菟絲子水提物對子宮內(nèi)雙酚A暴露小鼠的生殖保護作用

李淑穎，耿玉萌，崔宇擎，盧春雨，史萬玉,2*，包永占,2*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學 中獸醫(yī)學院，河北 保定 071000；2.河北省中獸藥工程技術(shù)研究中心，河北 保定 071000)

雙酚A(bisphenol A，BPA)，2，2-二(4-羥基苯基)丙烷，是一種典型的內(nèi)分泌干擾化合物(endocrine-disrupting chemicals，EDCs)[1]。分子式為C15H16O2，其單體可直接通過酯鍵聚合。酯鍵可以被酸、堿水解而釋放單體[2]，進入機體可具有雌激素活性及抗雄激素活性，會干擾機體正常的內(nèi)分泌功能，影響生殖系統(tǒng)及子代生長發(fā)育[3]。BPA從1992年開始被生產(chǎn)，廣泛用于生產(chǎn)生活中，例如超市、銀行柜臺的機打購物票據(jù)中[4]、一次性紙杯的內(nèi)涂層[5]、啤酒易拉罐[6]等。由于日常生活中的大量應(yīng)用，大氣顆粒[7]甚至在土壤[8]中都檢測到BPA的存在。這樣就會使BPA通過飲水、飲食、呼吸等途徑進入到人體產(chǎn)生富集，對機體造成一定程度的損傷。在現(xiàn)有的研究中已經(jīng)證明暴露BPA對子代雌鼠具有生殖損傷[9]，BPA也可以直接作用于下丘腦-垂體-卵巢軸(HPOA)，還可以間接地通過雌激素受體、表觀遺傳學、類固醇激素相關(guān)酶的表達及其活性調(diào)節(jié)改變HPOA的生理效應(yīng)[10]。大量研究表明BPA不僅可以影響生殖器官的形態(tài)和功能還可以抑制胎兒的早期發(fā)育，從而增加妊娠母體的流產(chǎn)率，并產(chǎn)生多種生殖毒性[11]。

菟絲子為旋花科植物南方菟絲子(CuscutaaustralisR.Br.) 或菟絲子(CuscutachinensisLam.) 的干燥成熟種子，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品[12]。古代醫(yī)者用菟絲子配伍不同中藥治療腰膝酸軟等腎虛病證及生殖系統(tǒng)疾病[13]?，F(xiàn)代研究也證明菟絲子具有保肝補腎[14]、調(diào)節(jié)生殖內(nèi)分泌、改善生殖損傷[15]等多種作用。目前，對BPA造成的生殖損傷的緩解作用研究多集中在藥物的單體成分[16-17]，而鮮有研究涉及藥物水提物對BPA的生殖損傷的緩解作用。本試驗將針對孕期暴露BPA的孕鼠所產(chǎn)的子代雌性小鼠進行試驗，主要研究菟絲子水提物緩解BPA所導(dǎo)致子代雌性小鼠的損傷作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑BPA(分析純≥99%,Sigma,USA)；NaOH(分析純≥96%，天津市恒興化學試劑制造有限公司)；無水乙醇(分析純≥99.7%,天津市富宇精細化工有限公司)；Go Taq?PCR Master Mix(A6001 Promega,USA)；GoScriptTMReverse Transcription System(A5001,Promega,USA)；Eastep?Super總 RNA提取試劑盒(LS1040,Promega,北京)；小鼠雌激素受體α(ERα) ELISA Kit、小鼠雌二醇(E2) ELISA Kit、小鼠孕酮(P4) ELISA Kit、小鼠BPA ELISA Kit(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)。

1.2 試驗儀器防漏水瓶(蘇杭科技器材有限公司，蘇州)；MDF-383E超低溫冷凍箱(日本SANYO Electric Biomedical公司，日本)；T10BS25組織勻漿機(IKA公司，美國)；LightCycler?96全自動熒光定量PCR儀(羅氏診斷產(chǎn)品有限公司，上海)；SQP 電子分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司，北京)；Multiskan Ascent酶標儀(Thermo，USA)。

1.3 實驗動物分組及處理8周齡昆明小鼠75只購自斯貝福(北京)生物科技有限公司，SPF級別，許可證號：SCXK(京2019-0010)，其中雄鼠25只，雌鼠50只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，每日給予光照、黑暗各12 h，飼養(yǎng)環(huán)境溫度保持在(25±0.5)℃，濕度50%～60%，自由采食和飲水。1周后于20：00以后合籠，第2天9：00前檢查陰栓，發(fā)現(xiàn)陰栓的當天定為懷孕的第1天。本試驗將50只懷孕母鼠均分為5組每組10只，分別為空白對照組(K組),模型對照組(M組),菟絲子水提物0.7(D組),1.4(Z組),2.8 g/kg(G組)劑量組。雌性小鼠從懷孕的當天早上檢查確認懷孕后開始分籠，1只/籠。K、M、D、Z、G各組每天分別灌服不同劑量的(0.0，0.0，0.7，1.4，2.8 g/kg)菟絲子水提物0.3 mL/只，其中K、M組灌胃0.9% 生理鹽水0.3 mL/只，M、D、Z、G組均按照5 mg/kg 的劑量飲用含BPA的水。待小鼠21日齡斷乳當天進行取樣。本試驗中實驗動物的使用經(jīng)河北省動物保護協(xié)會批準，動物處理過程通過實驗動物管理和使用委員會的動物倫理學審查。

表1 實驗動物處理方式

1.4 菟絲子水提液的制備菟絲子先后依次經(jīng)過清洗、浸泡、煎煮、過濾、濃縮等程序提取藥液。稱取50 g菟絲子，清洗后用40倍的水即2 000 mL浸泡2 h。先用600 mL浸出液武火煮沸后改文火2 h(判定標準是水不能沒過紗布包即關(guān)火)，紗布過濾出上清約為200 mL。再重復(fù)3次以上操作，保證菟絲子的熬制時間要大于6 h[18]。將3次所得藥液微火熬制250 mL，放入水浴中90℃[19]濃縮至50 mL，即每 1 mL 藥液相當于1 g 生藥量。菟絲子在人類臨床用量為6～12 g[12]，按照9 g計算，人與小鼠的換算系數(shù)為9.1，菟絲子3組給藥劑量分別為0.7,1.4,2.8 g/kg。

1.5 指標測定

1.5.1生產(chǎn)指標 在子代小鼠出生之前記錄孕期時長(d)、孕期增重(g)；子代小鼠出生后，記錄產(chǎn)子總數(shù)(個)、出生窩重(g)、出生均重(g)、死胎數(shù)(個)；處死之前記錄體質(zhì)量及雌雄比(雌鼠只數(shù)/雄鼠只數(shù)×100%)。

1.5.2子代斷乳雌鼠臟器系數(shù)計算方法 小鼠測體質(zhì)量，眼球采血后脫頸處死，取出卵巢除去多余脂肪后，用分析天平測質(zhì)量。

卵巢系數(shù)=卵巢質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)×100%。

1.5.3子代斷乳雌鼠血清中激素的測定 小鼠測體質(zhì)量后，眼球摘除采血，血液經(jīng)3 500 r/min離心10 min，離心后收集血清，按照購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司的E2、P4、BPA試劑盒說明書進行操作，用酶標儀檢測D值。

1.5.4子代斷乳雌鼠卵巢中ER含量測定 將100 mg 卵巢組織勻漿成1 mL含0.9%生理鹽水的混懸液，3 500 r/min離心15 min，離心后吸取上清液，按照購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司的ERα試劑盒說明書進行操作，酶標儀檢測樣品D450 nm值。

1.5.5子代斷乳雌鼠卵巢中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3a(Dnmt3a)、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3b(Dnmt3b)、ERα及孕酮受體(PR) mRNA的表達水平 使用總RNA提取試劑盒提取卵巢總RNA。通過RNA質(zhì)量鑒定D260 nm/D280 nm值為1.9～2.1，D260 nm/D230 nm值為2.0～2.5，以證明RNA未被DNA、蛋白質(zhì)及有機試劑污染，也沒有發(fā)生大量降解。隨后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以GAPDH作為內(nèi)參基因，用RT-qPCR法對Dnmt3a、Dnmt3b、ERα及PR基因轉(zhuǎn)錄水平進行檢測，引物由TaKaRa(大連，中國)設(shè)計并合成(表2)。使用LightCycler?96全自動熒光定量PCR儀設(shè)置程序：預(yù)變性95℃ 30 s；95℃ 5 s,64℃ 30 s,72℃ 30 s，40個循環(huán)。以2-ΔΔCt法計算各目的基因相對轉(zhuǎn)錄水平。

表2 引物信息

2 結(jié)果

2.1 孕期增重由圖1可以看出，前15 d各組孕鼠的增重沒有顯著變化(P>0.05)，但是與K組相比M組孕期總增重顯著降低(P<0.05)。與M組相比，1.4，2.8 g/kg菟絲子水提液可使孕期總增重顯著增加(P<0.05)。

2.2 孕期、產(chǎn)子總數(shù)、出生窩重、出生均重、死胎數(shù)、雌雄比由表3可以看出，與K組相比，M組母鼠所生后代的死胎數(shù)顯著升高(P<0.05)，而Z組與M組相比死胎數(shù)顯著降低(P<0.05)。Z組與M組相比表現(xiàn)為雌雄比顯著降低(P<0.05)，其余4個指標無顯著性差異(P>0.05)。

與正常對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與模型組相比，# P<0.05，## P<0.01。下同

表3 BPA暴露對妊娠母鼠生產(chǎn)指標的影響

2.3 BPA暴露對卵巢系數(shù)的影響由表4可以看出，在21日齡斷乳時空白組、模型組、菟絲子水提液組各組織間卵巢系數(shù)均無顯著性差異。

表4 BPA暴露對卵巢系數(shù)的影響

2.4 妊娠期暴露BPA對子代斷乳雌鼠血清BPA、E2、P4水平的影響從圖2可以看出與K組相比，M、D、G組BPA水平均表現(xiàn)為顯著升高(P<0.05)，而Z組與K組之間無顯著性差異(P>0.05)，說明孕鼠暴露BPA對子代雌鼠血清中BPA水平是有遺傳性影響的，并且1.4 g/kg菟絲子水提液可以降低雌仔鼠血清中BPA含量。

圖2 妊娠期暴露BPA對子代斷乳雌鼠血清BPA、E2、P4水平的影響

與K組相比，M組和G組E2水平均表現(xiàn)為顯著降低(P<0.05)；與M組相比，Z組血清中的E2水平表現(xiàn)為極顯著升高(P<0.01)。

與K組和M組相比，Z組均表現(xiàn)為P4水平顯著升高(P<0.05)，D 和G組與K、M組均無顯著性差異，說明1.4 g/kg菟絲子水提液可以更好地提高孕激素水平。

2.5 妊娠期暴露BPA對子代斷乳小鼠卵巢中ERα含量的影響由圖3可以看出，與K組相比，G組卵巢的組織勻漿中ERα極顯著升高(P<0.01)；與M組相比,G組ERα表現(xiàn)為極顯著升高(P<0.01)；M組與K組相比表現(xiàn)出ERα降低的趨勢但是無顯著性差異(P>0.05)。

圖3 妊娠期暴露BPA對子代斷乳小鼠卵巢中ERα水平的影響

2.6 孕期暴露BPA對子代斷乳雌鼠卵巢中Dnmt3a、Dnmt3b、ERα、PR mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響從圖4可以看出,在21日齡斷乳時，與K組相比，M、Z、G組雌鼠的Dnmt3a mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著降低(P<0.05)；與M組相比，D組表現(xiàn)為顯著升高(P<0.05)。而21日齡雌鼠的Dnmt3b mRNA轉(zhuǎn)錄水平無顯著性差異(P>0.05)。

圖4 妊娠期暴露BPA對子代斷乳雌鼠Dnmt3a、Dnmt3b mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響

從圖5可以看出，在21日齡斷乳時，與K組相比D組雌鼠的ERα mRNA水平顯著升高(P<0.05)，與M組相比也顯著升高(P<0.05)。21 d雌鼠的PR mRNA水平無顯著性差異(P>0.05)。

圖5 妊娠期暴露BPA對子代斷乳雌鼠ERα、PR mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響

3 討論

BPA暴露的方式包括玉米油灌胃[22]、腹腔注射[23]、飲水給藥[24]等多種，飲水給藥因?qū)υ惺蟠碳ぽ^小而廣泛采用。近年來多項研究表明BPA無明顯副作用劑量(no-observed-adverse-effect-level，NOAEL)遠遠小于美國食品藥品管理局(food and drug administration，F(xiàn)DA)所規(guī)定的50 mg/(kg·d)[25-26]。妊娠期和新生兒期是BPA暴露最為敏感時期，在發(fā)育的各個階段以低于暴露極限安全范圍(lowest-observed-effectlevel,LOAEL)或者認為是安全劑量暴露于BPA的時候也會產(chǎn)生多種不良反應(yīng)[27]。

本研究顯示孕期暴露BPA可以顯著降低孕鼠懷孕期間的總增重，所產(chǎn)仔代死胎率增加，這與WANG等[28]的研究結(jié)果一致；說明BPA確實可以造成胚胎的發(fā)育不良。而1.4，2.8 g/kg菟絲子水提液可以改善由于BPA暴露造成的對胚胎增重所造成的不良影響。1.4 g/kg菟絲子水提物可顯著緩解BPA造成的死胎增多的現(xiàn)象，說明菟絲子水提物對BPA導(dǎo)致的胚胎發(fā)育不良有緩解作用。此外，本試驗結(jié)果表明BPA不會改變性別比與產(chǎn)子數(shù)，這一結(jié)果與SOMM等[29]的研究一致。在21日齡時沒有發(fā)現(xiàn)卵巢系數(shù)的顯著性差異(P>0.05)，可能與卵巢的質(zhì)量太輕誤差較大，或是統(tǒng)計數(shù)量不夠不足以看到差異有關(guān)。

本試驗檢測仔鼠血清中BPA的殘留量發(fā)現(xiàn)，21日齡時與空白對照組相比，模型組、0.7和2.8 g/kg菟絲子水提液劑量組均表現(xiàn)為BPA顯著增高(P<0.05)，而1.4 g/kg菟絲子水提物劑量組與空白組之間沒有顯著性差異(P>0.05)，說明孕鼠暴露BPA對子代雌鼠血清中BPA水平是有遺傳性的[30]， 1.4 g/kg 菟絲子水提物劑量組可以降低子雌鼠血清中BPA含量,因此，推測1.4 g/kg菟絲子水提物能較好緩解BPA對仔鼠的損傷作用可能與其顯著降低仔鼠體內(nèi)BPA殘留有關(guān)。機體的激素水平在一定范圍內(nèi)維持平衡，E2和P4變化能反映機體生殖內(nèi)分泌的功能，母鼠暴露BPA可導(dǎo)致子一代小鼠E2和P4水平極顯著降低[31]。但是對于雌性小鼠來說1.4 g/kg菟絲子水提液可提高E2、P4水平。分析M組與G組均表現(xiàn)為E2水平的顯著降低，但是原因應(yīng)該不同，模型組是由于BPA的弱雌激素效應(yīng)，抑制小鼠體內(nèi)E2的正常產(chǎn)生，所以檢測到E2水平降低。2.8 g/kg菟絲子水提液劑量組可導(dǎo)致E2水平的持續(xù)升高從而引發(fā)機體自我調(diào)節(jié)作用所造成的E2的下降。對于雄性小鼠來說0.7，2.8 g/kg劑量的菟絲子水提液可以導(dǎo)致E2水平異常升高的現(xiàn)象，分析可能是由于BPA在體內(nèi)殘留所致，BPA在體內(nèi)與E2競爭ERα導(dǎo)致機體產(chǎn)生E2增加。

ERα能以二聚體的形式與E2結(jié)合，啟動雌激素應(yīng)答元件轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮雌激素效應(yīng)[32]，對于雌性小鼠的卵巢發(fā)育以及生殖起著重要的作用。由于BPA的弱雌激素效應(yīng)，抑制小鼠體內(nèi)E2的正常產(chǎn)生，正常產(chǎn)出的E2減少從而導(dǎo)致模型組的ERα水平呈下降趨勢。雖然2.8 g/kg的菟絲子水提液也表現(xiàn)為E2激素減少，但同時菟絲子也可以刺激機體產(chǎn)生大量的ERα反過來刺激機體E2的回升。

DNA甲基化在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(Dnmt)催化下發(fā)生并維持[33]，Dnmt3a和 Dnmt3b參與從頭合成甲基化過程[34]，對基因調(diào)控、突變、基因組印跡和細胞生長、發(fā)育、分化等方面都有重要影響。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的降低不利于成熟配子對印跡基因的維持，可能導(dǎo)致多種發(fā)育疾病發(fā)生[35]。對于21日齡的雌性小鼠來說模型組的Dnmt3a mRNA 水平表現(xiàn)為顯著降低，這與魏媛媛等[9]的研究一致，確定BPA會對子代小鼠造成不良影響，0.7 g/kg的菟絲子水提液可以顯著升高Dnmt3a mRNA水平，說明其對于BPA造成的損傷可起到緩解作用。

對于雌性小鼠來說0.7 g/kg的菟絲子水提液組的ERα mRNA水平顯著升高(P<0.05)，PR mRNA水平也表現(xiàn)出升高的趨勢(P>0.05)，但1.4，2.8 g/kg 的菟絲子水提液劑量組卻并不能看出明顯的改變，ERα、PR mRNA水平與菟絲子提取液劑量之間存在非線性關(guān)系，其原理有待進一步研究分析。

本研究結(jié)果表明，妊娠期暴露BPA能顯著擾亂子代21日齡斷乳雌鼠生殖激素的活性與含量；擾亂生殖激素受體水平，擾亂DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的基因表達；仔鼠血清中BPA水平、DNMT基因水平說明BPA可通過母體遺傳給下一代，并具有一定生殖毒性。綜合來說使用1.4 g/kg的菟絲子水提液可在一定程度上改善這種紊亂現(xiàn)象，但是也有一些由于菟絲子水提液引起的檢測指標異常的現(xiàn)象，其原因有待進一步分析研究。