微波輔助提取巴旦木蛋白工藝優(yōu)化及其功能性質(zhì)研究

楊文敏，楊 冬，任昊天

（黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院，黑龍江哈爾濱 150028）

巴旦木（Amygdalus communisL.）又名巴旦杏，是薔薇科李亞科桃屬喬木，因其外形扁如桃，又名扁桃，為世界上著名的木本油料和干果樹種[1]。巴旦木作為堅(jiān)果，不但具有很好的口感，其營養(yǎng)價(jià)值也極高，巴旦木含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、膳食纖維等，是諸多營養(yǎng)物質(zhì)的良好資源，如單不飽和脂肪酸、α-生育酚、多種維生素、無機(jī)鹽、精氨酸、植物甾醇和多酚類物質(zhì)等[2-4]。但目前國內(nèi)外針對于巴旦木蛋白的提取和應(yīng)用報(bào)道較少，孫月娥等[2]采用堿提酸沉法和超聲輔助堿法提取巴旦木蛋白工藝的研究，陶永霞等[5]采用酶法制備巴旦木蛋白，但還未見采用微波輔助堿法提取巴旦木蛋白的相關(guān)報(bào)道。

本研究通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)對微波輔助堿法提取巴旦木蛋白的工藝條件進(jìn)行研究，并進(jìn)一步對微波輔助減法提取的巴旦木蛋白與未經(jīng)微波輔助提取的巴旦木蛋白的功能性質(zhì)進(jìn)行對比評價(jià)，旨在為提取、開發(fā)利用巴旦木蛋白和工業(yè)化生產(chǎn)巴旦木蛋白提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

巴旦木 哈爾濱南極百貨批發(fā)市場新疆產(chǎn)薄殼類品種；石油醚、考馬斯亮藍(lán)G-250、氫氧化鈉、鹽酸、苯酚、濃硫酸、十二烷基磺酸鈉等試劑 分析純，國藥集團(tuán)。

Buchi凱式定氮儀 瑞士Buchi實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；722型紫外可見分光光度計(jì) 上海佑科儀器儀表廠；JB-2型恒溫磁力攪拌器 上海新涇儀器有限公司；TDL-4離心機(jī) 安亭科學(xué)儀器廠；PHS-25系列酸度計(jì)、AUY120分析天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒水浴鍋 索式抽提器 南京晚晴化玻儀器有限公司；數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；微波儀 上海新儀微波化學(xué)科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 巴旦木基本成分含量的測定 水分：按照GB 5009.3-2016中直接干燥法進(jìn)行測定；粗蛋白：按照GB 5009.5-2016中凱氏定氮法進(jìn)行測定；粗脂肪：按照GB 5009.6-2016中索氏抽提法進(jìn)行測定；總糖：苯酚-硫酸法[6]，標(biāo)曲方程為y=11.012x+0.0132，R2=0.9989；灰分：按照GB 5009.3-2016進(jìn)行測定。

1.2.2 巴旦木的脫脂 對巴旦木的脫脂操作參考孫月娥等[2]的方法進(jìn)行。將巴旦木手工去殼后于40 ℃烘箱干燥，粉碎過40目篩，室溫下用石油醚（30～60 ℃）脫脂3 h，置通風(fēng)櫥中12 h以揮發(fā)溶劑，得脫脂巴旦木粕，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 微波輔助提取巴旦木蛋白的工藝流程 將脫脂巴旦木粕以一定料液比制成溶液，并用0.5 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至9.5，然后將溶液置于微波儀中進(jìn)行微波處理，之后在4500 r/min下離心20 min并收集上清液，并用1 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)上清液pH至4.5，此后對上清液再次進(jìn)行離心處理收集沉淀并水洗，重復(fù)該操作數(shù)次直至水洗為中性，最后將沉淀物凍干，即得到巴旦木蛋白。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 以巴旦木蛋白提取率為指標(biāo)，選取微波功率、微波時(shí)間、提取液pH、提取溫度和料液比5個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，考察各因素對巴旦木蛋白提取率的影響。

1.2.4.1 微波功率對巴旦木蛋白提取率的影響 固定微波時(shí)間為180 s，提取液pH為9.5，提取溫度為45 ℃，料液比為1:25 g/mL，研究微波功率（100、200、300、400、500、600、700 W）對巴旦木蛋白提取率的影響；

1.2.4.2 微波時(shí)間對巴旦木蛋白提取率的影響 固定微波功率400W，提取液pH為9.5，提取溫度為45℃，料液比為1:25 g/mL，研究微波時(shí)間（90、120、150、180、210、240、270 s）對巴旦木蛋白提取率的影響；

1.2.4.3 提取液pH對巴旦木蛋白提取率的影響 固定微波功率400 W，微波時(shí)間180 s，提取溫度45 ℃，料液比為1:25 g/mL，研究提取液pH（8.0、8.5、9.0、9.5、10、10.5、11.0）對巴旦木蛋白提取率的影響；

1.2.4.4 提取溫度對巴旦木蛋白提取率的影響 固定微波功率400 W，微波時(shí)間180 s，提取液pH為9.5，料液比為1:25 g/mL，研究提取溫度（30、35、40、45、50、55、60 ℃）對巴旦木蛋白提取率的影響；

1.2.4.5 料液比對巴旦木蛋白提取率的影響 固定微波功率400 W，微波時(shí)間180 s，提取液pH為9.5，提取溫度為45 ℃，研究料液比（1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40 g/mL）對巴旦木蛋白提取率的影響。

1.2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)基礎(chǔ)上，對影響巴旦木蛋白提取率的主要因素微波功率、微波時(shí)間、提取液pH、提取溫度和料液比進(jìn)行L16（45）正交試驗(yàn)，因素水平見表1。

表1 L16（45）試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Levels and factors of L16 (45) orthogonal experiment

1.2.6 巴旦木蛋白的提取率計(jì)算 采用考馬斯亮藍(lán)法測定提取液中的蛋白質(zhì)含量，按照下式計(jì)算蛋白提取率：

1.2.7 巴旦木蛋白功能性的測定 采用正交試驗(yàn)優(yōu)化的最佳條件提取巴旦木蛋白，然后冷凍干燥并于-4℃條件下冷藏備用，進(jìn)一步分別測定巴旦木蛋白的溶解性、持水性和持油性、乳化性和乳化穩(wěn)定性、起泡性和起泡穩(wěn)定性等功能性質(zhì)，以未經(jīng)微波處理且相同其他條件下提取的巴旦木蛋白作為對照。

1.2.7.1 溶解性的測定 蛋白質(zhì)溶解性的測定參考李永恒等[7]的方法進(jìn)行。配制1 g/100 mL的蛋白溶液，調(diào)節(jié)蛋白溶液pH至7.0，混勻后在室溫下震蕩30 min，取出10 mL在4000 r/min下離心20 min，倒出上清液并定容至25 mL，再取出10 mL上清液測定其中蛋白質(zhì)含量，上清液中的蛋白質(zhì)含量和樣品中的總蛋白質(zhì)含量均采用采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行測定。蛋白質(zhì)溶解性用溶氮指數(shù)（NSI）來表示，測定公式如下：

1.2.7.2 持水性和持油性的測定 蛋白質(zhì)持水性和持油性測定參考李永恒等[7]方法進(jìn)行。取1 g蛋白樣品放入離心管中，稱量質(zhì)量m1，加入10 mL蒸餾水/大豆油，混勻并在室溫下靜置30 min。然后在4000 r/min下離心20 min，棄去上清液。測量離心管和沉淀的總質(zhì)量m2。持水性和持油性的計(jì)算公式如下：

式中，m0為蛋白樣品的質(zhì)量，g；m1為蛋白與離心管的質(zhì)量，g；m2為離心后沉淀物與離心管的質(zhì)量，g。

1.2.7.3 乳化性和乳化穩(wěn)定性的測定 蛋白質(zhì)乳化性和乳化穩(wěn)定性的測定參考李永恒等[7]方法進(jìn)行。用蒸餾水配制濃度為0.1 g/100 mL的蛋白溶液。用1 mol/L的氫氧化鈉溶液和1 mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)蛋白溶液pH至7.0。分別取30 mL溶液于燒杯中，加入10 mL的大豆油，在10000 r/min下均質(zhì)1 min。然后立即從燒杯底部取200 μL溶液加到0.1%的SDS溶液中，以0.1%的SDS溶液作為空白對照，于500 nm波長下測定吸光值A(chǔ)0。室溫下靜置10 min后再次取樣，測定吸光值A(chǔ)1。乳化性（EAI）和乳化穩(wěn)定性（ESI）的計(jì)算公式如下：

式中：A0為0時(shí)刻的樣品吸光值；A1為10 min時(shí)的樣品吸光值；N為稀釋倍數(shù)；φ為油相所占的體積分?jǐn)?shù)；L為比色皿的光路長度，1 cm；c為蛋白的質(zhì)量濃度，g/mL；T0為放置時(shí)間為0min；T為放置時(shí)間10 min。

1.2.7.4 起泡性和氣泡穩(wěn)定性的測定 起泡性和氣泡穩(wěn)定性的測定參考李永恒等[7]方法進(jìn)行。用蒸餾水配制1 g/100 mL的蛋白溶液。用1 mol/L的氫氧化鈉溶液和1 mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)蛋白溶液pH至7.0。分別取50 mL溶液于燒杯中，用高速均質(zhì)機(jī)在10000 r/min條件下均質(zhì)2 min。均質(zhì)后立即轉(zhuǎn)移至量筒中并測定體積V1，30 min后再次測定體積V2。起泡性（FC）和泡沫穩(wěn)定性（FS）的計(jì)算公式如下：

式中：V0為均質(zhì)前溶液體積，mL；V1為均質(zhì)2 min后的溶液體積，mL；V2為均質(zhì)后靜置30 min后的溶液體積，mL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有單因素及正交試驗(yàn)分別進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，結(jié)果以x±s表示，并采用Origin 9.2進(jìn)行圖表繪制，SPSS 23.0分析軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 巴旦木基本成分

從表2中可以看出，巴旦木中含有較多的蛋白質(zhì)和脂肪，可以進(jìn)一步用于提取蛋白質(zhì)和脂肪，因此，具有很好的開發(fā)和利用價(jià)值以提高該特產(chǎn)資源的附加值。

表2 巴旦木基本成分Table 2 Basic chemical of composition of almond seed kernel

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 微波功率對蛋白質(zhì)提取率的影響 由圖1可見，隨著微波功率的不斷提高，巴旦木蛋白的提取率也隨之增加，當(dāng)功率達(dá)到400 W時(shí)，蛋白提取率達(dá)到最大值，這是由于在微波功率較低時(shí)，巴旦木蛋白有效成分還未完全釋放，隨著微波功率的升高，有效成分的釋放程度也隨之增加[8]，因此，巴旦木蛋白的提取率呈上升趨勢。此后，隨著微波功率繼續(xù)增大至700 W時(shí)，巴旦木蛋白的提取率反而出現(xiàn)明顯的下降，這可能是當(dāng)微波功率進(jìn)一步增加時(shí)會導(dǎo)致溫度升高，微波的強(qiáng)熱效應(yīng)會引起蛋白質(zhì)發(fā)生熱變性[9]，并且還會造成雜質(zhì)成分被釋放出來[8]，從而降低了巴旦木蛋白的提取率，因此綜合考慮，選取微波功率為300～600 W范圍用于進(jìn)一步的正交優(yōu)化試驗(yàn)。

圖1 微波功率對巴旦木蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of microwave power on almond seed kernel protein extraction yield

2.2.2 微波時(shí)間對蛋白質(zhì)提取率的影響 由圖2可見，當(dāng)微波時(shí)間小于180 s時(shí)，隨著微波時(shí)間的增加巴旦木蛋白提取率不斷增大，當(dāng)達(dá)到180 s時(shí)，蛋白提取率達(dá)到最大值，此后，隨著微波時(shí)間進(jìn)一步延長，蛋白提取率反而逐漸下降。巴旦木蛋白中的肽鍵和部分氨基酸側(cè)鏈等極性基團(tuán)在微波的作用下會產(chǎn)生振動(dòng)而促進(jìn)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)逐漸松散，從而有利于可溶性蛋白的溶出，表現(xiàn)為較高的蛋白提取率[7,10]；然而，微波時(shí)間較短時(shí)卻不足以促進(jìn)巴旦木中的可溶性蛋白得到充分釋放；相反，微波時(shí)間過長則會引起物料溫度升高而導(dǎo)致蛋白被破壞，并造成蛋白變性程度加深，引起水溶性氮含量的下降[11-12]，從而影響了對蛋白質(zhì)的提取效果。綜合考慮，選取微波時(shí)間150～240 s進(jìn)行進(jìn)一步的正交優(yōu)化試驗(yàn)。

圖2 微波時(shí)間對巴旦木蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of microwave time on almond seed kernel protein extraction yield

2.2.3 提取液pH對巴旦木蛋白提取率的影響 從圖3中可以看出，當(dāng)提取液pH小于10.0時(shí)，巴旦木蛋白的提取率隨著pH的升高而逐漸增加，當(dāng)pH達(dá)到10.0時(shí)，蛋白提取率達(dá)到最大值，由于巴旦木蛋白中清蛋白含量最為豐富[13]，而清蛋白易溶于稀堿溶液，所以巴旦木蛋白的提取率會隨著pH的升高而不斷增加。此后，隨著pH的繼續(xù)增加，蛋白提取率呈現(xiàn)下降趨勢，這可能是由于提取液堿性增強(qiáng)，會部分改變蛋白質(zhì)分子表面的電荷數(shù)量及分布，增加了蛋白質(zhì)的水溶解性，在酸沉淀過程中造成了部分蛋白質(zhì)的損失[14-15]；而當(dāng)堿性過強(qiáng)時(shí)，容易出現(xiàn)蛋白質(zhì)脫氨、脫羧、肽鍵斷裂等現(xiàn)象，這會引起胱賴反應(yīng)而產(chǎn)生有毒物質(zhì)[2]，并會產(chǎn)生不良異味，造成蛋白質(zhì)的損失，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的提取率降低。綜合考慮，選取提取液pH9.0～10.5進(jìn)行進(jìn)一步的正交優(yōu)化試驗(yàn)。

圖3 提取液pH對巴旦木蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of extraction pH on almond seed kernel protein extraction yield

2.2.4 提取溫度對蛋白提取率的影響 由圖4可知，巴旦木蛋白的提取率隨著提取率溫度的升高表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，并且在提取溫度為50 ℃時(shí)蛋白的提取率最高。在蛋白提取的過程中，蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的構(gòu)象會隨著提取溫度的升高發(fā)生一定變化，主要表現(xiàn)為升溫能夠促使蛋白質(zhì)分子的立體結(jié)構(gòu)逐漸疏松，這有利于蛋白質(zhì)分子和水分子之間的相互作用，促進(jìn)了蛋白質(zhì)的溶解，從而起到了對蛋白質(zhì)的增溶效果[7,16]；然而，當(dāng)提取溫度超過50 ℃以后，隨著提取溫度的繼續(xù)升高，會造成維系蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的較弱作用力和次級鍵減弱或斷裂，導(dǎo)致更多的非極性基團(tuán)暴露在蛋白分子表面，這會降低蛋白質(zhì)分子和水分子之間的相互作用而促進(jìn)了蛋白質(zhì)分子之間的結(jié)合并形成沉淀[5]，從而影響了巴旦木蛋白的提取率。綜合考慮，選取提取溫度40～55 ℃進(jìn)行進(jìn)一步的正交優(yōu)化試驗(yàn)。

圖4 提取溫度對巴旦木蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on almond seed kernel protein extraction yield

2.2.5 料液比對蛋白質(zhì)提取率的影響 由圖5可知，料液比在1:10～1:25 g/mL范圍時(shí)，隨著提取溶劑比例的增加，巴旦木蛋白的提取率也隨之升高，這可能是因?yàn)檫m當(dāng)提高提取溶劑加入的比例能夠增強(qiáng)溶質(zhì)的分散程度，促進(jìn)了溶質(zhì)與溶劑之間的接觸，這有利于蛋白質(zhì)的充分溶出，從而提高了蛋白質(zhì)的提取率[16-17]；此后隨著提取溶劑加入比例繼續(xù)增加時(shí)，蛋白質(zhì)的提取率出現(xiàn)了略微下降的趨勢，這是由于提取溶劑加入過多，會導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子與水分子間的相互作用增加，反而會導(dǎo)致的蛋白質(zhì)分子不易于沉淀，在酸沉淀過程會有一部分蛋白質(zhì)流失到上清液中，從而造成了蛋白質(zhì)的損失[18]。此外，料液比過低時(shí)，會導(dǎo)致提取溶劑的浪費(fèi)，并會增加后處理的負(fù)擔(dān)，使產(chǎn)品成本增加，綜合考慮實(shí)際生產(chǎn)及經(jīng)濟(jì)因素，確定選取料液比1:20～1:35 g/mL進(jìn)行進(jìn)一步的正交優(yōu)化試驗(yàn)。

圖5 料液比對巴旦木蛋白提取率的影響Fig.5 Effect of material/liquid ratio on almond seed kernel protein extraction yield

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以微波功率、微波時(shí)間、提取液pH、提取溫度和料液比為因素，以蛋白提取率為指標(biāo)設(shè)計(jì)L16（45）正交試驗(yàn)優(yōu)化微波輔助提取巴旦木蛋白的最佳工藝參數(shù)，正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。

由表3的極差分析可知，影響微波輔助提取巴旦木蛋白的因素順序依次為：微波功率＞提取溫度＞料液比＞提取液pH＞微波時(shí)間。以蛋白提取率為指標(biāo)優(yōu)化的理論最佳提取工藝因素水平組合為A2B2C2D3E2，即微波溫度400 W、微波時(shí)間180 s、提取液pH9.5、提取溫度50 ℃和料液比1:25 g/mL時(shí)，巴旦木蛋白的提取率達(dá)到最高。參照此最佳組合條件實(shí)施平行試驗(yàn)，測出巴旦木蛋白提取率為46.69%。相較于未經(jīng)微波處理而相同其他條件下測定得到的巴旦木蛋白提取率31.28%可以看出，采用微波輔助堿提法能夠顯著提高巴旦木蛋白的提取率。

2.4 巴旦木蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的評價(jià)

蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)包括溶解性、持水性、持油性、起泡性和氣泡穩(wěn)定性、乳化性和乳化穩(wěn)定性等。蛋白質(zhì)的這些功能性質(zhì)對食品的可加工性能以及產(chǎn)品的口感、質(zhì)地等食用品質(zhì)等具有重要的影響。因此，通過測定巴旦木蛋白這5個(gè)性質(zhì)指標(biāo)，對比分析微波處理對提取的巴旦木蛋白功能性質(zhì)的影響，結(jié)果如表4所示。

從表4中可以看出，微波輔助提取的巴旦木蛋白的溶解性、持水性、持油性、乳化性和起泡性分別為55.24%、4.11 g/g、6.21 g/g、25.94 m2/g和74.86%，相較于未經(jīng)微波處理的巴旦木蛋白，其溶解性、持水性、持油性、乳化性和起泡性分別提升了15.35%、26.07%、26.22%、30.61%和20.53%，然而，微波輔助提取的巴旦木蛋白的乳化穩(wěn)定性和泡沫穩(wěn)定性略有降低，降低幅度分別為1.05%和13.29%。巴旦木蛋白在微波的作用下，其蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的二硫鍵斷裂并形成巰基，這阻礙了蛋白質(zhì)之間的聚集，同時(shí)，蛋白分子結(jié)構(gòu)的伸展有利于水分向其內(nèi)部的進(jìn)入，這促進(jìn)了親水基團(tuán)與水分子的充分結(jié)合，因此，微波處理后蛋白的溶解性和持水性均得到提高[7,19]。蛋白質(zhì)的起泡性、乳化性等功能性質(zhì)與其溶解性大小密切相關(guān)，隨著蛋白質(zhì)溶解性的增大，蛋白更易于向氣-水或油-水界面擴(kuò)散并降低表面張力，從而提高了蛋白質(zhì)的起泡性和乳化性等功能性質(zhì)[20]。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal experiment results

3 結(jié)論

在微波輔助提取巴旦木蛋白的實(shí)驗(yàn)中，影響巴旦木蛋白提取率的因素順序依次為：微波功率＞提取溫度＞料液比＞提取液pH＞微波時(shí)間。通過正交優(yōu)化試驗(yàn)得到微波輔助提取巴旦木蛋白的最佳工藝條件為：微波溫度400 W、微波時(shí)間180 s、提取液pH 9.5、提取溫度50 ℃和料液比1:25 g/mL，在此條件下測出巴旦木蛋白提取率可達(dá)到46.69%。相較于未經(jīng)微波處理而相同其他條件下提取的巴旦木蛋白來說，微波處理顯著提高了巴旦木蛋白的功能性質(zhì)，如溶解性、持水性、持油性、乳化性和起泡性分別提升了15.35%、26.07%、26.22%、30.61%和20.53%，但乳化穩(wěn)定性和泡沫穩(wěn)定性略有降低，降低幅度分別為1.05%和13.29%。研究結(jié)果表明對巴旦木進(jìn)行合理的微波處理，有助于提高巴旦木蛋白的提取率并改善功能性質(zhì)。

表4 微波預(yù)處理與未經(jīng)微波預(yù)處理的巴旦木蛋白功能性質(zhì)比較Table 4 Comparison of functional properties of microwave-assisted extracted and commonly extracted almond seed kernel proteins