TRIM22在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中致癌作用的機(jī)制研究

劉華鋒,王 超*,張 偉,張 明,夏 毅

(1空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院神經(jīng)外科,西安 710038;2陜西省康復(fù)醫(yī)院病理科;*通訊作者,E-mail:hzchenjin1971@163.com)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中的一種高異質(zhì)性腫瘤,起源于腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞[1]。大多數(shù)神經(jīng)膠質(zhì)瘤,即彌漫性神經(jīng)膠質(zhì)瘤,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)實(shí)質(zhì)中顯示出廣泛的浸潤(rùn);約占所有惡性腦腫瘤中的80%[2]。彌漫性神經(jīng)膠質(zhì)瘤根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)進(jìn)一步分為Ⅱ級(jí)(低級(jí))、Ⅲ級(jí)(間變性)或Ⅳ級(jí)(膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)的星形膠質(zhì)細(xì)胞,少突膠質(zhì)細(xì)胞或罕見的混合少突膠質(zhì)細(xì)胞-星形膠質(zhì)細(xì)胞[3]。目前治療膠質(zhì)瘤的方法多樣,一般都是結(jié)合手術(shù)加放療或化療的綜合治療方案。然而膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)率高,雖然可通過磁共振成像進(jìn)行檢測(cè),但它只能在宏觀水平上顯示腫瘤,所以仍需要探索一種新的治療膠質(zhì)瘤的方法。

含3個(gè)motif基序(tripartite motif,TRIM)家族有70多個(gè)成員;它們的共同結(jié)構(gòu)特征是保守的RING指、B-box和卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域[4]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,TRIM蛋白對(duì)細(xì)胞增殖、分化和凋亡、調(diào)節(jié)其他基因的轉(zhuǎn)錄以及參與蛋白質(zhì)的泛素化有很大作用[5]。TRIM家族的TRIM31是TRIM家族的一員,是E3泛素蛋白連接酶,最初被鑒定為由生長(zhǎng)抑制性類維生素A誘導(dǎo)的基因[6]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,TRIM在腫瘤進(jìn)展中起作用,例如促進(jìn)結(jié)直腸癌、膽囊癌和肝細(xì)胞癌的生長(zhǎng),同時(shí)可以抑制非小細(xì)胞肺癌的癌變[6,7]。然而,目前對(duì)TRIM在神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)展中的分子機(jī)制研究較少,本研究旨在探討TRIM22在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)模式及其功能。

1 材料和方法

1.1 材料和組織樣本

本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞系HEB、A172、U251和U87均購(gòu)自美國(guó)ATCC菌株保存庫(kù);DMEM培養(yǎng)基、Trizol試劑盒、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Green PCR Master Mix試劑盒、BCA蛋白分析試劑盒、化學(xué)增光劑和細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8購(gòu)于Thermo fisher公司(美國(guó));RIPA裂解緩沖液購(gòu)于Invitgen公司(美國(guó));一抗和二抗購(gòu)于Sigma(美國(guó))、Thermo fisher(美國(guó))和Abcam公司(英國(guó));TRIM22的shRNA序列由上海生工生物有限公司(中國(guó))合成;嘌呤霉素購(gòu)于Sigma公司(美國(guó));Transwell板購(gòu)于Corning公司(美國(guó))。

本研究收集了2018年5月至2020年3月在唐都醫(yī)院接受手術(shù)治療的30例膠質(zhì)瘤患者的膠質(zhì)瘤組織以及膠質(zhì)瘤旁正常組織,患者的平均年齡為44.35±2.67歲。本研究嚴(yán)格按照美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH)出版物“實(shí)驗(yàn)標(biāo)本組織提取使用指南”[8]進(jìn)行,并經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(No.2018-3-16-SW0181),所有患者均被告知并簽署了知情同意書。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和qRT-PCR分析

正常小膠質(zhì)細(xì)胞系HEB和膠質(zhì)瘤細(xì)胞系A(chǔ)172、U251、U87均在含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng),其培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5% CO2;根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)特性,每2-3 d更換1次培養(yǎng)基。

表1 qRT-PCR分析序所需引物序列

1.3 Western blotting分析TRIM22、E-cadherin、Vimentin、cyclin D1和cMyc蛋白表達(dá)水平

使用RIPA裂解緩沖液提取膠質(zhì)瘤組織樣本和細(xì)胞中的總蛋白;采用BCA蛋白分析試劑盒測(cè)定提取總蛋白的濃度。將蛋白質(zhì)與2×上樣緩沖液混合,于沸水浴10 min后制成上樣樣品;使用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白(上樣量大約為25 μg),然后轉(zhuǎn)膜至PMDF膜上。隨后,在室溫下用5%脫脂牛奶封閉PMDF膜1 h。將膜與抗TRIM22(1 ∶2 000)、E-鈣粘連蛋白(E-cadherin,1 ∶2 000)、波形蛋白(Vimentin,1 ∶2 000)、細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1,1 ∶2 000)、cMyc(1 ∶2 000)或β-肌動(dòng)蛋白(β-actin,1 ∶500)的一抗在4 ℃下孵育過夜,然后將膜先利用TBST洗膜3次,每次10 min;再將膜與各自的辣根過氧化物酶(HPR)偶聯(lián)的二抗(1 ∶2 000)于室溫孵育2 h。最后通過使用化學(xué)增光劑(ECL)及檢測(cè)軟件(Bio-Rad公司)分析條帶強(qiáng)度。

1.4 sh-TRIM22轉(zhuǎn)染及分組

通過將PCR擴(kuò)增的全長(zhǎng)TRIM22 cDNA克隆到pMSCV逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中,構(gòu)建TRIM22的過表達(dá)質(zhì)粒。sh-TRIM22的序列:5′-UAAGCUGGCCUCUUGACUAUC-3′;對(duì)照shRNA的序列:5′-CCCCUUUUAAAAAAAGGGGCCCGG-3′。將pMSCV-TRIM22質(zhì)粒和sh-TRIM22或?qū)φ誷hRNA共轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞;其轉(zhuǎn)染方法采用Lipofectamine 2000進(jìn)行細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)需求,為驗(yàn)證敲除TRIM22基因后,對(duì)U87細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的影響,將實(shí)驗(yàn)分為3組:Con-shRNA組、shRNA-TRIM22組和shRNA-TRIM22+LiCl組。Con-shRNA組細(xì)胞共轉(zhuǎn)染pMSCV-TRIM22質(zhì)粒和對(duì)照shRNA,shRNA-TRIM22組細(xì)胞共轉(zhuǎn)染pMSCV-TRIM22質(zhì)粒和sh-TRIM22,shRNA-TRIM22+LiCl組細(xì)胞共轉(zhuǎn)染10 μmol/L LiCl+pMSCV-TRIM22質(zhì)粒和sh-TRIM22(作為激活劑組)。

1.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

根據(jù)使用說明書,利用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)法檢測(cè)細(xì)胞增殖。將U87細(xì)胞接種于96孔板中,當(dāng)細(xì)胞密度為1×104個(gè)/孔時(shí),分別于0,12,24,36,48,72 h加入10 ml CCK-8溶液,37 ℃孵育1 h后,使用Thermo酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.6 細(xì)胞遷移和侵襲分析

使用孔徑為8 mm的Transwell板進(jìn)行Transwell試驗(yàn),并檢測(cè)細(xì)胞侵襲和遷移能力。將每毫升含1×105個(gè)U87細(xì)胞濃度的DMEM培養(yǎng)基(不含F(xiàn)BS,大約為100 μl)加入Transwell板上室,包被基質(zhì)(用于侵襲實(shí)驗(yàn))或不包被基質(zhì)(用于遷移實(shí)驗(yàn))。下室加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基。在孵育24 h后,去除頂部(未遷移)細(xì)胞,用4%甲醇處理20 min,再用0.1%結(jié)晶紫染色15 min。最后在顯微鏡(Nikon)下隨機(jī)選擇5個(gè)區(qū)域,并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),計(jì)算平均細(xì)胞數(shù)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 TRIM22在膠質(zhì)瘤患者組織樣本和細(xì)胞系中高表達(dá)

與膠質(zhì)瘤旁正常組織相比,膠質(zhì)瘤患者組織樣本中TRIM22的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高(P<0.01)。與正常小膠質(zhì)細(xì)胞系HEB細(xì)胞相比,膠質(zhì)瘤細(xì)胞系A(chǔ)172、U251和U87中TRIM22的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高(均P<0.01,見圖1),其中U87細(xì)胞系差異性最為顯著,后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇U87細(xì)胞系為研究對(duì)象。

與膠質(zhì)瘤旁正常組織相比,*P<0.05;與正常小膠質(zhì)細(xì)胞系HEB細(xì)胞相比,*P<0.05,**P<0.01圖1 TRIM22在膠質(zhì)瘤患者組織樣本和細(xì)胞系的表達(dá)情況Figure 1 Expression of TRIM22 in glioma tissues and cell lines

2.2 沉默TRIM22抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖

qRT-PCR和Western blotting結(jié)果表明,與Con-shRNA組相比,shRNA-TRIM22組U87細(xì)胞中TRIM22的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.01)。CCK-8比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果表明,與Con-shRNA組相比,shRNA-TRIM22組U87細(xì)胞的增殖顯著降低(P<0.05,見圖2)。

A.RT-PCR檢測(cè)TRIM22在U87細(xì)胞中的表達(dá) B.Western blotting檢測(cè)TRIM22在U87細(xì)胞中的表達(dá) C.CCK-8比色法測(cè)定U87細(xì)胞增殖情況1.Con-shRNA;2.shRNA-TRIM22;與Con-shRNA組相比,*P<0.05,**P<0.01圖2 沉默TRIM22抑制U87細(xì)胞增殖Figure 2 Silencing of TRIM22 inhibits the proliferation of U87 cells

2.3 沉默TRIM22抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲

與Con-shRNA組相比,shRNA-TRIM22組U87細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著降低(P<0.01,見圖3)。這表明,沉默TRIM22可顯著抑制U87細(xì)胞的遷移和侵襲。

A.Transwell法檢測(cè)U87細(xì)胞的遷移 (×100) B.Transwell法檢測(cè)U87細(xì)胞的侵襲 (×100)與Con-shRNA組相比,**P<0.01圖3 沉默TRIM22可抑制U87細(xì)胞的遷移和侵襲Figure 3 Silencing of TRIM22 inhibits migration and invasion of U87 cells

2.4 沉默TRIM22抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程

與Con-shRNA組相比,shRNA-TRIM22組U87細(xì)胞的EMT過程標(biāo)志蛋白E-cadherin的表達(dá)水平顯著升高,Vimentin蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01,見圖4)。

與Con-shRNA組相比,**P<0.01圖4 沉默TRIM22抑制了U87細(xì)胞中的EMT過程Figure 4 Silencing of TRIM22 inhibits EMT in U87 cells

2.5 沉默TRIM22抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞Wnt/β-catenin通路的激活

Western blotting結(jié)果表明,與Con-shRNA組相比,shRNA-TRIM22組U87細(xì)胞中cyclinD1和c-Myc蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P<0.01);與shRNA-TRIM22組相比,shRNA-TRIM22+LiCl組U87細(xì)胞中cyclinD1和c-Myc蛋白的表達(dá)水平顯著提高(P<0.01,見圖5)。與Con-shRNA組相比,shRNA-TRIM22組U87細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲受到顯著抑制;與shRNA-TRIM22組相比,shRNA-TRIM22+LiCl組U87細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力均顯著升高(P<0.01,見圖6)。

1.Con-shRNA；2.shRNA-TRIM22；3.shRNA-TRIM22+LiCl；與Con-shRNA組相比,**P<0.01;與shRNA-TRIM22組相比,##P<0.01圖5 沉默TRIM22可抑制U87細(xì)胞Wnt/β-catenin通路的激活Figure 5 Silencing of TRIM22 inhibits the activation of Wnt/β-catenin pathway in U87 cells

與Con-shRNA組相比,**P<0.01;與shRNA-TRIM22組相比,##P<0.01圖6 沉默TRIM22對(duì)U87細(xì)胞遷移和侵襲的影響 (×100)Figure 6 The effect of silencing TRIM22 on the migration and invasion of U87 cells (×100)

3 討論

盡管目前有多種形式的療法,包括安全手術(shù)切除、放療和替莫唑胺化學(xué)療法,但對(duì)于多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)的臨床治療仍然收效甚微[9]。GBM患者的預(yù)后仍然很差,迫切需要尋找新的治療方法以取得更好的治療效果。文獻(xiàn)報(bào)道,TRIM家族是重要的癌變調(diào)節(jié)劑,它們參與了許多細(xì)胞的生物學(xué)行為,同時(shí)TRIM蛋白因具有E3泛素連接酶活性而受到廣泛關(guān)注[10,11]。

TRIM24,又稱轉(zhuǎn)錄中介因子1,在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌和人宮頸癌中過表[12];TRIM27可促進(jìn)結(jié)直腸癌和卵巢癌的發(fā)展[13]。TRIM蛋白參與維持細(xì)胞內(nèi)部和外部環(huán)境所需的某些機(jī)制;但當(dāng)它們的基因改變時(shí),TRIM蛋白具有致癌潛力[10]。此外,一些TRIM蛋白通過調(diào)節(jié)p53在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中具有雙重作用[7]。因此,對(duì)TRIM蛋白的機(jī)制和參與腫瘤發(fā)生的進(jìn)一步研究可能為癌癥治療提供有效的靶標(biāo)。在這項(xiàng)研究中,我們發(fā)現(xiàn)TRIM22作為癌基因在高級(jí)別神經(jīng)膠質(zhì)瘤中過表達(dá)。

TRIM22是一種干擾素誘導(dǎo)蛋白,TRIM22最初被鑒定為一種干擾素誘導(dǎo)基因,并且還發(fā)現(xiàn)是TP53的轉(zhuǎn)錄靶基因[14]。TRIM22在大多數(shù)非小細(xì)胞肺癌組織中上調(diào),并且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期密切相關(guān),TRIM22的過表達(dá)可能促進(jìn)NSCLC的增殖和侵襲,提示了TRIM22作為癌基因的功能[15]。TRIM22抑制軟瓊脂中白血病U-937細(xì)胞的克隆生長(zhǎng),這表明TRIM22可能在白血病細(xì)胞增殖中發(fā)揮作用,并且TRIM22的水平升高與早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞的誘導(dǎo)分化有關(guān)[16]。然而,仍有文獻(xiàn)報(bào)道,沉默TRIM22基因后,它可以抑制細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[17]。這些結(jié)果提示TRIM22在癌癥中可能具有雙重作用。

TRIM22的這種雙重作用可能歸因于器官特異性的作用和不同的細(xì)胞環(huán)境[18]。本研究表明TRIM22在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)。TRIM22基因被敲除后抑制了U87細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。本研究的結(jié)果提示TRIM22在膠質(zhì)瘤中可能是一個(gè)癌基因。因此,如果將TRIM22抑制劑作為膠質(zhì)瘤治療藥物將具有重要意義。

在典型的Wnt信號(hào)通路途徑中,可通過Wnt蛋白與表面受體的結(jié)合而激活,從而抑制β-catenin的磷酸化和降解并調(diào)控c-Myc和cyclin D1等靶基因的轉(zhuǎn)錄[19]。Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)是整個(gè)動(dòng)物界發(fā)育的主要調(diào)節(jié)因子,Wnt也是成年哺乳動(dòng)物中大多數(shù)類型的組織干細(xì)胞的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素;對(duì)細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲等方面均有影響[20]。因此,抑制Wnt/β-catenin通路的激活可能成為膠質(zhì)瘤治療的一種新的治療辦法。本研究的結(jié)果表明,沉默TRIM22抑制了Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白的激活。此外,LiCl處理可減弱TRIM22對(duì)U87細(xì)胞的作用。

綜上所述,本研究的結(jié)果表明,TRIM22在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中表達(dá)顯著上調(diào);體外研究表明,TRIM22基因敲除抑制了U87細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。此外,TRIM22還通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin途徑發(fā)揮作用;這提示TRIM22在膠質(zhì)瘤中可能是一個(gè)潛在的致癌基因。