優(yōu)化河蝦中4種硝基呋喃的前處理檢測(cè)方法

竇銀花 田懷香 鄭小平

摘要 [目的]優(yōu)化河蝦中4種硝基呋喃的前處理方法。[方法]以標(biāo)準(zhǔn)方法中37℃的衍生溫度下衍生17.0 h為對(duì)照，優(yōu)化衍生溫度和衍生時(shí)間，在陰性河蝦中加入酸性提取液和衍生試劑2-硝基苯甲醛。[結(jié)果]在80℃的衍生溫度下衍生2.0 h，提取效率和標(biāo)準(zhǔn)方法接近，反復(fù)試驗(yàn)6次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差都小于10%，除了呋喃妥因（AHD）響應(yīng)偏小，相對(duì)偏差值較大。4種硝基呋喃代謝物的檢出限為0.25 μg/kg，定量限為0.50 μg/kg，在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)線性良好，3個(gè)水平的回收率在90%～110%。[結(jié)論]該方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、可重復(fù)且靈敏，可以滿足河蝦中硝基呋喃殘留量的監(jiān)測(cè)要求。

關(guān)鍵詞 硝基呋喃代謝物;河蝦;衍生溫度;衍生時(shí)間;前處理方法;優(yōu)化

中圖分類號(hào) TS254.7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2021）02-0189-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.02.051

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Optimization of Pretreatment Detection Methods for Four Nitrofurans in Shrimp

DOU Yinhua1，TIAN Huaixiang2，ZHENG Xiaoping1 （1.Shanghai Bino Testing Technology Service Co.，Ltd.，Shanghai 200101;2.Shanghai Institute of Technology，Shanghai 201418）

Abstract [Objective] To optimize the pretreatment methods of 4 kinds of nitrofurans in river shrimp.[Method]Taking the derivatization temperature of 37℃ in the standard method for 17.0 h as the control，the derivative temperature and time were optimized.Acid extract and derivative reagent 2nitrobenzaldehyde were added to the negative shrimp.[Result] The derivative temperature was 80℃ and the derivative time was 2.0 h， the extraction efficiency was close to the standard method，and the relative standard deviation was less than 10% after 6 times of repeated experiments，except that the response of nitrofurantoin （AHD） was smaller and the relative deviation was larger.At the same time，the experiment found that the detection limit of the four nitrofuran metabolites was 0.25 μg/kg，and the limit of quantification was 0.50 μg/kg，the linearity was good in the range of standard curve，and the recoveries of three levels were between 90% and 110%.[Conclusion]The method has the advantages of simple and fast operation，accurate results，good repeatability and high sensitivity，and can meet the monitoring requirements of nitrofuran drugs in shrimp.

Key words Nitrofuran metabolites; Shrimp; Derivative temperature; Derivative time;Pretreatment method;Optimization

硝基呋喃類藥物對(duì)大多數(shù)革蘭氏菌、真菌和原蟲等病原體均有預(yù)防和控制的作用，是一種合成型廣譜抗生素，生產(chǎn)成本低、藥效顯著、耐藥性差、應(yīng)用廣泛，大量用于河蝦和畜牧業(yè)[1-3]。硝基呋喃代謝物主要包括呋喃唑酮（AOZ）、呋喃它酮（AMOZ）、呋喃妥因（AHD）、呋喃西林（SEM），是一類帶有5-硝基呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)化合物[4-5]，長(zhǎng)期食用此類藥物，會(huì)誘導(dǎo)有機(jī)體發(fā)生突變和癌變[6-7]。從21世紀(jì)初開始，中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)明確規(guī)定動(dòng)物食品中獸藥的最大殘留限量，禁止在動(dòng)物食品中檢出硝基呋喃類獸藥[8-9]。 歐盟和亞洲等許多國(guó)家也規(guī)定，硝基呋喃代謝產(chǎn)物在動(dòng)物食品中不得檢出。

截至目前，硝基呋喃代謝物的檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)（ELISA）[10]、免疫膠體金技術(shù)（GICT）[11]、快速檢測(cè)法-酶聯(lián)免疫法[12]、光譜分析法-分光光度法[13]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[14]，其中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法應(yīng)用最為廣泛，并制定了相關(guān)方法的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。該研究通過優(yōu)化樣品前處理方法，包括提高衍生溫度、縮短衍生時(shí)間，建立了硝基呋喃代謝物的殘留檢測(cè)方法，并將3種不同濃度的硝基呋喃代謝物添加到河蝦空白樣品中，為測(cè)定河蝦中的硝基呋喃代謝產(chǎn)物提供快速、高效和準(zhǔn)確的方法[15]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 儀器。安捷倫1290-6470超高壓液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent ），配備大氣壓電噴霧電離源（ESI）; 電子天平（梅特勒-托利多）;渦旋振蕩器（TALBOYS）;高速勻漿機(jī)（FLUKO）;高溫恒溫干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.1.2 試材。乙腈、乙酸乙酯和正己烷均為色譜純。 鹽酸、二甲基亞砜、2-硝基苯甲醛、磷酸二氫鉀和氫氧化鈉均為優(yōu)級(jí)純，試驗(yàn)前稱取75.0 mg 2-硝基苯甲醛溶于5 mL 二甲亞砜中，現(xiàn)配現(xiàn)用;實(shí)驗(yàn)室水取自PURELAB超純水儀。

標(biāo)準(zhǔn)品包括氨基脲（SEM）、5-甲基嗎琳-3-氨基-2-惡唑烷基酮（AMOZ）、3-氨基-2-噁唑烷基酮（AOZ）和1-氨基-乙丙酰脲（AHD），均為德國(guó) Dr.Ehrenstorfer 公司產(chǎn)品，純度≥99%。內(nèi)標(biāo)物包括5-甲基嗎啉-3-氨基-2-噁唑烷基酮的同位素內(nèi)標(biāo)物 （AMOZ-D5）、1-氨基-2-內(nèi)酰脲的同位素內(nèi)標(biāo)物 （AHD-13C3）、3-氨基-2-噁唑烷基酮的同位素內(nèi)標(biāo)物 （AOZ-D4）、氨基脲的同位素內(nèi)標(biāo)物 （SEM-13C15N2），均為德國(guó) Witega 公司產(chǎn)品，純度≥99%。樣品河蝦購(gòu)自超市。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理。

于50 mL離心管中稱入2.00 g樣品，加入4種硝基呋喃內(nèi)標(biāo)，加入10 mL萃取溶液 0.2 mol/L鹽酸勻漿，加入150 μL 衍生試劑2-硝基苯甲醛，并充分振蕩。在恒溫干燥箱中，將溫度分別設(shè)置為37、60、70、80和90℃，并將衍生時(shí)間分別設(shè)置為1、2、3、4、5和17 h，其中只有37℃時(shí)的衍生物需衍生17 h[15]。取出離心管，冷卻至室溫，加入適量的磷酸氫二鉀，充分混合，加入15 mL 乙酸乙酯，渦旋振蕩2 min后，然后在-4.0 ℃時(shí)，于10 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心 3 min 后，取出乙酸乙酯至另一個(gè)50 mL 離心管中，再重復(fù)提取一次，合并上層乙酸乙酯，在50℃下氮吹至近干，加入乙腈和水（1+9）1.0 mL復(fù)溶，過0.22 μm 濾膜上機(jī)待測(cè)。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的配制。

將100 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別準(zhǔn)確地移取100、200、500 μL到3個(gè)50 mL離心管中，將10 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別準(zhǔn)確地移取50、100、500 μL到3個(gè)50 mL離心管中，并添加50 μL、100 ng/mL的混合內(nèi)標(biāo)溶液到6個(gè)離心管中。同樣品一起衍生，標(biāo)準(zhǔn)曲線的工作濃度分別為0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL，內(nèi)標(biāo)濃度為5.0 ng/mL。

1.2.3 儀器條件。

液相條件：色譜柱為Poroshell 120（3.0 mm×100 mm，2.7 μm）;流動(dòng)相為乙腈和2.0 mmol/L乙酸銨甲酸水溶液（含0.1%甲酸）;進(jìn)樣量為5.0 μL。梯度洗脫條件如表1所示。質(zhì)譜參數(shù)（ESI）：干燥氣溫度350℃，干燥氣流量為10.0 mL/min，毛細(xì)管電壓3 500 V，MRM多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，具體參數(shù)見表2。

1.2.4 回收率的測(cè)定。

4種硝基呋喃代謝物設(shè)置1.0、2.0、5.0 ng/mL 3個(gè)添加水平，按照“1.2.1”方法預(yù)處理樣品，通過“1.2.3”儀器條件檢測(cè)，并由峰面積來定量，算出回收率和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化 將4種濃度為10 ng/mL的硝基呋喃代謝物于37℃恒溫干燥箱中衍生17 h后進(jìn)行測(cè)定，只有在較高濃度條件下優(yōu)化目標(biāo)藥物的質(zhì)譜條件，目標(biāo)化合物才有較高的響應(yīng)值。根據(jù)農(nóng)業(yè)部783號(hào)公告-1-2006《河蝦中硝基呋喃代謝物殘留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》中給出的定量離子和定性離子，優(yōu)化了傳輸電壓和碰撞能量，確定最佳質(zhì)譜條件見表2，標(biāo)準(zhǔn)工作液的質(zhì)譜圖見圖1。

2.2 色譜條件優(yōu)化 試驗(yàn)表明，甲酸在正離子模式下可以提高離子化效率，但峰形不對(duì)稱，會(huì)拖尾，在流動(dòng)相中加入乙酸銨緩沖鹽，可以改善峰形，提高了化合物在C18柱上的保留效果，從而提高了化合物的響應(yīng)值和靈敏度，所以水相采用2.0 mmol/L 乙酸銨甲酸水溶液（含0.1%甲酸）。試驗(yàn)表明，與甲醇相比，乙腈作為有機(jī)相時(shí)峰形較對(duì)稱尖銳，靈敏度更高。

對(duì)各物質(zhì)的峰形和響應(yīng)值會(huì)產(chǎn)生影響的還有流速和洗脫梯度。 調(diào)整流動(dòng)相的洗脫程序和改變流速，觀察峰形和響應(yīng)值的變化。試驗(yàn)表明在0.4 mL/min的流速下，使用表1中的洗脫梯度，具有理想的峰形，無拖尾和良好的對(duì)稱性。4種硝基呋喃代謝物保留時(shí)間均在4 min之內(nèi)（圖2），且將乙腈比例調(diào)至95%，并保持1 min，將殘留在色譜柱中的樣品雜質(zhì)沖洗干凈，使得保持儀器的靈敏度，降低儀器的信噪比、保證保留時(shí)間的重現(xiàn)性好，再將流動(dòng)相比例恢復(fù)至初始化比例，提高靈敏度，降低噪音。

2.3 前處理方法的優(yōu)化

河蝦中蛋白質(zhì)和脂肪含量較高，衍生時(shí)加入過量的鹽酸，不僅提供有利的衍生環(huán)境，還能提高水解速率，釋放出脂肪中的目標(biāo)物，也利于提高衍生效率。衍生試劑的量太少，衍生不完全，衍生試劑的量太多，導(dǎo)致浪費(fèi)，添加150 μL的衍生試劑不僅可以使反應(yīng)充分，還可以節(jié)省成本。加入適量的磷酸氫二鉀緩沖鹽，可以中和多余的鹽酸，調(diào)節(jié)pH至中性偏堿，不用精確調(diào)節(jié)每個(gè)樣品的酸堿度，大大提高大批量樣品處理的效率。冷凍離心，取上層乙酸乙酯吹干，既可以不用有機(jī)溶劑，保護(hù)環(huán)境，也可以節(jié)約成本，提高效率。

試驗(yàn)研究了衍生化的時(shí)間和溫度與硝基呋喃代謝物響應(yīng)值之間的變化關(guān)系。以37℃恒溫衍生17 h為對(duì)照，比較了其他幾種溫度和時(shí)間下的衍生效果，結(jié)果表明（表3），4種代謝物的響應(yīng)值隨著溫度增加和時(shí)間延長(zhǎng)而增大，在80℃ 下衍生2 h時(shí)的響應(yīng)值和37℃下衍生17 h時(shí)的響應(yīng)值接近，在80℃的衍生溫度下衍生更長(zhǎng)時(shí)間響應(yīng)變化不大，或在90℃的衍生溫度下衍生2 h或更長(zhǎng)時(shí)間響應(yīng)值不變或略微下降。因此，選擇在80℃恒溫下反應(yīng)2 h作為河蝦中硝基呋喃代謝物的衍生條件。

2.4 方法驗(yàn)證

2.4.1 方法的線性關(guān)系、檢出限和定量限。根據(jù)上述“1.2.2”方法，采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果見表4。將4種待測(cè)組分分別添加到空白試劑和陰性河蝦中，信噪比（S/N）為3時(shí)計(jì)算檢出限，S/N為10時(shí)計(jì)算定量限，從表4可以看出，4種硝基呋喃代謝物線性相關(guān)性較好，檢出限為0.25 μg/kg，定量限為0.50 μg/kg。

2.4.2 回收率和精密度。

向陰性的河蝦中加入標(biāo)準(zhǔn)物測(cè)定回收率和精密度，樣品前處理與“1.2.1”相同。加入1.0、2.0、5.0 ng/mL的含量，重復(fù)試驗(yàn)6次，然后計(jì)算加標(biāo)回收率和RSD，結(jié)果見表5。從表5可以看出，3個(gè)水平的添加回收率在90.2%～109.2%，RSD在1.2%～7.6%。因此該方法滿足4種硝基呋喃代謝物在河蝦中殘留量的測(cè)定。

3 結(jié)論

該試驗(yàn)優(yōu)化了河蝦中4種硝基呋喃代謝物的前處理方法。通過對(duì)衍生時(shí)間和衍生溫度的優(yōu)化，確定在80℃溫度下衍生2 h，也能達(dá)到檢測(cè)方法要求，同時(shí)確定和驗(yàn)證該方法的檢出限為0.25 μg/kg，定量限為0.50 μg/kg ，在0.50～50.00 ng/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系好，回收率高，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小。該方法具有快速、方便、準(zhǔn)確、高效、回收率高、重復(fù)性好的優(yōu)勢(shì)，大大地縮短了前處理時(shí)間，提高工作效率，降低檢驗(yàn)成本，又可以對(duì)河蝦中4種硝基呋喃代謝物進(jìn)行精準(zhǔn)的定性和定量，滿足河蝦中硝基呋喃代謝物殘留量的監(jiān)控要求，保障食品安全，守住食品安全的最后一道防線。

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