芍藥甘草湯對炎癥后腸易激綜合征大鼠的干預(yù)作用和機(jī)制研究

武 蓓,常壯鵬,鄧貴鳳,2,邵云云*

(1山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部,太原 030001;2山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院臨床藥學(xué)室;*通訊作者,E-mail:shaoyunyun4466@163.com)

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)是一種常見的功能性胃腸道疾病,伴有腹痛和腹部脹大,煩躁不安和/或糞便性狀改變等主要臨床表現(xiàn)[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示,在我國IBS發(fā)病率約為5%-6%,其中由胃腸道炎癥引起的IBS又叫炎癥后IBS(post-inflammatory IBS,PI-IBS),約占IBS總病例的1/3[2]。PI-IBS指急性胃腸道炎癥恢復(fù)后仍存在持續(xù)的IBS癥狀,以腹痛和腹瀉為主,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量和增加經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。目前PI-IBS的病因尚不完全明確,多認(rèn)為與內(nèi)臟痛覺高敏感型、低度炎癥、腦-腸軸超敏反應(yīng)或腸道感染等有關(guān)[4]。由于其復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制,臨床上治療PI-IBS多為對癥治療(如東莨菪堿、復(fù)方地芬諾酯等),療效不確切且長期應(yīng)用會產(chǎn)生較大副作用[5]。中醫(yī)因其辨病與辨證相結(jié)合,整體調(diào)整,可彌補(bǔ)西醫(yī)治療方案的不足,減少西藥長期服用的不良反應(yīng),在PI-IBS治療方面有獨(dú)特優(yōu)勢。芍藥甘草湯(Shaoyao Gancao decoction,SGD)是著名的中藥經(jīng)典方劑,出自漢代張仲景的《傷寒論》,由白芍和甘草兩味中藥組成,有柔筋止痛之效,傳統(tǒng)用于多種痛癥和炎癥疾病的治療[6]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,SGD主要成分如芍藥苷和甘草次酸等均有解痙鎮(zhèn)痛的作用[7,8],本課題組最近也發(fā)現(xiàn)SGD可以明顯改善PI-IBS大鼠的腹痛腹瀉癥狀[9],但由于SGD成分眾多、作用靶點(diǎn)復(fù)雜,因此目前有關(guān)其治療PI-IBS的分子機(jī)制尚不完全清楚,難以有效進(jìn)行療效評價,成為限制其現(xiàn)代化和臨床應(yīng)用的瓶頸。

代謝組學(xué)主要研究機(jī)體內(nèi)源性代謝物質(zhì)整體變化規(guī)律,與中醫(yī)的整體觀念和辨證思維相一致。利用系統(tǒng)代謝組學(xué)研究方法篩選出組織和體液中多種代謝產(chǎn)物及活性成分,進(jìn)而發(fā)現(xiàn)藥物作用靶點(diǎn),充分發(fā)掘中藥復(fù)方的整體性作用機(jī)制和療效。本研究旨在探討SGD對PI-IBS大鼠的干預(yù)作用,并基于代謝組學(xué)研究大鼠血漿內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的差異,以期為中藥治療PI-IBS作用機(jī)制的研究提供客觀依據(jù)和新思路。

1 材料與方法

1.1 動物

雄性SD大鼠18只,體質(zhì)量(200±20)g,購于國家食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動物中心,合格證號:SCXK(京)2014-0013?？諝鉁囟?5 ℃,12 h明暗交替,大鼠可以自由進(jìn)食和飲水。

1.2 藥物與試劑

白芍(安徽精誠本草中藥飲片有限公司)、甘草(國藥樂仁堂河北藥業(yè)有限公司)飲片經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院張京平中藥師鑒定為正品,2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS,美國Sigma公司),色譜甲醇(美國Fisher公司)。

1.3 儀器

超高效液相色譜儀(日本島津公司),四級桿飛行時間質(zhì)譜儀Q-TOF(美國AB Sciex公司),DZF-6050型真空干燥箱(蘇州江東精密儀器公司),Kinetex XB-C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,2.6 μm),高速離心機(jī)(德國Biofuge公司),真空干燥箱(蘇州江東精密儀器公司)。

1.4 芍藥甘草湯的制備

稱取白芍和甘草飲片,按照質(zhì)量1 ∶1比例混合,加入10倍量的無菌雙蒸水,浸泡1 h,然后煎煮3次,每次1 h。合并濾液,濃縮至2.12 g/ml,放置在4 ℃冰箱中保存。

1.5 動物模型制備及給藥

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為正常組、PI-IBS模型組和芍藥甘草湯(SGD)組,每組6只。按照課題組前期方法[9]進(jìn)行造模處理:大鼠禁食過夜后,通過塑料導(dǎo)管將TNBS溶液(0.8 ml/只)注入結(jié)腸中造模28 d,同時正常組大鼠給予等量的生理鹽水,造模后通過測定大鼠的疾病活動指數(shù)(DAI)和內(nèi)臟痛閾值評定模型制備是否成功。本課題組前期采用SGD低、中、高劑量[6.25,12.5,25 g/(kg·d)]對PI-IBS大鼠給藥后發(fā)現(xiàn)高劑量組療效最為顯著[9],故本實(shí)驗(yàn)造模結(jié)束后SGD組給予25 g/(kg·d)灌胃給藥14 d。

1.6 大鼠DAI值和內(nèi)臟痛閾值的測定

記錄大鼠造模及給藥SGD后體質(zhì)量變化率、糞便潛血量和糞便性狀,共42 d,計算三者評分的均值,得到大鼠的DAI值。采用腹壁回縮反射實(shí)驗(yàn)檢測大鼠的內(nèi)臟痛閾值,將氣囊導(dǎo)管導(dǎo)入結(jié)腸,大鼠適應(yīng)30 min后,逐漸加壓,直到觀察到腹壁明顯收縮,記錄此時壓力值為內(nèi)臟痛閾值。

1.7 大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)考察及病理損傷評分

末次給藥24 h后,腹主動脈取血,4 000 r/min離心10 min取上清,-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ占Y(jié)腸組織,置于4%的甲醛溶液中固定,依次使用70%,80%,90%,95%的乙醇,二甲苯常規(guī)脫水,石蠟包埋,采用蘇木素-伊紅(HE)染色,光鏡觀察大鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)學(xué)變化并依照參考文獻(xiàn)[10]進(jìn)行病理損傷評分。

1.8 血漿樣本的處理

取各組大鼠血漿100 μl,加入300 μl甲醇渦旋震蕩3 min,13 000 r/min離心10 min,取上清液真空干燥(37 ℃),100 μl甲醇復(fù)溶,渦旋3 min,13 000 r/min離心10 min,取上清待測。

1.9 檢測條件

1.9.1 色譜條件 流動相水(A)和甲醇(B)梯度洗脫(0-2.0 min,5%B;2.0-8.0 min,5%-15%B;8.0-13.0 min,15%B;13.0-17.0 min,15%-30%B;17.0-22.0 min,30%B;22.0-26.0 min,30%-95%B;26.0-28.0 min,95%B;28.0-28.2 min,95%-5%B;28.2-30.0 min,5%B),流速0.3 ml/min,進(jìn)樣量5 μl。

1.9.2 質(zhì)譜條件 采用正離子(ESI+)/負(fù)離子(ESI-)模式,離子源參數(shù)設(shè)置:氣簾氣40 psi;離子化電壓為5 500 V(ESI+)/4 500 V(ESI-);噴霧氣50 psi;輔助加熱氣50 psi;溫度500 ℃。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

采用MarkerView1.3軟件處理數(shù)據(jù),導(dǎo)入SIMCA-P13.0軟件進(jìn)行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘方-判別分析(OPLS-DA)。通過VIP>1且P<0.05篩選正常組與PI-IBS組的差異代謝物,將代謝差異物導(dǎo)入MetaboAnalyst數(shù)據(jù)庫進(jìn)行代謝通路分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0處理,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠DAI值和內(nèi)臟痛閾值的測定

正常組大鼠體質(zhì)量逐步增加,糞便性狀正常,無潛血,平均DAI值偏低;與正常組比較,模型組大鼠在TNBS造模后體質(zhì)量明顯下降,出現(xiàn)稀便且大便潛血嚴(yán)重,平均DAI值明顯增加(P<0.05);與模型組比較,SGD組給藥后大鼠DAI值明顯降低(P<0.05,見圖1)。同時,與正常組大鼠相比,模型組大鼠內(nèi)臟痛閾值明顯下降(P<0.05),表明存在內(nèi)臟高敏感性;與模型組比較,SGD組給藥后大鼠內(nèi)臟痛閾值明顯提高(P<0.05,見圖1)。以上結(jié)果表明PI-IBS大鼠模型制備成功,SGD可明顯降低PI-IBS大鼠的DAI值和內(nèi)臟痛覺高敏感性。

與正常組比較,***P<0.001;與模型組比較,###P<0.001圖1 各組大鼠DAI值和內(nèi)臟痛閾值比較Figure 1 Comparison of DAI and visceral pain threshold of rats between groups

2.2 各組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)改變及病理損傷評分

正常組大鼠可觀察到腸黏膜組織完整、表面光滑,上皮細(xì)胞排列整齊有序,未見炎性浸潤損傷;模型組大鼠結(jié)腸組織明顯增厚、充血和腫脹,大部分腺體結(jié)構(gòu)消失,腸黏膜下層表現(xiàn)輕度充血和水腫;與模型組相比,SGD組大鼠結(jié)腸損傷明顯改善,腸黏膜趨于完整且排列整齊,未見炎癥細(xì)胞浸潤,與正常組結(jié)構(gòu)相似(見圖2)。與正常組相比,模型組大鼠結(jié)腸組織病理損傷評分明顯增加(P<0.05);與模型組比較,SGD組給藥后病理損傷評分明顯降低(P<0.05,見圖2)。

與正常組比較,***P<0.001;與模型組比較,###P<0.001圖2 各組大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)改變與病理評分比較 (HE,×100)Figure 2 Comparison of histopathological changes and pathological scores in the colon of rats between groups (HE,×100)

2.3 大鼠血漿代謝物PCA分析

在ESI+或ESI-下對正常組、PI-IBS組及SGD組大鼠血漿代謝物進(jìn)行PCA分析。在ESI+下,R2X為0.469,Q2為0.0731;在ESI-下,R2X為0.452,Q2為0.101,提示本次研究模型預(yù)測性和解釋性較好。血漿代謝物空間分布結(jié)果顯示各組樣本區(qū)分較好(見圖3),表明組間代謝物差異可有效辨別。

A. ESI+模式下PCA主成分分析圖 B. ESI-模式下PCA主成分分析圖 圖3 各組大鼠血漿代謝物PCA分析Figure 3 PCA analysis of plasma metabolites of rats in each group

2.4 大鼠血漿代謝物OPLS-DA分析

在ESI+或ESI-下對大鼠血漿代謝物進(jìn)行OPLS-DA分析。結(jié)果顯示正常組和PI-IBS組,PI-IBS組和SGD組間均明顯分離(見圖4),可用于進(jìn)一步尋找和分析組間差異成分。

圖4 各組大鼠血漿代謝物OPLS-DA分析Figure 4 OPLS-DA analysis of plasma metabolites of rats in each group

2.5 大鼠血漿差異代謝物的鑒定

采用UPLC-Q/TOF-MS方法對大鼠血漿內(nèi)源性代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測,結(jié)合OPLS-DA分析,正常組和PI-IBS組大鼠血漿共鑒定出30個差異代謝物(VIP>1且P<0.05);經(jīng)SGD干預(yù)后,有14個差異代謝物回調(diào)到正常水平(見表1)。

表1 PI-IBS組與正常組大鼠血漿差異代謝物 (未完待續(xù))

2.6 SGD作用于PI-IBS大鼠的代謝通路分析

正常組與PI-IBS組的差異代謝物經(jīng)MetaboAna-lyst進(jìn)行通路富集分析,發(fā)現(xiàn)PI-IBS大鼠主要有7條代謝通路發(fā)生異常改變,SGD干預(yù)后能夠調(diào)節(jié)其中的5條代謝通路,包括嘧啶代謝,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝,嘌呤代謝,乙醛酸和二羧酸的代謝和三羧酸(TCA)循環(huán)(見圖5)。

A.PI-IBS大鼠疾病條件下異常的血漿代謝通路分析圖 B.SGD干預(yù)PI-IBS的血漿代謝通路分析圖圖5 代謝通路分析Figure 5 Metabolic pathway analysis

3 討論

PI-IBS是一種常見的功能性胃腸道疾病,病因復(fù)雜多樣。中醫(yī)學(xué)中,PI-IBS屬于“腹痛”“泄瀉”等范疇,基本病機(jī)為肝郁氣滯、脾胃不和、脾虛濕盛,進(jìn)而引起腸道氣機(jī)不利,傳導(dǎo)失司[11]。調(diào)肝脾是治療該病的關(guān)鍵治法,除濕止瀉是治療該病的必要手段。SGD方中白芍性微寒,歸肝、脾經(jīng),有柔肝止痛之用,主治血虛腹痛、脅痛、痢疾等;甘草性平,歸脾、胃經(jīng),有補(bǔ)脾益氣之用,主治脾胃氣虛、脘腹、攣急疼痛等,與白芍合用,可顯著增強(qiáng)治腹痛腹瀉的療效[12]。近年來大量文獻(xiàn)報道,SGD對胃腸痙攣性腹痛、IBS等有非常好的療效[13]。本研究結(jié)果也顯示SGD可顯著改善PI-IBS大鼠排便異常癥狀,同時降低內(nèi)臟痛覺高敏感性,減輕結(jié)腸黏膜損傷,療效明顯,與本課題組前期研究結(jié)果一致[9],但其作用機(jī)制尚不完全明確。

代謝組學(xué)的整體性思路與中醫(yī)的系統(tǒng)觀、整體觀不謀而合,先進(jìn)的代謝組學(xué)分析技術(shù)為中藥復(fù)方多層次、多靶點(diǎn)治療的作用機(jī)制研究提供了新思路與新方法。在本研究中,通過對正常組、PI-IBS組及SGD組大鼠血漿樣本進(jìn)行代謝組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)PI-IBS大鼠體內(nèi)有30種代謝物水平發(fā)生明顯改變,而灌胃給予SGD后,這些差異代謝物中有14種恢復(fù)至正常水平,包括哌可啉酸、谷氨酰胺、亮氨酸、肉毒堿、乙酰半胱氨酸、甲基組氨酸、腺苷、尿酸、葡萄糖、羥基異己酸、胸苷、檸檬酸鹽、泛酸鹽、尿苷,可能涉及嘧啶代謝,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝,嘌呤代謝,乙醛酸和二羧酸的代謝和TCA循環(huán)等多條通路。

嘧啶代謝和嘌呤代謝主要以谷氨酰胺等為原料,腺苷、胸苷、鳥苷等為中間產(chǎn)物,最終合成嘧啶核苷酸和嘌呤核苷酸。這兩種代謝過程受一系列因子調(diào)控,當(dāng)某一環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題時會發(fā)生代謝紊亂,從而引發(fā)免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等多種疾病[14]。洪宗超等[15]報道潰瘍性結(jié)腸炎大鼠體內(nèi)嘧啶和嘌呤代謝發(fā)生異常。此外,孫倩倩[16]研究發(fā)現(xiàn)中藥半夏瀉心湯可通過調(diào)節(jié)嘧啶和嘌呤代謝恢復(fù)血清鳥苷、腺苷等水平進(jìn)而抑制慢性萎縮性胃炎大鼠炎癥反應(yīng)的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示SGD組大鼠血漿腺苷、胸苷、尿苷水平相較于PI-IBS組明顯上調(diào),提示SGD也可能通過促進(jìn)PI-IBS大鼠嘧啶和嘌呤代謝的恢復(fù)改善結(jié)腸炎癥。

本研究還發(fā)現(xiàn)SGD治療PI-IBS與其調(diào)節(jié)丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝等多種氨基酸代謝有關(guān)。氨基酸是腸道細(xì)胞生長和分化必要的營養(yǎng)物質(zhì),也是腸道微生物合成蛋白質(zhì)、嘧啶和嘌呤核苷酸及多種信號分子的必需前體和促進(jìn)劑。腸道氨基酸代謝對維持腸細(xì)胞營養(yǎng)、保護(hù)腸黏膜屏障、調(diào)節(jié)腸免疫功能至關(guān)重要[17]。因此,SGD可能通過對氨基酸代謝的調(diào)控促進(jìn)腸黏膜修復(fù)和減少炎癥反應(yīng)。

TCA循環(huán)是糖類、脂類及氨基酸的最終代謝通路,也是此三大營養(yǎng)物質(zhì)代謝聯(lián)系的樞紐,對于腸道細(xì)胞能量的獲取至關(guān)重要[15]。本研究結(jié)果顯示PI-IBS大鼠體內(nèi)葡萄糖含量明顯增加,TCA循環(huán)被抑制,其中間代謝產(chǎn)物檸檬酸明顯減少,線粒體供能不足,ATP生成減少,導(dǎo)致腸道免疫細(xì)胞和屏障細(xì)胞抗感染、抗侵襲和抗凋亡能力減弱,造成腸道損傷。有研究表明甘草配伍入藥后可通過影響TCA循環(huán)改善潰瘍性結(jié)腸炎大鼠癥狀[15],故本研究中SGD也可能通過增加PI-IBS大鼠檸檬酸水平促進(jìn)TCA循環(huán),為腸道細(xì)胞正常發(fā)揮腸道保護(hù)作用提供能量。此外,在能量代謝中,我們還發(fā)現(xiàn)SGD影響了PI-IBS大鼠體內(nèi)乙醛酸和二羧酸的代謝,此為TCA循環(huán)的支路,可補(bǔ)充某些中間代謝產(chǎn)物的不足,對于腸道微生物的代謝起著重要的作用。研究顯示腸道菌群失調(diào)會產(chǎn)生多種有害代謝產(chǎn)物從而損傷腸道黏膜,與IBS的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[18]。此外,本課題組前期研究結(jié)果表明SGD可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群減少LPS的釋放,并且降低腸道通透性,提示本研究中SGD可能通過影響腸道菌群代謝平衡進(jìn)而減輕腸道損傷,改善PI-IBS癥狀。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)SGD能夠明顯改善TNBS誘導(dǎo)的PI-IBS大鼠癥狀。進(jìn)一步采用UPLC-Q/TOF-MS和代謝組學(xué)技術(shù)分析,推測SGD干預(yù)PI-IBS大鼠的機(jī)制涉及嘧啶代謝,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝,嘌呤代謝,乙醛酸和二羧酸的代謝和TCA循環(huán)等多條通路,但其具體作用機(jī)制仍需在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究一定程度上為該中藥復(fù)方有效治療PI-IBS提供了現(xiàn)代理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。