值。但本文僅對(duì)5中提取方法的單獨(dú)提取效果進(jìn)行了研究，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可以對(duì)不同方法進(jìn)行聯(lián)合，例如復(fù)合酶法與微波輔助法聯(lián)合進(jìn)行提取，期望進(jìn)一步提高龍牙楤木中酚類物質(zhì)的得率。