楊梅素衍生物對A549細(xì)胞的抑制作用

孫 利,陳付涼,孫新苑,孫 謙,江 浩*

(1蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤放療科,蚌埠 233004;2安徽省慢性疾病免疫學(xué)重點實驗室;3中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所,中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院;*通訊作者,E-mail:jianghao1223@163.com)

肺癌是最常見的人類惡性腫瘤之一,其死亡率在與癌癥相關(guān)的死亡原因中排名第一[1]。根據(jù)組織學(xué)特征,肺癌可分為小細(xì)胞肺癌(SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC),其中NSCLC約占80%以上[2]。迄今為止,雖然腫瘤靶向治療和免疫治療大大提高了NSCLC的治療水平,延長了肺癌患者的壽命[3,4],但大多數(shù)晚期肺癌仍不能達(dá)到很好的治療效果。因此,傳統(tǒng)化療仍發(fā)揮重要作用,篩選具有足夠腫瘤敏感性的藥物對非小細(xì)胞肺癌的治療具有深遠(yuǎn)意義。許多天然產(chǎn)物及其衍生物是藥物研發(fā)的主要來源,其中的生物活性成分不僅可以增強(qiáng)化療的療效,在一些情況下還能改善化療藥物的某些副作用[5]。楊梅素是從楊梅中分離出來的一種天然的黃酮類化合物,存在于許多植物中,包括漿果、葡萄、草藥、茶等。在過去的10年里,大量的證據(jù)表明楊梅素作為一種抗腫瘤、抗炎和抗氧化劑具有良好的生物活性[6-8]。在涉及多種類型癌細(xì)胞的研究中,楊梅素被證明可以抑制癌細(xì)胞(如肝癌、直腸癌、皮膚癌、肺癌等)的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移,誘導(dǎo)癌細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯和凋亡[9,10]。有研究表明楊梅素還有放療增敏的作用[11],這些發(fā)現(xiàn)提高了人們對楊梅素作為一種潛在的腫瘤抑制劑的興趣。本研究通過對楊梅素進(jìn)行修飾,旨在研究楊梅素衍生物對NSCLC細(xì)胞增殖和凋亡的影響,并進(jìn)一步探討放療增敏情況。

1 材料和方法

1.1 楊梅素衍生物的合成

本文所用楊梅素衍生物來源于貴州大學(xué)薛偉教授及其團(tuán)隊。楊梅素衍生物采用半合成法通過以下六個步驟進(jìn)行修飾合成:用甲基碘保護(hù)楊梅苷的羥基;暴露它的3個羥基;合成1,4-二溴丁烷;用1-叔丁氧羰基-4-甲氨基哌啶取代末端溴;去除叔丁氧羰基;與磺酰氯反應(yīng)得到化合物。經(jīng)過分離提純后將楊梅素衍生物溶解在DMSO中備用。

1.2 細(xì)胞株及主要試劑

A549細(xì)胞(ATCC,美國);DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(HyClone,美國);青霉素/鏈霉素(Gibco,美國)CCK-8、細(xì)胞凋亡試劑盒(碧云天生物試劑公司,中國);Ki67、DAPI抗體、吉姆薩染液(Sigma,美國);Transwell小室、Matrigel基質(zhì)膠(Corning,美國);Bcl-2、Bax、P53、cleaved Caspase-3蛋白抗體(CST,美國)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

A549細(xì)胞在含10%的胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM中培養(yǎng),于37 ℃、5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。

1.4 CCK-8實驗檢測細(xì)胞活力

首先取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞(3×104/ml)接種于96孔板。用培養(yǎng)基對楊梅素衍生物進(jìn)行稀釋,最終濃度為1,6,10 μmol/L,分別孵育24 h和48 h,共進(jìn)行了3次重復(fù)試驗,每組設(shè)有6個復(fù)孔,DMSO作為對照,孵育結(jié)束后每孔加入10 μl的WST-8,1 h后用酶標(biāo)儀單波長模式測定吸光度,檢測波長450 nm,參考波長630 nm。細(xì)胞活力公式:ODtest/ODcontrol×100%,半數(shù)抑制率IC50由GraphpadPrism得出。

1.5 Ki67檢測細(xì)胞增殖指數(shù)

將生長狀態(tài)良好的A549細(xì)胞(3×105/ml)接種于24孔板,加入6 μmol/L的楊梅素衍生物并孵育12 h。PBS洗滌3次,PFA固定10 min。加入0.1% Triton/PBS后,滴加1%牛血清白蛋白(BSA)封閉1 h,用鼠抗人的Ki67抗體(1 ∶200稀釋)4 ℃孵育過夜。再將細(xì)胞與山羊抗鼠抗體(1 ∶2 000稀釋)孵育1 h,DAPI(10 μg/ml)復(fù)染核后,用熒光顯微鏡觀察。

1.6 Transwell實驗檢測細(xì)胞侵襲能力

將基質(zhì)凝膠(5 mg/L)涂于腔內(nèi)膜的上表面,室溫風(fēng)干后,用含1% BSA無血清培養(yǎng)基水化基底膜(37 ℃孵育30 min),將細(xì)胞(1×105/ml)接種于上室,下室填充含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。加入6 μmol/L的楊梅素衍生物培養(yǎng)12 h后,用棉簽擦拭上膜層細(xì)胞,侵襲細(xì)胞用4%多聚甲醛固定20 min,蘇木精和伊紅染液(HE)染色,PBS洗3次,晾干后熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察計數(shù)。

1.7 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡

將對數(shù)生長期的A549細(xì)胞(1×106/ml)接種到6孔板中。待細(xì)胞培養(yǎng)貼壁后,更換培養(yǎng)基,加入6 μmol/L的楊梅素衍生物培養(yǎng)12 h。PBS洗滌后用0.5 ml不含EDTA的胰酶消化,終止消化后離心去上清并用1 ml PBS重懸至1.5 ml EP管中。再次離心加入200 μl結(jié)合液輕輕重懸后加入Annexin Ⅴ-FITC和PI。室溫避光孵育15 min,尼龍網(wǎng)過濾后流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。

1.8 Western blot檢測Bcl-2、Bax、P53、cleaved Caspase-3的表達(dá)

將對數(shù)生長期的A549細(xì)胞(2×105/ml)接種到6孔板中,待細(xì)胞培養(yǎng)貼壁后,更換培養(yǎng)基,加入6 μmol/L的楊梅素衍生物培養(yǎng)12 h,每孔加入50 μl RIPA蛋白裂解液,離心取上清后,用BCA蛋白定量法測定蛋白濃度并用沸水煮至10 min,加入Loading buffer上樣緩沖液離心5 min。按計算得到的所需樣本量加入到凝膠孔中,電壓調(diào)至80 V,待溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠且條帶清晰分離時,將電壓調(diào)至120 V,待溴酚藍(lán)進(jìn)入電泳液終止并在200 mA電流下進(jìn)行轉(zhuǎn)模,室溫下封閉30 min。按1 ∶1 000的比例分別稀釋β-actin、Bcl-2、Bax、P53、cleaved Caspase-3一抗,搖床搖晃4 ℃過夜。TPBS 1 ∶5 000稀釋二抗后,進(jìn)行顯影。

1.9 集落形成實驗檢測藥物的放射增敏效果

將不同密度(100,200,300,500,1 000個細(xì)胞)的A549細(xì)胞種于6孔板上,培養(yǎng)24 h。細(xì)胞貼壁后加入1.2 μmol/L接近IC20濃度的楊梅素衍生物孵育24 h。然后用0,2,4,6,8 Gy的劑量對細(xì)胞進(jìn)行照射,正常條件下培養(yǎng)14 d。當(dāng)細(xì)胞生長到肉眼可見的集落后,甲醇室溫下固定15 min,Giemsa染液染色20 min。通過計算菌落存活率來評價楊梅素衍生物的放射增敏效果。用GraphPad Prism 8根據(jù)多靶單擊模型(S=1-(1-e-D/D0)N)擬合細(xì)胞存活曲線,計算輻射敏感性參數(shù)SER。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 楊梅素衍生物對A549細(xì)胞活力的影響

楊梅素衍生物溶解在DMSO中,其化學(xué)式見圖1。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞,用楊梅素衍生物處理后,無論24 h還是48 h,當(dāng)藥物濃度為6 μmol/L時A549細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯的變化,細(xì)胞變圓皺縮,細(xì)胞數(shù)量減少,這一現(xiàn)象在48 h觀察時更為明顯。用CCK-8試劑檢測細(xì)胞活力,藥物24 h的IC50為5.65 μmol/L。與DMSO對照相比,細(xì)胞在與6 μmol/L楊梅素衍生物孵育后,細(xì)胞活力顯著抑制(P<0.001,見圖2)。

5,7-二甲氧基-3-(4-(甲基(1-(苯磺?；?哌淀基)氨基)丁氧基)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)-4H-色烯-4-酮圖1 楊梅素衍生物的結(jié)構(gòu)式Figure 1 Structural formula of the myricetin derivative

與DMSO對照組比較，***P<0.001圖2 不同濃度的楊梅素衍生物對A549細(xì)胞活力的影響Figure 2 Effects of different concentrations of the myricetin derivative on A549 cell viability

2.2 楊梅素衍生物對A549細(xì)胞增殖指數(shù)的影響

Ki67免疫熒光試驗結(jié)果顯示,與DMSO對照相比,6 μmol/L楊梅素衍生物處理12 h后,Ki67陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.01,見圖3)。

圖3 楊梅素衍生物對A549細(xì)胞增殖指數(shù)的影響Figure 3 Effects of the myricetin derivative on A549 cell proliferation index

2.3 楊梅素衍生物對A549細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell檢測結(jié)果顯示,與DMSO對照相比,楊梅素衍生物有效抑制A549細(xì)胞的侵襲能力(P<0.001,見圖4)。

與DMSO對照組比較，***P<0.001圖4 楊梅素衍生物對A549細(xì)胞侵襲能力的影響Figure 4 Effect of the myricetin derivative on the invasion ability of A549 cells

2.4 楊梅素衍生物對A549細(xì)胞凋亡的影響

流式結(jié)果顯示,當(dāng)用6 μmol/L楊梅素衍生物培養(yǎng)12 h后,細(xì)胞的凋亡率為(22.5±4.5)%,與DMSO對照組相比有明顯的的提高(P<0.05,見圖5)。

與DMSO對照組相比，*P<0.05圖5 楊梅素衍生物對A549細(xì)胞凋亡的影響Figure 5 Effect of the myricetin derivative on the apoptosis of A549 cells

2.5 楊梅素衍生物對A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示,楊梅素衍生物可上調(diào)Bax/Bcl-2蛋白的表達(dá)量(P<0.001),下調(diào)P53蛋白的表達(dá)(P<0.001),同時使cleaved Caspase-3的表達(dá)顯著增高(P<0.001,見圖6)。

與DMSO對照組比較，***P<0.001圖6 楊梅素衍生物對A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 6 Effects of the myricetin derivative on the expression of apoptosis-related proteins in A549

2.6 楊梅素衍生物對A549細(xì)胞的放射增敏效果

集落形成實驗顯示,與DMSO對照組相比,楊梅素衍生物聯(lián)合放療可有效降低細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù),同時放射增敏參數(shù)SER達(dá)到1.31(見圖7)。

圖7 楊梅素衍生物對A549細(xì)胞放射增敏的影響Figure 7 Effects of the myricetin derivative on radiosensitization of A549 cells

3 討論

肺癌是全世界癌癥相關(guān)死亡的最常見原因,且預(yù)后一直很差。然而,在過去的10年里,肺癌治療取得了重要的進(jìn)步,如精準(zhǔn)醫(yī)療等現(xiàn)有醫(yī)療的廣闊前景,給肺癌的治療帶來了諸多機(jī)遇。這也使肺癌的生存率得到了初步提高。但是對于一些亞群,如表現(xiàn)欠佳的患者和老年患者,新的靶向治療還沒有建立完整框架[12,13]。因此,基于新的治療手段的局限性及傳統(tǒng)化療的特點,研發(fā)對肺癌敏感的藥物有深遠(yuǎn)意義。楊梅素作為一種黃酮類化合物廣泛存在大自然中。近年來,對于楊梅素的抗腫瘤作用及分子機(jī)制研究較多,可作為藥物研發(fā)的重要來源[10,14]。

本研究通過對楊梅素進(jìn)行修飾,并在A549細(xì)胞上進(jìn)行驗證,探討其抗腫瘤活性及基本機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn),修飾后的楊梅素對A549細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用。先前的研究表明,楊梅素在肝癌、順鉑耐藥的卵巢癌等腫瘤中有較明顯的抗增殖作用[15,16],相比之下,修飾后的楊梅素抗增殖作用有了進(jìn)一步提高。同時,細(xì)胞侵襲能力顯著下降。Zhao等[17]研究發(fā)現(xiàn)在多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U-87細(xì)胞中,楊梅素通過與PI3K/Akt和JNK信號直接結(jié)合從而抑制PI3K催化異構(gòu)體的活性,進(jìn)而減少局部粘連,膜折疊和血管生成,最終抑制細(xì)胞入侵和轉(zhuǎn)移行為。

細(xì)胞凋亡是多細(xì)胞生物中破壞和異常細(xì)胞被清除的有序生化過程,是一種調(diào)控細(xì)胞死亡的形式[18]。本研究結(jié)果表明楊梅素衍生物促進(jìn)了細(xì)胞凋亡比率,同時誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。闡明在特定人類癌癥的特定條件下如何調(diào)控細(xì)胞凋亡,可能有助于開發(fā)新的抗腫瘤藥物。一系列研究已經(jīng)證明了楊梅素可促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡,提示有可能用于腫瘤的促凋亡治療。OVCAR-3和A2780/CP70順鉑耐藥卵巢癌細(xì)胞株對楊梅素的細(xì)胞毒性作用比正常的IOSE-364卵巢癌細(xì)胞更敏感,可通過Bcl-2和p53相關(guān)途徑選擇性的抑制腫瘤細(xì)胞生長[19]。楊梅素作用后,Bcl-2蛋白家族通過對線粒體膜通透性完整性的影響和促凋亡蛋白Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、Bcl-2拮抗劑/殺傷劑(Bak)等的釋放,以及cleaved Caspase-3激活Caspase-3級聯(lián)反應(yīng)參與內(nèi)在凋亡途徑[20]。同樣,在人肝癌HepG2細(xì)胞中,楊梅素通過增加Bax/Bcl-2比值、激活Caspase-3、誘導(dǎo)細(xì)胞色素C線粒體的釋放誘導(dǎo)凋亡,同時還可通過降低磷酸化水平誘導(dǎo)Akt/P70s6k/Bad信號相關(guān)的細(xì)胞凋亡[21]。

放射治療(RT)是目前腫瘤治療的主要手段之一,在所有腫瘤患者中有超過50%的人在治療過程中的關(guān)鍵節(jié)點,都會選擇接受放射治療[22]。然而,高劑量放療時對瘤旁正常組織的損傷等問題,嚴(yán)重限制腫瘤放射治療的效果。因此,如何提高腫瘤細(xì)胞的放射敏感性、特異性及增加腫瘤組織的局部放射劑量已成為目前腫瘤放療研究的熱點和重點,應(yīng)用放療增敏劑是常見的提高放射治療效果的方法。Zhang等[11]研究表明楊梅素聯(lián)合放療對A549細(xì)胞及H1299細(xì)胞有放射增敏作用。本研究采用IC20濃度的楊梅素衍生物作為放射增敏的驗證,以排除藥物本身的殺傷作用,并觀察到細(xì)胞的存活曲線相對于對照組有明顯的下移。這個結(jié)果為楊梅素在同步放化療中的應(yīng)用做了初步的嘗試。

綜上,楊梅素衍生物不僅對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的增殖及侵襲有抑制作用,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),同時可作為放射增敏劑增加放療療效。