冠心病患者血清miR-21、miR-29a表達水平與心電圖QRS波時限相關性分析

孫玉敏，李 絨

(1.延安市人民醫(yī)院功能科，陜西 延安 716000；2.陜西省核工業(yè)二一五醫(yī)院功能科，陜西 咸陽 712000)

冠心病(Coronary heart disease，CHD)發(fā)病基礎是動脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)病變，可形成血栓，引起血管狹窄、堵塞，從而造成心肌缺血，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1-2]。CHD發(fā)病除與高血糖、異常血脂、高血壓、炎癥等易引發(fā)冠狀動脈硬化等因素有關外，還與表達失調的微小RNA(MicroRNA，miRNA)密切相關[3-4]。miRNA-21(miR-21)在冠狀動脈疾病中表達上調，可能成為冠狀動脈疾病發(fā)生與發(fā)展的生物指標[5]。miRNA-29a(miR-29a)在AS患者中呈高水平，可能影響AS發(fā)生與發(fā)展[6]。但miR-21、miR-29a在CHD患者血清中的表達水平與心電圖QRS波時限的關系鮮有報道。因此，本研究通過測定CHD患者miR-21、miR-29a表達水平，并分析兩者與QRS波時限的關系，現報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2017年4月至2019年2月本院接診的162例CHD患者作為CHD組，其中男性119例，女性43例；年齡50～72歲，平均(58.64±5.81)歲。病例納入標準：①符合CHD診斷標準[7]；②結合臨床表現，且經心肌酶學、心電圖、冠狀動脈造影診斷并確診為CHD患者；③檢查資料完整。排除標準：①脂肪肝、免疫性疾病、中毒性肝炎、急慢性感染、肺源性心臟病者；②近期腦血管意外、手術、永久心臟起搏器植入者；③惡性腫瘤、膽囊炎、慢性結締組織疾病、膽石癥、嚴重肝腎功能不全、風濕性瓣膜性心臟病者；④先天性心臟病、慢性阻塞性肺疾病、高血壓性心臟病者；⑤有肝病史者；⑥近期內服用影響QRS波時限藥物者。選擇同期166例體檢正常者作為對照組，其中男性109例，女性57例；年齡49～71歲，平均(57.90±5.72)歲。受試者或家屬已簽署知情同意書。本研究方法符合《赫爾辛基宣言》。

1.2 檢測方法

1.2.1 樣本收集：收集CHD患者入院次日、體檢者體檢當日約5 ml空腹外周血，分離血清(3450 r/min離心10 min)后分裝，-80 ℃凍存于冰箱中。

1.2.2 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)測定血清miR-21、miR-29a水平：解凍適量血清，添加TRIzol裂解液(批號：GMS12279；深圳子科生物科技有限公司)，抽提總RNA。以紫外分光光度計檢測RNA濃度和純度。利用miScript Reverse Transcription Kit(批號：218061；北京綠源伯德生物科技有限公司)將RNA反轉錄成cDNA。以Taq Man?Fast Advanced Master Mix(批號：444963；上海恒斐生物科技有限公司)制備反應體系，使用qRT-PCR儀進行擴增、檢測。miR-21、miR-29a均以U6為內參，引物序列如表1所示。miR-21、miR-29a相對表達量以2-△△CT法計算。

表1 miR-21、miR-29a及內參U6引物序列

1.2.3 心電圖QRS波時限測量：利用心電圖機同步記錄所有研究對象標準12導聯體表心電圖(走紙速度25 mm/s，刻度0.1 mV/mm)。以12導聯中最寬QRS波計算QRS波時限。

1.2.4 酶聯免疫吸附法(ELISA)測定血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)水平：使用人TNF-α ELISA試劑盒(批號：YM-SZ0122；上海遠慕生物科技有限公司)、MMP-2 ELISA試劑盒(批號：DG11383H；北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司)配制TNF-α、MMP-2標準樣品溶液，于450 nm波長處測定標準品溶液吸光度，繪制TNF-α、MMP-2回歸曲線。測定血清樣本吸光度，與TNF-α、MMP-2標準回歸方程結合計算二者水平。

2 結 果

2.1 兩組一般資料比較 見表2。CHD組三酰甘油、總膽固醇、低密度脂蛋白水平較對照組升高，高密度脂蛋白較對照組降低(均P<0.05)。

表2 兩組一般資料比較

2.2 兩組血清miR-21、miR-29a相對表達水平及QRS波時限比較 見表3。CHD組心電圖QRS波時限較對照組明顯延長，血清miR-21、miR-29a表達水平較對照組明顯升高(均P<0.05)。

表3 兩組血清miR-21、miR-29a相對表達水平及QRS波時限比較

2.3 兩組血清MMP-2、TNF-α水平比較 見表4。CHD組患者血清MMP-2、TNF-α水平較對照組明顯升高(均P<0.05)。

表4 兩組血清MMP-2、TNF-α水平比較

2.4 CHD患者血清miR-21、miR-29a、QRS波時限與MMP-2、TNF-α相關性分析 見表5。Pearson相關性分析顯示，CHD患者血清miR-21水平、miR-29a水平及QRS波時限與MMP-2、TNF-α均呈正相關(均P<0.05)。

表5 CHD患者血清miR-21、miR-29a、QRS波時限與MMP-2、TNF-α相關性

2.5 CHD患者血清miR-21、miR-29a水平與QRS波時限相關性分析 Pearson相關性分析顯示，CHD患者血清miR-21、miR-29a與心電圖QRS波時限均呈正相關(r=0.516、0.389，均P<0.05)。

2.6 CHD發(fā)生影響因素Logistic回歸分析 見表6。以CHD是否發(fā)生為因變量，以三酰甘油、miR-21、總膽固醇、miR-29a、低密度脂蛋白、QRS波時限、高密度脂蛋白、TNF-α及MMP-2為自變量，行Logistic回歸分析，結果顯示miR-29a、QRS波時限、miR-21、MMP-2、TNF-α是影響CHD發(fā)生的危險因素(均P<0.05)。

表6 CHD發(fā)生影響因素Logistic回歸分析

3 討 論

冠心病以發(fā)作性絞痛、壓榨痛為主要臨床癥狀，且其病死率較高，對患者生理和心理健康構成嚴重威脅[8]。因此，尋找高效診斷和防治CHD的指標對提高CHD患者生命質量具有重要社會意義。

miRNA可參與調節(jié)炎癥反應、氧化應激反應、信號轉導等過程，也參與心肌肥厚、AS、心力衰竭等心血管類疾病[9-10]。miR-199a在心肌肥厚中表達異常，可影響心臟自噬，有望成為治療心臟病的潛在策略[11]。miR-21-5p在心肌梗死患者血清中表達失調，其為發(fā)生心肌梗死的危險因素，在心肌梗死發(fā)展進程中發(fā)揮一定作用[12]。miR-23a在冠狀動脈疾病中過表達，與冠狀動脈狹窄嚴重程度有關，可作為冠狀動脈疾病診斷和評估指標[13]。以上研究表明，miRNA異常表達與缺血性心血管疾病密切相關。miR-21是多種生物功能調節(jié)因子，在心力衰竭患者血清中表達上調，可能對心力衰竭的發(fā)生與發(fā)展至關重要[14]。miR-21-3p是miR-21成員之一，其在心肌肥厚中表達異常，有望成為心肌肥厚診治靶標[15]。以上研究表明，心力衰竭、心肌肥厚、缺血性心血管系統(tǒng)疾病中miR-21異常表達可影響疾病發(fā)生與發(fā)展。本研究中miR-21在CHD組水平明顯高于對照組，提示miR-21可能參與并影響CHD發(fā)生與發(fā)展進程。miR-29a在心肌肥厚中異常表達，其可能通過作用于過氧化物酶體增殖物激活受體δ(PPARδ)而影響心肌肥厚的發(fā)生與發(fā)展，有可能成為診治心肌肥厚的有效靶標[16]。miR-29a在心力衰竭中表達異常，有望成為心力衰竭預后評估指標。本研究中miR-29a在CHD組患者血清中水平明顯高于對照組，提示miR-29a可能在CHD發(fā)病過程中起一定作用。心電圖QRS波時限與心功能有關，QRS波時限延長是評估冠心病預后及心功能的重要指標[17-18]。本研究顯示CHD組患者QRS波時限長于對照組，提示QRS波時限可能影響并反映CHD發(fā)生與發(fā)展程度。

研究[19]顯示，MMP-2在CHD患者外周血單個核細胞中表達升高，與冠脈造影粥樣斑塊病變分型、粥樣硬化斑塊分型具有一定相關性，其在冠狀AS發(fā)展進程中發(fā)揮一定作用。TNF-α在CHD患者血漿中表達上調，是CHD發(fā)生的危險因素，可作為評估冠心病和冠脈病變程度指標[20]。本研究顯示，CHD患者血清TNF-α、MMP-2水平高于對照組，猜測兩者參與炎癥反應，進而促進AS發(fā)展，影響CHD，提示TNF-α、MMP-2可能參與CHD疾病發(fā)展過程。此外，本研究中CHD患者血清miR-21、miR-29a水平及QRS波時限與MMP-2、TNF-α呈正相關，提示miR-21、miR-29a、QRS波時限可能與TNF-α、MMP-2共同影響CHD發(fā)生與發(fā)展。另外，CHD患者血清miR-21、miR-29a與QRS波時限呈正相關，提示miR-21、miR-29a與QRS波時限相互影響，進而在CHD發(fā)病進展中發(fā)揮作用。本研究中miR-21、miR-29a、QRS波時限、MMP-2、TNF-α是影響CHD發(fā)生的危險因素，提示QRS波時限延長及miR-21、miR-29a、TNF-α、MMP-2水平升高均可能增加CHD患病風險，及時動態(tài)監(jiān)控上述指標有助于及早防治CHD。

綜上所述，miR-21、miR-29a在CHD患者血清中高表達，兩者均與QRS波時限呈正相關，共同影響CHD病理發(fā)展。但本研究未探究miR-21、miR-29a在CHD的作用機制，后續(xù)需深入研究。