AKT通路在大鼠彌漫性軸索損傷中的作用

金 濤,李東波,楊 濤,李從進,宋錦寧,王松林*

(1陜西省安康市中心醫(yī)院神經(jīng)外科,安康 725000;2陜西省安康市中醫(yī)院神經(jīng)外科;3西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科;*通訊作者,E-mail:263288612@qq.com)

彌漫性軸索損傷(diffuse axonal injury,DAI)后一系列生化和細胞反應(yīng)可導(dǎo)致繼發(fā)性的軸索斷裂,但具體機制不明[1,2]。絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase,AKT)在葡萄糖代謝、凋亡、細胞增殖、遷移等過程中起重要作用,不但與腦缺血過程中的細胞凋亡密切相關(guān),且神經(jīng)營養(yǎng)因子、缺血預(yù)處理和缺血后處理等也通過激活A(yù)KT通路抑制細胞凋亡,但是其在DAI病理生理過程中的作用仍不明確[3,4]。

本研究擬通過給予DAI大鼠AKT通路抑制劑,觀察AKT通路在大鼠DAI后細胞凋亡、膠質(zhì)反應(yīng)、軸索損傷中的作用,探索其潛在的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑及儀器

相同遺傳背景SPF級健康成年雄性SD大鼠48只,購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心(許可證號:SCXK(陜)08-018,合格證號:2007-001),體質(zhì)量250-280 g。所有實驗倫理經(jīng)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物醫(yī)學(xué)倫理委員會批準。AKT通路抑制劑LY294002(Sigma,19-142,美國);抗Neurofilament-H抗體(NF-H,CST,2836,美國);抗Caspase-3抗體(CST,9662,美國);抗cleaved Caspase-3抗體(C-Caspase-3,CST,9661,美國);抗Occludin-1、ZO-1、Claudin-5、MMP-9、β-APP)(ABCAM,ab216327,ab190085,ab172968,ab38898,ab15272,英國);抗GFAP抗體(CST,80788,美國);抗Iba-1抗體(ABCAM,ab178846,英國);抗Tau46、β-actin抗體(CST,貨號4019,貨號3700,美國);抗AKT抗體(CST,9272,美國)、抗phospho-AKT抗體(Ser473,P-AKT,CST,4060,美國)、抗GSK-3β抗體(CST,12456,美國)、抗phospho-GSK-3β(p-GSK-3β,Ser9,CST,5558,美國)。凝膠成像系統(tǒng)(JS-380A,上海培清科技有限公司)。

1.2 實驗動物分組

采用隨機數(shù)字表法對大鼠進行編號(從1編號到48),并將其分為對照組、DAI 1 d組、DAI 1 d+vehicle組、DAI 1 d+LY294002(LY)組,每組12只。對照組為正常大鼠,僅接受麻醉;大鼠經(jīng)瞬間旋轉(zhuǎn)損傷裝置造成DAI模型,DAI 1 d組大鼠在造模后1 d時取腦,DAI 1 d+LY組大鼠在造模后即刻側(cè)腦室注射LY294002(溶于DMSO,終濃度為10 μmol/L);DAI 1 d+vehicle組在造模后即刻注射DMSO。

1.3 DAI模型的建立

大鼠麻醉后,將大鼠頭顱固定于瞬間旋轉(zhuǎn)損傷裝置上,待大鼠將要清醒時,按下扳機,裝置使大鼠頭顱瞬間旋轉(zhuǎn)90°并即刻停止[5]。該實驗倫理經(jīng)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)倫理委員會批準。動物實驗及處死均符合相關(guān)的動物使用和保護條例。

1.4 腦室注射溶劑及AKT通路抑制劑

大鼠造模后固定于腦立體定向儀上,確定前囟,以前囟點為中心,旁開1.5 mm,向后囟方向1.1 mm,深4.5 mm[6]。大鼠在造模后立即注射DMSO及AKT通路抑制劑LY294002(均10 μl)。

1.5 HE染色觀察皮層病理變化

石蠟切片經(jīng)蘇木精液、伊紅液染色,中性樹膠封固。于Leica-Q550CW圖像采集與分析系統(tǒng)上采集、分析圖片。

1.6 免疫組織化學(xué)法檢測NF-H的表達

為評估DAI模型的有效性和穩(wěn)定性,利用免疫組化檢測DAI 1 d組大鼠皮層NF-H的表達,石蠟切片高壓修復(fù)抗原。山羊血清室溫封閉后加入抗NF-H一抗(1 ∶200),4 ℃孵育過夜。分別經(jīng)生物素化二抗(1 ∶5 000)、辣根酶標記鏈霉卵白素孵育,DAB顯色、蘇木素復(fù)染,封片。每張切片隨機選取6個視野(×200),Image-Pro Plus 6.0對切片進行半定量分析。免疫組化結(jié)果評分依據(jù)陽性細胞數(shù)和染色強度。陽性細胞數(shù)的評分標準：無細胞染色為0分,0<陽性細胞數(shù)≤10%為1分,10%<陽性細胞數(shù)≤50%為2分,50%<陽性細胞數(shù)≤80%為3分,80%<陽性細胞數(shù)≤100%為4分。染色強度評分標準：無染色為0分,弱染色為1分,中等強度染色為2分,強染色為3分。總分值為陽性細胞數(shù)分值×染色強度分值[7]。

1.7 Western blot檢測相關(guān)蛋白的表達

提取各組大鼠皮層組織蛋白,蛋白經(jīng)BSA試劑盒定量,各組蛋白經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后封閉,分別加入一抗Caspase-3(1 ∶1 000)、cleaved Caspase-3(C-Caspase-3,1 ∶1 000)、Occludin-1(1 ∶500)、ZO-1(1 ∶1 000)、Claudin-5(1 ∶1 000)、MMP-9(1 ∶1 000)、β-APP(1 ∶2 000)、GFAG(1 ∶1 000)、Iba-1(1 ∶1 000)、Tau46(1 ∶1 000)、AKT(1 ∶1 000)、p-AKT(1 ∶1 000)、GSK-3β(1 ∶1 000)、p-GSK-3β(1 ∶1 000),β-actin為內(nèi)參(1 ∶2 000),二抗孵育后顯影,凝膠成像系統(tǒng)拍照,Image J軟件作定量分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16.0進行數(shù)據(jù)分析,所有實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示,在滿足正態(tài)性和方差齊性的條件下,多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),兩兩比較采用LSD-t檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DAI后大鼠皮層組織病理改變及NF-H的表達

對照組皮層軸索完整,神經(jīng)元核仁清晰、完整。DAI 1 d組可見核固縮,軸突腫脹、扭曲(見圖1)。與對照組相比,DAI 1 d組NF-H的表達明顯升高(P<0.05,見圖1)。

圖1 大鼠DAI后皮層的病理改變及NF-H的表達 (HE染色,×200)Figure 1 Pathological changes and expression of NF-H in cortex of rats after DAI (HE staining,×200)

2.2 AKT通路抑制劑加重大鼠DAI后皮層細胞凋亡

與對照組相比,DAI 1 d組、DAI 1 d+vehicle組、DAI 1 d+LY組Caspase-3及C-Caspase-3的表達均升高。與DAI 1 d組相比,DAI 1 d+vehicle組Caspase-3及C-Caspase-3的表達無明顯差異(P>0.05);與DAI 1 d組相比,DAI 1 d+LY組Caspase-3及C-Caspase-3的表達量更高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖2)。

與對照組相比,*P<0.05;與DAI 1 d組相比,#P<0.05圖2 AKT通路對DAI大鼠皮層凋亡的影響Figure 2 Effect of AKT pathway on apoptosis in cortex of DAI rats

2.3 AKT通路抑制劑加重大鼠DAI后皮層BBB的破壞

與對照組相比,DAI 1 d組、DAI 1 d+vehicle組、DAI 1 d+LY組的Occludin-1、Claudin-5、ZO-1的表達均減少,MMP-9的表達增加(均P<0.05)。與DAI 1 d組相比,DAI 1 d+vehicle組各蛋白的表達無明顯差異(P>0.05);DAI 1 d+LY組的Occludin-1、Claudin-5、ZO-1的表達量更少,MMP-9的表達增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖3)。

與對照組相比,*P<0.05;與DAI 1 d組相比,#P<0.05圖3 抑制AKT通路加重大鼠DAI 1 d時皮層的BBB破壞Figure 3 Inhibition of AKT pathway increases BBB damage in cortex of DAI 1 d rats

2.4 AKT通路抑制劑加重大鼠皮層軸索損傷及膠質(zhì)反應(yīng)

與對照組相比,DAI 1 d組、DAI 1 d+vehicle組、DAI 1 d+LY組Tau46的表達均減少,β-APP、GFAP、Iba-1的表達均增加(P<0.05)。與DAI 1 d組相比,DAI 1 d+vehicle組各蛋白的表達均無明顯差異(P>0.05);DAI 1 d+LY組的Tau46的表達量更少,β-APP、GFAP、Iba-1的表達增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖4)。

與對照組相比,*P<0.05;與DAI 1 d組相比,#P<0.05圖4 抑制AKT信號通路加重DAI 1 d時的軸索損傷并促進膠質(zhì)細胞活化Figure 4 Inhibition of the AKT pathway increases axonal injury and glial cell activation in cortex of DAI 1 d rats

2.5 AKT通過下游GSK-3β發(fā)揮腦保護作用

與對照組相比,DAI 1 d組、DAI 1 d+vehicle組、DAI 1 d+LY組p-AKT及p-GSK-3β的水平均降低(P<0.05)。與DAI 1 d組相比,DAI 1 d+vehicle組P-AKT、P-GSK-3β的水平均無明顯差異(P>0.05);DAI 1 d+LY組P-AKT及P-GSK-3β的水平更低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖5)。

與對照組相比,*P<0.05;與DAI 1 d組相比,#P<0.05圖5 抑制AKT通路可抑制下游GSK-3β的磷酸化Figure 5 Inhibition of the AKT pathway inhibits phosphorylation of GSK-3 in cortex of DAI 1 d rats

3 討論

DAI主要表現(xiàn)為軸索扭曲、腫脹、斷裂及皮髓質(zhì)交界區(qū)穿行的血管中斷等[8]。本研究中DAI大鼠皮層可見細胞核固縮、軸突腫脹、扭曲、斷裂等,且NF-H的表達也升高,提示本研究所采用模型可真實地模擬臨床所見的DAI。此外,前期研究結(jié)果表明:本研究所采用的DAI模型,在傷后1-3 d時損傷最重[5,7],故本研究在傷后即刻給予AKT抑制劑,觀察傷后1 d時的病理生理變化。

激活的AKT通過磷酸化一系列細胞內(nèi)蛋白介導(dǎo)下游反應(yīng),調(diào)控細胞存活、生長、增殖等生理過程[9]。既往發(fā)現(xiàn)在大鼠皮層撞擊腦外傷模型中,給予AKT抑制劑,細胞凋亡明顯增加,AKT通路在腦外傷后發(fā)揮抗凋亡的作用[10,11]。本研究通過檢測Casapse-3及C-Caspase-3觀察DAI皮層的細胞凋亡情況,生理狀態(tài)下,Caspase-3以酶原的形式存在于胞漿中,在凋亡的早期被激活,裂解為兩個小分子的活性片段,這些活性片段導(dǎo)致細胞凋亡[12]。本研究發(fā)現(xiàn)DAI后1 d時,Caspase-3表達量增加,且其裂解產(chǎn)物C-Caspase-3的表達也增加,而給予AKT通路抑制劑后,Caspase-3、C-Caspase-3的表達量更多,提示AKT通路在DAI后發(fā)揮抗凋亡作用。

DAI后血腦屏障(blood brain barrier,BBB)通透性及超微結(jié)構(gòu)均發(fā)生改變,BBB通透性增加是造成腦水腫的主要原因之一[13]。生理情況下MMP-9幾乎不表達,DAI后MMP-9表達增多,MMP-9可降解ZO-1等蛋白,與腦微血管通透性增加密切相關(guān)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)DAI 1 d后,Occludin-1、Claudin-5、ZO-1的表達均減少,而MMP-9的表達升高,提示DAI后BBB完整性受到破壞,而AKT通路抑制劑使Occludin-1、Claudin-5、ZO-1的表達更低,MMP-9的含量更高,提示抑制AKT通路可加重BBB損傷。

Tau蛋白是神經(jīng)元的細胞骨架成分,DAI后Tau蛋白被分解成多肽,表達量減少[15]。DAI后也發(fā)生軸漿運輸障礙,引起β-APP在損傷部位異常聚集、表達上調(diào)[16]。AKT通路在軸索損傷中作用目前尚未報道,本研究中DAI 1 d后,Tau的表達量減少,而β-APP的表達明顯升高,而給予AKT通路抑制劑后,Tau的表達量更低,β-APP的表達量更多,提示抑制AKT通路可加重軸索損傷。

DAI后星型膠質(zhì)細胞及小膠質(zhì)細胞均能持續(xù)激活,釋放炎性細胞因子等細胞毒性物質(zhì),誘發(fā)神經(jīng)元死亡[17]。本研究中,DAI后GFAP及Iba-1的表達升高,提示皮層內(nèi)膠質(zhì)細胞活化。抑制AKT通路后,GFAP及Iba-1的表達更高,提示AKT通路被抑制后可加重DAI后的膠質(zhì)細胞活化。既往研究發(fā)現(xiàn),帕金森小鼠腦內(nèi)AKT通路被抑制后,星型膠質(zhì)細胞及小膠質(zhì)細胞的增殖則受到抑制[18]。

GSK-3β是AKT下游的重要蛋白,GSK-3β在細胞內(nèi)活性受雙位點磷酸化調(diào)控,在Tyr216磷酸化激活,在Tyr216去磷酸化或在Ser9磷酸化而失活[19,20]?；罨腁KT與GSK-3β結(jié)合后,誘導(dǎo)其向細胞膜轉(zhuǎn)位,磷酸化Ser活性位點而使其失活,最終影響GSK下游底物[21,22]。本研究中,DAI 1 d后AKT Ser473及GSK-3β Ser9的磷酸化水平均降低,而抑制AKT后,GSK-3β的磷酸化水平更低,提示AKT通過調(diào)控下游GSK-3β的磷酸化水平發(fā)揮腦保護作用。GSK-3β在腦缺血缺氧損傷、腦退行性疾病等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用。在缺血刺激后,AKT首先通過Ser473磷酸化而激活,繼而誘導(dǎo)包括GSK-3β在內(nèi)的促凋亡因子失活,最終抑制神經(jīng)細胞死亡,這是神經(jīng)元抵抗凋亡的機制之一[23-25]。

綜上,DAI后AKT通路被抑制,其可能通過調(diào)控下游GSK-3β的磷酸化水平破壞BBB,加重膠質(zhì)反應(yīng),最終導(dǎo)致軸索損傷和細胞凋亡。