奶牛乳房炎性無乳鏈球菌藥敏試驗(yàn)及毒力基因檢測

劉 凱，顧小龍，張立梅，曲偉杰

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650201)

奶牛乳房炎是奶牛養(yǎng)殖生產(chǎn)中最為常見的疾病,常見的奶牛乳房炎病原菌主要為金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌等[1],而無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae,S.agalactiae)是奶牛乳房炎最重要的病原菌之一[2]。人們在奶牛乳房炎的防治上投入大量時(shí)間和財(cái)力，但是仍然沒有解決根本上的問題，這給奶牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響奶牛養(yǎng)殖業(yè)的總體發(fā)展。國內(nèi)外對奶牛乳房炎病的報(bào)道較多，全球約有2.2億頭奶牛，其中1/3奶?；加懈黝愋腿榉垦?；國內(nèi)關(guān)于乳房炎發(fā)病率的報(bào)道均在 46%～70%之間；在丹麥，平均每頭奶牛每年的損失估計(jì)超過 200 美元；在美國每年因乳房炎造成的損失就達(dá)20億美元，德國為4.5億馬克，中國每年此項(xiàng)損失為1.35億元[3]。而目前治療奶牛乳房炎最普遍的方法仍然是抗生素療法，大量的抗生素在乳房炎中得到了廣泛應(yīng)用，然而在臨床上奶牛乳房炎的防治中過度使用抗生素，導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性也不斷增強(qiáng)，導(dǎo)致“乳中殘留”和“耐藥菌株產(chǎn)生”等嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題[4]。

無乳鏈球菌可攜帶多種與致病性和持續(xù)性感染相關(guān)的毒力因子，例如表面蛋白和黏附因子。目前，無乳鏈球菌的毒性基因中已經(jīng)報(bào)道了Alp家族，CAMP因子、HylB，ScpB(C5a肽酶)、Lmb蛋白、FbsA、Sip蛋白和溶血素。致病細(xì)菌的毒性是侵襲性(包括入侵，黏附，定植，繁殖，傳播和免疫逃避)和毒性(包括內(nèi)毒素和外毒素)共同作用的結(jié)果[5]。

本試驗(yàn)是為調(diào)查山東的某奶牛養(yǎng)殖場奶牛乳房炎病例中無乳鏈球菌的感染狀況和生物學(xué)特性,通過藥物敏感性試驗(yàn)進(jìn)行調(diào)查分析,為有效治療該病及科學(xué)合理的使用治療藥物提供依據(jù)；檢測其毒力基因攜帶情況，為其他地區(qū)無乳鏈球菌引發(fā)疾病的致病因素研究提供必要的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病料來源山東某奶牛場3年左右泌乳期荷斯坦奶牛，乳區(qū)表現(xiàn)出紅、腫、熱、痛等典型的炎癥反應(yīng)，擠出乳汁中往往含有絮狀凝乳塊甚至含有血液，可綜合診斷為患有臨床型乳房炎。采集該廠奶牛乳樣200份進(jìn)行進(jìn)一步細(xì)菌學(xué)檢查及后續(xù)實(shí)驗(yàn)室檢測。

1.2 主要試劑MHA瓊脂培養(yǎng)基、愛德華培養(yǎng)基、細(xì)菌DNA提取試劑盒(離心柱型)、LB肉湯、5%綿羊平板、藥敏試紙(青霉素、慶大霉素、萬古霉素、氧氟沙星、氨芐西林、慶大霉素、新生霉素、氯霉素、頭孢哌酮 、恩諾沙星、克林霉素、紅霉素)、引物(上海生工生物有限公司合成)、Taq酶、DNA Maker、ddH2O、瓊脂糖等均由本室保存。

1.3 主要儀器恒溫水浴鍋、恒溫生化培養(yǎng)箱、超凈工作臺、高壓滅菌器、離心機(jī)、微量移液器、PCR管、PCR擴(kuò)增儀、凝膠電泳儀、凝膠成像系統(tǒng) 、超微量紫外光分光光度計(jì)。

1.4 細(xì)菌的分離培養(yǎng)先在5%綿羊血培養(yǎng)基上涂布乳房炎奶樣于37℃培養(yǎng)24 h進(jìn)行初步分離，將疑似鏈球菌菌落形態(tài)的單菌落接種于無乳鏈球菌選擇培養(yǎng)基——改良愛德華培養(yǎng)基上進(jìn)行進(jìn)一步純化鑒定，挑取疑似菌落(淡藍(lán)色，菌落周圍不變黑褐色)接種于5%馬血清的LB液體培養(yǎng)基中搖菌過夜，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 提取細(xì)菌基因組使用“細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒”提取無乳鏈球菌基因組DNA，具體操作方法依相應(yīng)說明書。

1.6 引物的設(shè)計(jì)與合成進(jìn)行PCR擴(kuò)增與序列測定以無乳鏈球菌全基因組DNA為模板，然后參照 GenBank數(shù)據(jù)庫中已報(bào)道過的無乳鏈球菌16S rRNA基因序列設(shè)計(jì)引物(表1)。將配好的反應(yīng)溶液渦旋混勻，短暫離電后，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后,其產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收。測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行同源性比對分析。

1.7 藥敏試驗(yàn)藥敏試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法。用微量移液器吸取稀釋好的菌液(2×106CFU/mL)200 μL 滴于含5%馬血清的MHA瓊脂平板上，用經(jīng)過滅菌處理的L型玻璃棒均勻涂布菌液，加蓋靜置15 min左右，待平板面稍干。用滅菌后的鑷子分別將12種藥敏紙片平放在含5%馬血清的MHA瓊脂平板上輕輕壓緊，并置于37℃溫箱培養(yǎng)過夜后觀察結(jié)果。測量抑菌圈大小，按CLSI-2017說明書來判定主要病原菌對藥物的敏感性。而所選抗菌藥有:青霉素、慶大霉素、萬古霉素、氧氟沙星、氨芐西林、慶大霉素、新生霉素、氯霉素、頭孢哌酮 、恩諾沙星、克林霉素、紅霉素等紙片共12種。

1.5 無乳鏈球菌毒力基因檢測采用多重PCR進(jìn)行無乳鏈球菌毒力基因定性檢測。共采用2組體系(set1、set2)，分別檢測cspA、pavA、cylE、hylB、lmb與pbp1A、bac、cfb、rib、fbs毒力基因。用表1中引物擴(kuò)增各目的序列，將加好的反應(yīng)溶液渦旋混勻，短暫離心后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。待PCR擴(kuò)增反應(yīng)完成后，將其產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增的條帶，對比參考圖統(tǒng)計(jì)每株菌所攜帶毒力基因狀況。

表1 PCR引物信息

2 結(jié)果

2.1 分離菌株DNA提取結(jié)果無乳鏈球菌提取的DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測與超微量紫外光分光光度計(jì)分析，結(jié)果表明提取的DNA純度高,可作為PCR擴(kuò)增的模板進(jìn)行測序。

2.2 藥敏結(jié)果本試驗(yàn)從奶牛乳房炎中分離出的42株無乳鏈球菌，有針對性的選擇12種藥進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，表2是藥敏試驗(yàn)抑菌圈直徑判定標(biāo)準(zhǔn),而表3為藥敏試驗(yàn)藥物敏感性的結(jié)果，根據(jù)表2，3得出表4無乳鏈球菌藥物敏感試驗(yàn)判定表。42株菌株對抗生素藥物都產(chǎn)生了不同程度的敏感性，尤其對慶大霉素、萬古霉素、氧氟沙星、恩諾沙星的敏感率最高,為100%;其次是氯霉素、氨芐西林、克林霉素、紅霉素，達(dá)到了97.6%；而青霉素為83.3%、頭孢哌酮為64.2%。

表2 藥敏試驗(yàn)仰菌圈直徑判定標(biāo)準(zhǔn)

表3 42株無乳鏈球菌分離菌株藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果 mm

續(xù)表3

表4 42株無乳鏈球菌藥物敏感試驗(yàn)判定表

2.3 分離菌株16S rDNA鑒定無乳鏈球菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分析后，均在400 bp處出現(xiàn)單一條帶,通過16S rRNA基因擴(kuò)增-測序-NCBI比對，相似度達(dá)99.9%以上，最終確認(rèn)為無乳鏈球菌。

2.4 分離菌株毒力基因檢測結(jié)果由表5可知，對42個分離的無乳鏈球菌菌株針對10個毒力基因進(jìn)行檢測和測序的結(jié)果是，pavA，cylE，hylB，pbplA，cfb和fbsA的基因檢出率為100%，lmb的基因檢出率為97.62%，cspA基因檢出率為31%，未檢出bac和rib基因。

表5 毒力基因在無乳鏈球菌中的分布

3 討論

奶牛乳房中乳腺組織經(jīng)在一些化學(xué)、物理和微生物等一系列外界刺激引起的炎性變化被稱為奶牛乳房炎[7]。它不僅影響奶牛的產(chǎn)奶量和奶的品質(zhì),還降低奶牛的養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益。而多種病原微生物是引起奶牛乳房炎的主要原因,且多為混合感染,其中鏈球菌是最常見的一種病原菌[8]。在球菌引起的乳房炎中,具有高度傳染性的專性乳腺寄生菌就是無乳鏈球菌[9]。而如今，隨著大量抗生素的開發(fā)和濫用，導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性增強(qiáng)，這也是導(dǎo)致奶牛乳房炎防控效果不佳的原因之一。

無乳鏈球菌是易感染人類、家畜和水生動物的條件性致病菌，有多種內(nèi)毒素及表面蛋白對無乳鏈球菌的致病性起促進(jìn)作用。這些致病因子使無乳鏈球菌具有很強(qiáng)的吸附作用、免疫逃逸能力和抗宿主免疫細(xì)胞吞噬[5]。參與宿主細(xì)胞附著的毒力因子包括scpB，lmb，fbsA和fbsB，其中scpB基因編碼為C5a肽酶，lmb基因編碼為層黏連蛋白結(jié)合蛋白，fbsA的編碼為纖維蛋白原結(jié)合蛋白A，fbsB的編碼為纖維蛋白原結(jié)合蛋白B。與侵襲相關(guān)的毒性因子為cylE，cfb，hylB，rib和bac。有研究表明，毒性基因cfb編碼為CAMP因子，這種毒力基因能夠與免疫球蛋白IgG和IgM的Fc片段相結(jié)合，以激活I(lǐng)gG和IgM的Fab片段，從而在機(jī)體系統(tǒng)感染期間削弱宿主的免疫功能。據(jù)報(bào)道無乳鏈球菌中cfb的檢出率為99.4%，這證明了CAMP因子在無乳鏈球菌引起的奶牛乳房炎的發(fā)生起非常重要的作用[10]。

在這次藥敏試驗(yàn)過程中,奶牛乳房炎的無乳鏈球菌對絕大部分的抗生素都高度敏感，對慶大霉素、萬古霉素、氧氟沙星的敏感率最高(100%)，其次為氨芐西林、克林霉素、氯霉素、紅霉素(97.6%)，說明這些抗生素效果很好，而臨床常用的青霉素類、頭孢類在本試驗(yàn)中效果不理想，這可能與臨床上使用藥物次數(shù)過多有關(guān)，從而給奶牛乳房炎的治療帶來一定困難[11-13]。結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果為該牧場制定具有針對性的用藥方案，經(jīng)過一個治療周期的用藥，患有臨床型乳房炎的奶牛治愈率達(dá)90%以上。由于抗生素的長期大量使用,致使乳房炎病原菌的耐藥性不斷增強(qiáng),乳房炎的發(fā)生率不斷升高,這也給乳房炎的防治造成了極大的困難。從國內(nèi)外防治經(jīng)驗(yàn)來看,使用疫苗免疫是預(yù)防奶牛乳房炎最有效的措施[14]。而毒力基因檢測驗(yàn)結(jié)果顯示，無乳鏈球菌主要毒力因子pavA，cylE，hylB，pbplA，cfb和fbsA的檢出率為100%，表明奶牛乳房炎的致病過程里，這些毒力因子參與其中，后續(xù)研究中以上幾種毒力基因所表達(dá)的蛋白可作為疫苗開發(fā)備選因子。而本試驗(yàn)未檢出bac和rib基因，以及cspA基因檢出率較低，可能是這種基因不是該奶牛場主要的致病因子。