結(jié)直腸癌患者腫瘤出芽情況與臨床病理特征、程序性死亡受體1及程序性死亡配體1表達(dá)相關(guān)性研究

趙英旋，白玉勤

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧 錦州 121001；2.赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院普外科，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；3.赤峰市腫瘤醫(yī)院病理科，內(nèi)蒙古 赤峰 024000)

結(jié)直腸癌(Carcinoma of colon and rectum，CRC)是消化道常見的惡性腫瘤，表現(xiàn)為便血及腹痛等癥狀[1]。近年來，CRC發(fā)病率和死亡率逐漸呈上升趨勢。據(jù)統(tǒng)計，CRC在全世界男性發(fā)病率中居第3位，病死率第4位；女性發(fā)病率居第2位，病死率居第3位；大多數(shù)患者處于中晚期，占所有CRC的50%[2]。歐洲醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)會(ESMO)提出，腫瘤出芽是早期CRC的潛在預(yù)后因素，其是由一個未分化的腫瘤細(xì)胞或4個細(xì)胞組成的小的局灶性腫瘤細(xì)胞群，存在于腫瘤浸潤的前緣，CRC中腫瘤出芽與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性、細(xì)胞凋亡、腫瘤間質(zhì)、缺氧和血管擴(kuò)張、炎癥浸潤、微小RNAs(miRNAs) 、Ki-ras及KRAS/BRAF基因突變密切相關(guān)[3]。研究[4]發(fā)現(xiàn)，程序性死亡受體1(Programmed cell death-1，PD-1)是一種參與T細(xì)胞凋亡的跨膜受體，其與程序性死亡配體1(Programmed cell death-ligand 1，PD-L1)和PD-L2的相互作用會抑制T細(xì)胞的增殖。當(dāng)正常機(jī)體感染病毒時，細(xì)胞內(nèi)PD-L1和PD-L2蛋白的表達(dá)增加，與T細(xì)胞表面的 PD-1 受體相互作用，從而抑制T細(xì)胞的活化和增殖，降低殺傷腫瘤能力[5]。基于此，本研究選取180例手術(shù)切除的CRC石蠟標(biāo)本，探討CRC患者腫瘤出芽與臨床病理特征及PD-1/PD-L1的關(guān)系，以期為CRC診治提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2014年1月至2015年12月行根治術(shù)治療的180例CRC患者的臨床資料。其中，男性65例，女性115例；年齡30～75歲，平均(57.26±7.18)歲；腫瘤直徑1.5～10 cm，平均(4.51±0.30)cm。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①均符合CRC診斷，并經(jīng)病理學(xué)確診[6]；②年齡30～75歲；③臨床資料及影像學(xué)資料完整；④術(shù)前未接受化學(xué)藥物治療、局部放射治療或其他抗腫瘤治療；⑤無惡性腫瘤病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①肝腎功能不全；②合并自其他惡性腫瘤；③術(shù)前發(fā)生全身轉(zhuǎn)移；④臨床資料不完整；⑤有家族遺傳史。

1.2 研究方法

1.2.1 腫瘤出芽計數(shù)：根據(jù)國際腫瘤出芽共識會議(ITBCC)上提出的腫瘤出芽標(biāo)準(zhǔn)化方法[7]進(jìn)行判定，即在腫瘤浸潤前沿的間質(zhì)中發(fā)現(xiàn)孤立的單個腫瘤細(xì)胞或2～4個小簇狀腫瘤細(xì)胞群為腫瘤出芽。低倍顯微鏡下觀察蘇木精-伊紅(HE)染色的腫瘤組織浸潤前沿，尋找腫瘤出芽最多的區(qū)域。如果不清楚哪個區(qū)域出芽最多，或者如果第一個區(qū)域的腫瘤芽數(shù)<15個，則應(yīng)從多個區(qū)域評價腫瘤出芽，選擇出芽最多的區(qū)域進(jìn)行分析。在總放大倍數(shù)為200倍的條件下，對面積為0.398 mm2的單個視野內(nèi)的腫瘤芽數(shù)進(jìn)行計數(shù)，然后將腫瘤芽數(shù)乘以1.97，得到的數(shù)為每0.785 mm2的腫瘤芽數(shù)，在光鏡下觀察到CRC中沒有出芽、低度出芽(<10個/高倍視野)和高度出芽(≥10個/高倍視野)(×20視野，0.785 mm2區(qū)域)。

1.2.2 標(biāo)本制備和石蠟切片HE染色：離體的黏膜薄切和根治CRC組織標(biāo)本快速在10%中性甲醛溶液中進(jìn)行浸泡固定，采取組織梯度酒精脫水、透明、浸蠟，然后石蠟包埋。石蠟切片厚度為3 μm，于65 ℃溫度下烘烤2～5 h后浸泡于二甲苯溶液中脫蠟，室溫下梯度酒精脫苯及水化，酒精濃度依次為100%、95%、90%、80%和70%。接著采用流水沖洗3～5 min；蘇木素溶液染色2 min，流水沖洗 3 min；用1%鹽酸酒精溶液再浸泡1 min 后同樣采用流水沖洗3 min；再用伊紅溶液染色3～5 min，流水沖洗3 min；梯度酒精再脫水，酒精濃度依次為70%、80%、90%、95%和100%。3次二甲苯透明后采用中性樹膠封片，于放大倍數(shù)下觀察切片并記錄[8-9]。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色：采用羅氏機(jī)器自動化方法。連續(xù)石蠟切片厚度為3 μm。取CRC組織石蠟切片，經(jīng)烤片、脫蠟、水化、抗原修復(fù)等過程，加入體積分?jǐn)?shù)為3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶后，加入一抗 anti-PD-L1和PD-1(克隆號為MX033)，4 ℃冰箱過夜(12 h)，PBS清洗，先后加入羊抗鼠或兔IgG(二抗)室溫孵育1 h，DAB染色，蘇木素復(fù)染，二甲苯透明，中性樹膠封片[10-11]。

1.2.4 判定標(biāo)準(zhǔn)[12]：PD-L1和PD-1以細(xì)胞質(zhì)或胞膜出現(xiàn)黃至棕褐色顆粒為陽性。PD-L1以陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)≥1%為陽性，<1%為陰性。PD-1表達(dá)于腫瘤間質(zhì)浸潤的淋巴細(xì)胞，以≥5%為陽性，<5%為陰性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計數(shù)資料用[例(%)]表示，組間比較采用χ2檢驗。等級資料采用秩和檢驗。采用多因素Logistic回歸模型分析腫瘤出芽情況與臨床病理特征的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CRC患者腫瘤不出芽時PD-1和PD-L1蛋白表達(dá)情況 見圖1。CRC不出芽石蠟標(biāo)本連續(xù)切片行HE染色及免疫組化PD-1、PD-L1蛋白染色，60例CRC患者顯微鏡下未見腫瘤出芽，且PD-1、PD-L1蛋白呈陰性表達(dá)。

注：A圖為HE染色(×40)；B、C圖為PD-1蛋白免疫組化染色(×40)

2.2 CRC患者腫瘤出芽時PD-1和PD-L1蛋白表達(dá)情況 見圖2。顯微鏡下，在腫瘤浸潤的前緣間質(zhì)內(nèi)可見多個芽孢，且由孤立單個細(xì)胞或2～4個癌細(xì)胞成團(tuán)組成，其中50例低出芽(圖2A-D)，70例高出芽(圖2E-G)。芽孢內(nèi)細(xì)胞質(zhì)融合，呈嗜酸性，形狀不規(guī)則，染色較間質(zhì)細(xì)胞深，部分可見核分裂像。腫瘤細(xì)胞PD-1、PD-L1蛋白不著色或著色<1%。PD-1表達(dá)于腫瘤間質(zhì)及淋巴細(xì)胞，局灶區(qū)陽性細(xì)胞數(shù)<5%。因此，PD-1、PD-L1蛋白亦呈陰性表達(dá)。

注：A、E 圖為HE染色(×40)；B、F圖為HE染色(×400；)； C、G圖為PD-1蛋白免疫組化染色(×40)；D、H圖為PD-L1蛋白免疫組化染色(×40)

2.3 CRC患者腫瘤出芽與臨床病理特征單因素分析 見表1。CRC腫瘤低出芽和高出芽患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、腫瘤組織學(xué)、腫瘤分化程度及腸壁環(huán)繞情況比較無統(tǒng)計學(xué)差異(均P>0.05)，但病理分期、腫瘤形態(tài)、腸壁浸潤深度及轉(zhuǎn)移情況比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

表1 CRC患者腫瘤出芽與臨床病理特征單因素分析[例(%)]

續(xù) 表

2.4 影響CRC腫瘤出芽臨床病理特征多因素分析 見表2。將表1中有統(tǒng)計學(xué)差異的因素設(shè)為自變量(病理分期Ⅲ期=1，Ⅱ期=0；腫瘤形態(tài)呈侵襲型=1，呈腫塊型和潰瘍型=0；腸壁肌層和漿膜層浸潤=1，黏膜層和漿膜外浸潤=0；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移=1，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移=0)進(jìn)行Logistic多因素回歸分析，結(jié)果顯示病理分期、腫瘤形態(tài)、腸壁浸潤深度及轉(zhuǎn)移情況為影響CRC腫瘤出芽的獨(dú)立危險因素(均P<0.05)。

表2 影響CRC腫瘤出芽臨床病理特征多因素分析

2.5 CRC腫瘤出芽與預(yù)后的關(guān)系 對低出芽和高出芽患者進(jìn)行5年隨訪。至2021年1月，隨訪時間平均(30.28±4.05)個月。隨訪期間無失訪，低出芽CRC患者7例死亡，總生存率為86.00%(43/50)；高出芽CRC患者32例死亡，總生存率為54.29%(38/70)。高出芽CRC患者5年總生存率低于低出芽CRC患者(P<0.05)。

3 討 論

CRC患者惡性腫瘤特征為腫瘤細(xì)胞侵襲性生長和轉(zhuǎn)移。腫瘤侵襲性生長是腫瘤細(xì)胞進(jìn)入周圍間質(zhì)，而腫瘤出芽是腫瘤侵襲性生長的形態(tài)表達(dá)，其除與CRC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后等相關(guān)外，還與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)、細(xì)胞凋亡、缺氧、炎細(xì)胞浸潤等密切相關(guān)[13-14]。UICC已經(jīng)正式承認(rèn)腫瘤出芽是CRC的獨(dú)立預(yù)后因素[15]。Pan等[16]發(fā)現(xiàn)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和淋巴管浸潤的直腸癌患者，其腫瘤出芽的發(fā)生高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的直腸腺癌患者。楊天寧等[17]發(fā)現(xiàn)，腫瘤出芽在CRC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和淋巴管浸潤方面的發(fā)生率具有相關(guān)性。

PD-1及其配體PD-L1是免疫治療的重點。其中，PD-1正常表達(dá)在胸腺細(xì)胞上，誘導(dǎo)性表達(dá)于活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞等，當(dāng)抗原清除、免疫應(yīng)答完成后T細(xì)胞PD-1表達(dá)減少。PD-1表達(dá)在T細(xì)胞上會誘導(dǎo)T細(xì)胞衰竭，因此PD-1屬于免疫抑制受體。PD-L1是PD-1主要配體，是負(fù)性免疫調(diào)節(jié)蛋白，表達(dá)于腫瘤細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞等，可抑制T細(xì)胞活化，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，減弱免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的監(jiān)視作用，從而使腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸。腫瘤發(fā)生時腫瘤微環(huán)境會誘導(dǎo)浸潤性T細(xì)胞高表達(dá)PD-1分子，進(jìn)而激活腫瘤微環(huán)境中PD-1通路，且與PD-L1聯(lián)接后會抑制T細(xì)胞功能[18-19]。本研究結(jié)果顯示，腫瘤出芽率為66.67%(120/180)；CRC腫瘤不出芽區(qū)域和出芽區(qū)域腫瘤細(xì)胞PD-1和PD-L1蛋白不著色或<1%著色，PD-1表達(dá)于腫瘤間質(zhì)浸潤的淋巴細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞，局灶陽性細(xì)胞數(shù)<5%，結(jié)果為陰性，證明了CRC腫瘤不出芽和腫瘤出芽與PD-1和PD-L1蛋白表達(dá)無顯著關(guān)系。另外，本研究發(fā)現(xiàn)低出芽和高出芽CRC患者病理分期、腫瘤形態(tài)、腸壁浸潤深度及轉(zhuǎn)移情況比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，與陳艷昕等[20]報道一致，說明腫瘤出芽與病理分期、腫瘤形態(tài)、腸壁浸潤深度及轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)；同時Logistic多因素回歸分析結(jié)果顯示，病理分期、腫瘤形態(tài)、腸壁浸潤深度及轉(zhuǎn)移情況為影響CRC腫瘤出芽的獨(dú)立危險因素，進(jìn)一步證實了腫瘤出芽與病理分期、腫瘤形態(tài)、腸壁浸潤深度及轉(zhuǎn)移情況的相關(guān)性，病理分期高、腫瘤呈侵襲型、腸壁肌層和漿膜層浸潤以及存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的CRC患者腫瘤出芽發(fā)生率更高。與其他研究不同的是，本研究進(jìn)行5年隨訪后研究發(fā)現(xiàn)，高出芽CRC患者5年總生存率低于低出芽患者，由此可見高出芽CRC患者預(yù)后較差，進(jìn)一步證實了腫瘤高出芽對CRC具有一定的預(yù)測價值。

綜上所述，腫瘤不出芽和出芽與PD-1、PD-L1蛋白表達(dá)無相關(guān)性。病理分期、腫瘤形態(tài)、腸壁浸潤深度及轉(zhuǎn)移情況等病理特征是影響CRC患者腫瘤出芽的危險因素，可為制定術(shù)后輔助治療方案和判斷預(yù)后提供指導(dǎo)。但本研究納入病例數(shù)較少，可能對結(jié)論有一定影響，后續(xù)將擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步論證。