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    內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白29在結(jié)直腸腺瘤和腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義

    2021-06-18 09:53:16牛森森周玉保MuhammadAyyub巴基斯坦
    陜西醫(yī)學(xué)雜志 2021年6期
    關(guān)鍵詞:腺瘤腺癌直腸

    趙 健,牛森森,周玉保,Muhammad Ayyub(巴基斯坦)

    (1.安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,安徽 合肥 230601;2.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科, 安徽 合肥 230601)

    我國結(jié)直腸癌發(fā)病率和病死率在全部惡性腫瘤中均位居第5位[1]。由于結(jié)直腸癌早期癥狀和體征不典型,現(xiàn)有早期診斷、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移監(jiān)測等技術(shù)的敏感性和特異性仍不足,導(dǎo)致發(fā)病率和病死率居高不下,甚至出現(xiàn)上升趨勢[2-4]。結(jié)直腸腺瘤是目前公認(rèn)的具有不同程度異型增生的結(jié)直腸癌癌前病變,大部分結(jié)直腸癌被認(rèn)為起源于良性的結(jié)直腸腺瘤[5]。目前對結(jié)直腸腺瘤的病理診斷主要依據(jù)組織的顯微鏡下形態(tài)學(xué)表現(xiàn),帶有一定主觀性,難以準(zhǔn)確描述腺瘤的病理學(xué)特征和判斷其生物學(xué)行為,不利于結(jié)直腸腫瘤治療的及時性和有效性。近年來,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白29(Endoplasmic reticulum protein 29,ERp29)在多種惡性腫瘤中的生物學(xué)行為調(diào)控作用已經(jīng)得到充分重視,研究[6]證實(shí)ERp29的異常表達(dá)會使相關(guān)蛋白失去執(zhí)行其正常功能的能力,從而導(dǎo)致腫瘤等疾病的發(fā)生。然而,ERp29在結(jié)直腸腫瘤進(jìn)展中扮演的角色尚有爭議,確切的調(diào)控作用和分子機(jī)制也不清楚。到目前為止,ERp29在結(jié)直腸腺瘤中未見相關(guān)研究報道。本研究通過免疫組織化學(xué)染色法對比ERp29在結(jié)直腸組織癌變不同階段組織中的表達(dá)情況,以驗(yàn)證其在結(jié)直腸腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的確切作用,為ERp29在結(jié)直腸腫瘤中的研究提供補(bǔ)充。

    1 材料與方法

    1.1 一般資料 收集安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院2018年6月至2019年12月行腸鏡下息肉切除的結(jié)直腸腺瘤組織60例(管狀腺瘤、絨毛狀管狀腺瘤及絨毛狀腺瘤組織各20例),其中男性34例,女性26例,年齡40~77歲,平均年齡(61.67±10.13)歲。收集行外科手術(shù)治療的結(jié)直腸癌組織及其對應(yīng)癌旁組織各40例,其中男性22例,女性18例;年齡43~81歲,平均(62.45±11.61)歲。取同期行腸鏡下切除的非腺瘤性息肉組織20例作為腺瘤對照,其中男性10例,女性10例;年齡36~81歲,平均(58.95±10.96)歲。各組在性別、年齡構(gòu)成等常規(guī)資料比較上無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)。所有標(biāo)本經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診。排除術(shù)前接受過放化療的結(jié)直腸癌患者。

    1.2 染色方法 ERp29采用EnVision法進(jìn)行染色。由我院病理科調(diào)取所需石蠟組織塊,切成4 μm厚度,60 ℃烤片4 h后備用。切片常規(guī)脫蠟、水化,依次為二甲苯10 min×3次、無水乙醇3 min×3次、95%乙醇3 min×2次、75%乙醇3 min×2次,蒸餾水沖洗1 min,置于PBS緩沖液中。枸櫞酸鹽緩沖液經(jīng)高壓鍋煮沸抗原修復(fù),3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,室溫孵育10 min后加入ERp29抗體(工作濃度1∶ 200),37 ℃孵育60 min。滴加反應(yīng)增強(qiáng)液,室溫孵育20 min,加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗,室溫孵育20 min,DAB顯色,室溫孵育,自來水沖洗隨時終止顯色,蘇木精復(fù)染20 s,分化、沖洗返藍(lán),梯度乙醇脫水,中性樹脂封片。用PBS代替一抗作為陰性對照。

    1.3 結(jié)果判定 以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為ERp29陽性表達(dá)。在雙盲條件下,由2名高年資病理醫(yī)師在200倍鏡下隨機(jī)選取5個清晰無折疊視野,分別從染色強(qiáng)度評分(0~3分)和陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)百分比評分(0~4分)進(jìn)行評定并取平均值,通過兩種評分乘積判斷ERp29表達(dá)程度,得分越高則表達(dá)程度越高。評定標(biāo)準(zhǔn):①染色強(qiáng)度評分:無染色記為0分,輕度染色記為1分,中度染色記為2分,重度染色記為3分。②陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)百分比評分:陽性細(xì)胞<5%記為0分,5%~25%記為1分,26%~50%記為2分,51%~75%記為3分,>75%記為4分?!?分判定為陰性(-),2~4分為弱陽性(+),5~8分為中等陽性(),9~12分為強(qiáng)陽性(),其中>2分判定為陽性表達(dá)。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,通過χ2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法分析結(jié)直腸腫瘤組織中ERp29表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性,通過兩樣本比較的Wilcoxon秩和檢驗(yàn)比較ERp29表達(dá)程度與結(jié)直腸不同類型病變組織之間的相關(guān)性。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

    2 結(jié) 果

    2.1 ERp29在結(jié)直腸不同類型病變組織中表達(dá)情況比較 見表1(圖1)。免疫組化染色結(jié)果顯示,ERp29在結(jié)直腸良性病變及癌旁組織中多呈強(qiáng)陽性或中等陽性表達(dá),在腺癌中多呈弱陽性或陰性表達(dá)。結(jié)直腸腺癌組織ERp29陽性率明顯低于其癌旁組織、腺瘤組織和非腺瘤組織(χ2=10.208、16.407、12.377,均P<0.01)。腺瘤和非腺瘤組織間ERp29表達(dá)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

    表1 ERp29在結(jié)直腸不同類型病變組織中表達(dá)情況比較[例(%)]

    A:非腺瘤性息肉組織;B:腺瘤組織;C:癌旁組織;D:腺癌組織

    2.2 ERp29在結(jié)直腸不同類型病變組織中表達(dá)強(qiáng)度比較 見表2。結(jié)直腸腺癌組織ERp29表達(dá)強(qiáng)度顯著低于其癌旁組織、腺瘤組織和非腺瘤性息肉組織(Zc=-4.540、-5.562、-5.349,均P<0.01)。腺瘤組織ERp29表達(dá)強(qiáng)度低于非腺瘤性息肉組織(Zc=-2.177,P<0.05)。

    表2 ERp29在結(jié)直腸不同類型病變組織中表達(dá)強(qiáng)度情況(例)

    2.3 ERp29表達(dá)與結(jié)直腸癌組織臨床病理參數(shù)關(guān)系 見表3。通過卡方檢驗(yàn)對比結(jié)直腸癌組織不同臨床病理特征時ERp29表達(dá)陽性率的差異,可知ERp29表達(dá)水平與腫瘤TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)(均P<0.01),而與腺癌患者年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤部位、腫瘤分化程度、腫瘤浸潤深度(T分期)及有無癌栓無明顯相關(guān)性(均P>0.05)。

    表3 ERp29表達(dá)與結(jié)直腸癌組織臨床病理參數(shù)關(guān)系[例(%)]

    2.4 ERp29表達(dá)與結(jié)直腸腺瘤組織學(xué)類型和異型增生程度關(guān)系 見表4。絨毛狀腺瘤組織ERp29陽性率(70%)低于管狀腺瘤(90%)和絨毛狀管狀腺瘤(85%),腺瘤伴重度異型增生組織ERp29陽性率(66.7%)低于輕中度異型增生組織(85.4%),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

    表4 ERp29表達(dá)與結(jié)直腸腺瘤組織學(xué)類型和異型增生程度關(guān)系[例(%)]

    3 討 論

    ERp29是一種分子量為29 kDa的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白,在真核生物多種組織中表達(dá)廣泛,尤其在分泌性組織中有著高水平的表達(dá)[7]。ERp29和蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶樣蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上具有許多相似性,充當(dāng)分子伴侶協(xié)助內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中某些特定蛋白質(zhì)早期分泌途徑中的加工和轉(zhuǎn)運(yùn),并參與真核生物多種重要生命進(jìn)程[8]。ERp29已被證實(shí)在包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的多種癌細(xì)胞侵襲、遷移、增殖與凋亡等過程中發(fā)揮重要作用,目前大多數(shù)研究[9-12]顯示ERp29在各類惡性腫瘤發(fā)生與發(fā)展中扮演著抑癌因子的角色,然而另一些研究[13-14]發(fā)現(xiàn)ERp29同樣高表達(dá)于某些原發(fā)腫瘤及癌細(xì)胞株。

    在對結(jié)直腸癌的研究中,Deng等[15]證實(shí)高表達(dá)的ERp29是導(dǎo)致結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移癌干細(xì)胞樣細(xì)胞侵襲能力的先天因素,并可對結(jié)直腸癌的預(yù)后風(fēng)險進(jìn)行分層。Guo等[16]在對結(jié)直腸癌細(xì)胞株中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)模型研究中發(fā)現(xiàn)ERp29表達(dá)上調(diào),并通過與CUL5偶聯(lián)在ERS期間逆轉(zhuǎn)了ERS誘導(dǎo)的從間充質(zhì)樣到上皮樣表型的轉(zhuǎn)變(MET)過程,使癌細(xì)胞在遇到不利應(yīng)激時也能夠維持惡性生物活性,暗示ERp29高表達(dá)與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后不良相關(guān),而這與檀祝利等[17]的研究結(jié)果相反。

    綜上可見,ERp29的表達(dá)和作用可能受不同腫瘤組織類型、不同狀態(tài)以及細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的影響而存在差異。基于ERp29在結(jié)直腸癌研究中出現(xiàn)了相互矛盾的結(jié)果,為探究ERp29在結(jié)直腸腫瘤中的確切作用,本研究利用免疫組織化學(xué)法檢測了結(jié)直腸不同類型病變組織中ERp29的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,ERp29在各個類型組織中均有不同程度表達(dá),非腺瘤、腺瘤及癌旁組織中ERp29多呈強(qiáng)陽性或中等陽性表達(dá),腺癌中多呈弱陽性或陰性表達(dá)。腺癌組織中ERp29表達(dá)陽性率均顯著低于其他3種類型組織,雖然在非腺瘤性息肉和腺瘤組織中ERp29表達(dá)陽性率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但在ERp29表達(dá)強(qiáng)度的比較中非腺瘤組織比腺瘤組織有著更高程度的表達(dá),提示在非腫瘤至良性腫瘤再至癌的續(xù)變過程中ERp29表達(dá)減少可能是結(jié)直腸腺瘤癌變的重要分子事件,其表達(dá)下調(diào)貫穿于整個腺瘤癌變進(jìn)程的各個階段。

    在對結(jié)直腸腺瘤的研究中,本研究證實(shí)ERp29陽性表達(dá)率在不同腺瘤組織學(xué)類型以及異型增生程度之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但隨著腺瘤絨毛成分和異型增生程度的增加,ERp29陽性表達(dá)率有逐漸降低趨勢,提示ERp29異常表達(dá)可能與腺瘤惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)。Wu等[18]通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)ERp29可抑制胃癌細(xì)胞增殖,進(jìn)一步的機(jī)制研究表明ERp29可通過阻斷PI3K/AKT通路/GSK-3β或AKT-mTOR信號抑制上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)進(jìn)程[19]。Bambang等[20-21]在對乳腺癌細(xì)胞中ERp29相關(guān)作用的研究中還證實(shí)了ERp29通過使β-catenin易位抑制活化的Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo),在緊密連接和細(xì)胞極性恢復(fù)以及通過建立細(xì)胞-細(xì)胞接觸在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞MET中起關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果也間接提示ERp29有抑制結(jié)直腸黏膜組織細(xì)胞異常增殖的作用,可能與上述作用機(jī)制相關(guān)。在ERp29表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)關(guān)系的研究中,本研究結(jié)果也與檀祝利等[17]研究結(jié)果基本一致,并且發(fā)現(xiàn)較大的腫瘤直徑、較低的細(xì)胞分化程度、更深的浸潤深度和癌栓存在使得ERp29的表達(dá)有逐漸降低的趨勢,雖然它們未顯示出明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但考慮到免疫組化檢測的特異性和靈敏度相對不足,仍在一定程度上提示ERp29異常表達(dá)可能與結(jié)直腸癌的惡性行為有關(guān)。

    總之,本研究證實(shí)ERp29作為一種抑癌因子參與了結(jié)直腸從非腫瘤至良性腫瘤再至癌的序列演變過程的各個階段??梢酝茰y,ERp29可能是一個更有效的分子生物學(xué)標(biāo)志物,在結(jié)直腸腺瘤早期癌變傾向和程度的監(jiān)測以及結(jié)直腸腺癌轉(zhuǎn)移傾向的評估中有潛在應(yīng)用價值,并在作為結(jié)直腸癌新的治療靶點(diǎn)方面也具有一定的研究價值。

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