黑枸杞花青素對LPS誘導(dǎo)的Raw264.7細胞炎癥的影響

薛才華，武 強，王夢杰，劉嘉華，張龍飛，張家瑋，拉忠花，吳 華*，柴沙陀

(1.青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016；2.青海大學(xué) 畜牧獸醫(yī)科學(xué)院， 青海 西寧 810000)

炎癥是指機體受到外界刺激后，通過利用系統(tǒng)本身的活體組織對外界致炎因子產(chǎn)生的一種防御作用。巨噬細胞作為免疫系統(tǒng)的重要組成成分，它參與機體的兩種免疫:特異性免疫與非特異性免疫，在炎癥反應(yīng)及疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[1]。在體外試驗中，常以脂多糖(LPS)誘導(dǎo)小鼠Raw264.7巨噬細胞作為炎癥細胞模型。LPS是革蘭陰性菌外膜的主要成分[2]。常用其建立炎癥模型，它具有很強的致炎活性，當LPS在機體內(nèi)進行大量繁殖或正常死亡后會誘導(dǎo)多種炎性因子的分泌，引起機體炎癥，使機體在生理上表現(xiàn)出一系列臨床癥狀[3]。因此，LPS是細菌感染導(dǎo)致炎癥反應(yīng)過程中最主要的促炎因子[4]。花青素是植物界中分布最廣泛的天然色素家族 ，它是一種具有生物活性的化合物，存在于植物的葉、莖、花和果實中，具有多種藥理作用[5]。 研究發(fā)現(xiàn)，花青素具有抗氧化、抗炎、抑菌、抗衰老等作用[6-8]。但是黑枸杞花青素在小鼠Raw264.7巨噬細胞炎癥反應(yīng)中的作用及其機制尚未明確。本研究以LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細胞Raw264.7作為體外炎癥細胞模型，觀察黑枸杞花青素對炎癥狀態(tài)下細胞內(nèi)炎癥因子含量及其mRNA水平的影響，并研究其對炎癥通路TLR4/NF-κB信號通路相關(guān)因子mRNA水平的影響及其對TLR4、NF-κBp65蛋白的調(diào)控，來探討其對巨噬細胞炎癥的保護作用，為黑枸杞花青素的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料細胞株：小鼠巨噬細胞Raw264.7，購自中國科學(xué)院上海細胞庫；黑枸杞花青素：購自青海金麥杞生物科技有限公司(花青素61%，灰分0.6%，蛋白質(zhì)6%，糖1.32%，氨基酸3.56%)。

1.2 試驗試劑LPS和胰蛋白酶購自索萊寶生物科技有限公司；胎牛血清購自杭州四季青生物技術(shù)有限公司；DMEM培養(yǎng)基和雙抗購自GIBCO公司；CCK-8試劑盒購自江蘇省海門碧云天生物技術(shù)研究所；ELISA試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；SYBR Green Ⅱ熒光定量PCR試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自天根生化科技有限公司;抗體 TLR4和NF-κBp65購自北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司；Ant-GAPDH購自安諾倫生物科技有限公司。

1.3 試驗儀器超凈工作臺(江蘇通凈凈化設(shè)備有限公司);CO2恒溫培養(yǎng)箱(MU-5810E，美國NUAIRE公司);水平離心機(V18R,英國Dynamica公司)；酶標儀(Power Wave XS2 Bio TeKR，Gene Company Ltd.USA)；電泳儀和熒光定量PCR儀(Bio-Rad 公司)；化學(xué)發(fā)光成像儀(北京賽智科技有限公司)。

1.4 試劑配制

1.4.1花青素溶液的配制 準確稱取0.01 g花青素溶于10 mL DMEM培養(yǎng)基中，配成1 g/L的花青素母液，-20℃保存，使用前稀釋成相應(yīng)濃度。

1.4.2LPS溶液配制 將1 mg LPS粉末溶解于10 mL的PBS溶液中，配制成100 mg/L的LPS母液，分裝后保存于-80℃冰箱，使用前稀釋成相應(yīng)濃度。

1.5 細胞培養(yǎng)及分組小鼠巨噬細胞Raw264.7復(fù)蘇后，在37℃、5%CO2條件下，用含10%胎牛血清和1%抗生素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。待細胞長到80%左右，胰蛋白酶消化傳代，取處于對數(shù)生長期的細胞用于試驗。細胞分為對照組、花青素組、LPS組、花青素+LPS組。其中花青素組和花青素+LPS組中花青素濃度使用課題組前期篩選出的25 mg/L，LPS組和花青素+LPS組LPS質(zhì)量濃度采用課題組前期篩選的1 mg/L。

1.6 ELISA法檢測小鼠Raw264.7細胞炎性相關(guān)因子的含量細胞計數(shù)后，以每孔1×106個接種于96孔板中，按上述分組進行試驗，每組設(shè)6個復(fù)孔。收集各組細胞上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測細胞上清液IL-6、IL-10、TNF-α和INF-γ的含量，將試劑盒提前20 min從冰箱內(nèi)取出，平衡至室溫。按照試劑盒說明進行操作，用酶標儀測定相關(guān)因子吸光度值。

1.7 RT-PCR法檢測小鼠Raw264.7細胞相關(guān)因子mRNA表達按上述分組進行試驗，使用TRNzol裂解液提取細胞的總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作步驟，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用實時熒光定量試劑盒進行RT-PCR檢測。如表1所示，使用上海生工設(shè)計合成的引物。

表1 引物序列

1.8 免疫印跡法檢測TLR4/NF-κB通路關(guān)鍵節(jié)點蛋白表達按照上述分組進行試驗，處理完各組細胞后，棄去上清，收集各組細胞，加入適量的蛋白裂解液(含1%PMSF)，冰上反復(fù)吹打，4℃，12 000 r/min離心15 min，取上清，通過 BCA 法進行蛋白定量。制備8%分離膠，5%濃縮膠SDS-PAGE 電泳，上樣量為 2 g/L。半干轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5% BSA 室溫封閉1.5 h。TLR4，NF-κBp65一抗，4℃孵育過夜，TBST 洗膜3遍，二抗室溫孵育1.5 h，再次 TBST 洗膜3遍，ECL化學(xué)發(fā)光顯影拍照，凝膠成像儀檢測。

2 結(jié)果

2.1 黑枸杞花青素對小鼠Raw264.7細胞炎性相關(guān)因子含量的影響ELISA法檢測黑枸杞花青素對LPS作用后小鼠巨噬細胞Raw264.7培養(yǎng)上清液中IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ含量的變化。結(jié)果如圖1所示，與對照組相比，花青素處理組IL-6、IL-10的含量顯著升高(P<0.05)，TNF-α的含量升高，INF-γ的含量降低，差異均不顯著(P>0.05)，LPS處理組極顯著升高IL-6、TNF-α的含量(P<0.01)，IL-10和INF-γ的含量顯著升高(P<0.05)，花青素+LPS處理組TNF-α、INF-γ的含量升高但差異不顯著(P>0.05)，IL-10的含量極顯著提高(P<0.01)，IL-6的含量顯著提高(P<0.05)；與LPS處理組相比，花青素處理組IL-6、IL-10、TNF-α含量顯著減少(P<0.05)，INF-γ的含量極顯著降低(P<0.01)，花青素+LPS處理組IL-6、TNF-α和INF-γ的含量均顯著降低(P<0.05)，IL-10的含量顯著升高(P<0.05)。

2.2 黑枸杞花青素對小鼠Raw264.7細胞炎性相關(guān)因子mRNA表達的影響結(jié)果如圖2所示，與對照組相比，花青素處理組IL-6、TNF-α mRNA表達降低，IL-10、INF-γ mRNA表達提高，但差異均不顯著(P>0.05)，LPS處理組IL-6，TNF-α mRNA表達極顯著升高(P<0.01)，IL-10、INF-γ mRNA表達顯著提高(P<0.05)，花青素+LPS處理組顯著增加IL-6、TNF-α mRNA表達(P<0.05)，IL-10 mRNA表達極顯著升高(P<0.01)，INF-γ mRNA表達提高，但差異不顯著(P>0.05)；與LPS組相比，花青素處理組極顯著抑制了IL-6、TNF-α mRNA表達(P<0.01)，顯著降低IL-10、INF-γ mRNA表達(P<0.05)，花青素+LPS組IL-6、INF-γ和TNF-α mRNA表達均顯著降低(P<0.05)，IL-10 mRNA表達均顯著升高(P<0.05)。

圖2 黑枸杞花青素對小鼠Raw264.7細胞炎性相關(guān)因子mRNA表達的影響

2.3 黑枸杞花青素對小鼠Raw264.7細胞中TLR4/NF-κB通路關(guān)鍵因子mRNA表達的影響如圖3所示，與對照組相比，花青素處理組降低了TLR4、NF-κB、MyD88和TRAF6的mRNA表達水平，但差異均不顯著(P>0.05)，LPS處理極顯著提高TLR4、NF-κB和MyD88的mRNA表達水平(P<0.01)，顯著提高了TRAF6的mRNA表達水平(P<0.05)，花青素+LPS處理TLR4、NF-κB、MyD88和TRAF6的mRNA表達水平顯著提高(P<0.05)；與LPS組相比，花青素處理組極顯著降低了NF-κB mRNA表達水平(P<0.01)，顯著降低了TLR4、MyD88和TRAF6 mRNA表達水平(P<0.05)，花青素+LPS處理組TLR4、NF-κB、MyD88和TRAF6的mRNA表達水平均顯著降低(P<0.05)。

圖3 黑枸杞花青素對小鼠Raw264.7細胞中TLR4/NF-кB通路關(guān)鍵因子mRNA表達的影響

2.4 黑枸杞花青素對小鼠Raw264.7細胞中TLR4/NF-кB通路相關(guān)蛋白表達的影響結(jié)果如圖4所示，與對照組相比，花青素處理組極顯著降低TLR4和NF-κBp65 蛋白表達水平(P<0.01)，LPS處理極顯著提高TLR4和NF-κBp65 蛋白水平表達(P<0.01)，花青素+LPS處理TLR4和NF-κBp65 蛋白水平表達極顯著提高(P<0.01)；與LPS組相比，花青素處理組極顯著降低了TLR4和NF-κBp65蛋白水平表達(P<0.01)，花青素+LPS處理組TLR4，NF-κBp65 蛋白水平表達極顯著降低(P<0.01)。

圖4 黑枸杞花青素對LPS誘導(dǎo)小鼠Raw264.7 細胞中TLR4/NF-кB通路相關(guān)蛋白表達的影響

與空白組對比，*P<0.05，**P<0.01 ；與LPS處理組對比，#P<0.05，##P<0.01。下同

圖1 黑枸杞花青素對小鼠Raw264.7細胞炎性相關(guān)因子含量的影響

3 討論

巨噬細胞是參與機體免疫應(yīng)答反應(yīng)的重要成分，在多種疾病中有效發(fā)揮其吞噬作用，是機體抵御細菌感染和癌癥的第1道防線，因此，它們在啟動適應(yīng)性免疫應(yīng)答中扮演著重要的角色并參與自身免疫性疾病、感染和炎癥性疾病的發(fā)病機制[9]。LPS 為革蘭陰性細菌細胞壁的主要成分,能夠刺激巨噬細胞產(chǎn)生過量的炎癥介質(zhì)(如NO和TNF-α)以及炎性細胞因子(如IL-1β和 IL-6)，這些物質(zhì)通過與其他炎癥介質(zhì)的協(xié)同作用促進過敏性哮喘等炎癥性疾病的發(fā)生與發(fā)展[10-12]。TNF-α、 IL-1β、 IL-6 為炎癥反應(yīng)中的主要炎癥因子，是反應(yīng)炎癥水平的重要指標[13]?；ㄇ嗨貙儆诜宇愔械念慄S酮物質(zhì)，是一類植物中廣泛存在的水溶性天然色素，研究證明，花青素具有抗炎、抗氧化、清除自由基等作用[14-15]。本試驗通過LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細胞Raw264.7損傷，來探討黑枸杞花青素對LPS誘導(dǎo)的損傷的作用機制。結(jié)果表明，與對照組相比，LPS處理組IL-6、TNF-α的含量與mRNA表達均極顯著升高(P<0.01)，IL-10和INF-γ的含量和mRNA表達均顯著升高(P<0.05)，與LPS組比較，花青素+LPS處理組IL-6、IL-10、TNF-α和INF-γ的含量和mRNA表達顯著降低(P<0.05)。表明黑枸杞花青素對LPS誘導(dǎo)的炎癥具有抑制作用。

Toll樣受體 4(TLR4)是機體中參與免疫調(diào)節(jié)的重要蛋白分子[16-17]。NF-κB 是炎癥反應(yīng)過程中重要的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其家族成員主要包括 p65 和 p50[13]。正常生理情況下， NF-κB(p50/p65)以異二聚體形式存在于細胞質(zhì)中；在炎癥(如LPS) 刺激條件下， NF-κB 信號通路被激活后 NF-κB-p65 由細胞質(zhì)移位至細胞核，進而促進 TNF-α、 IL-6、 IL-1β、 iNOS 等炎性因子的釋放[18-19]。被 NF-κB 誘導(dǎo)表達的炎癥因子進一步反饋活化 NF-κB，誘導(dǎo) NF-κB 的持續(xù)性活化， 從而加重炎癥損傷[20]。因此，抑制 TLR4 /NF-κB 信號通路蛋白的活化可能是炎癥治療的作用靶點[21-22]。本研究中，通過RT-PCR及蛋白免疫印跡試驗分別檢測了TLR4/NF-κB、MyD88和TRAF6的mRNA表達水平及TLR4和NF-κBp65蛋白水平。結(jié)果顯示，與空白組對比，LPS處理極顯著上調(diào)TLR4、NF-κB和MyD88的mRNA表達水平及TLR4和NF-κBp65 蛋白水平(P<0.01)，顯著提高了TRAF6的mRNA表達水平(P<0.05)，與LPS組對比，花青素+LPS處理TLR4、NF-κB、MyD88和TRAF6的mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)并且顯著下調(diào)TLR4，NF-κBp65 蛋白水平(P<0.01)。表明黑枸杞花青素對小鼠Raw264.7細胞中的TLR4 /NF-κB 信號通路具有抑制其活化的調(diào)控作用。

綜上所述，黑枸杞花青素對LPS誘導(dǎo)的小鼠Raw264.7細胞炎癥具有保護作用，其作用機制可能是通過抑制 TLR4/NF-κB 信號通路的活化，進而抑制促炎細胞因子IL-6、TNF-α和INF-γ的表達，從而發(fā)揮抗炎作用。