miR-20a-5p 調(diào)節(jié)VEGF 通路在氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變小鼠模型中的作用機(jī)制

黃潤(rùn)英,范智利,肖吉群,鄭 巍,蔡 強(qiáng)

(宜賓市第二人民醫(yī)院兒科, 四川宜賓 644000)

病理性新生血管增生造成的早產(chǎn)兒眼部疾病,已成為當(dāng)今發(fā)展中國(guó)家和發(fā)達(dá)國(guó)家兒童失明的主要原因, 氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變( oxygen-induced retinopathy, OIR)小鼠模型是目前與新生血管增生較為類(lèi)似模型,且最常見(jiàn)[1];及早治療可有效改善視功能, 目前抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)治療已具有滿(mǎn)意效果[2],合適的抗VEGF 是治療的關(guān)鍵。 多種促血管微小RNA(microRNA, miRNA)和抗血管miRNA 共同調(diào)控血管新生,引起 VEGF 異常表達(dá)[3]。 miR-20a-5p 是miR-17-92 家族成員之一,抑制 miR-17、miR-20 可增加血管生成[4],miR-20a-5p 表達(dá)水平影響炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、組織修復(fù)、細(xì)胞外基質(zhì)重塑、血管新生以及惡性病變等多種病理機(jī)制[5],且在第37 屆圣安東尼奧乳腺癌研討會(huì)上已作為抗VEGF 因子用于治療乳腺癌[6],但是否可用于OIR 治療尚不清楚。 因此,建立 OIR 模型,觀察miR-20a-5p 對(duì)OIR 小鼠的影響并初步探討其機(jī)制,為OIR 靶向治療提供一定參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康無(wú)特定病原體動(dòng)物(specific pathogen free,SPF)級(jí) 96 只 C57BL/6J Nifdc 新生小鼠 7 日齡,體重(5.2±0.5)g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)-20180045],雌雄不限。 所有動(dòng)物在宜賓市第二人民醫(yī)院動(dòng)物飼養(yǎng)中心動(dòng)物飼養(yǎng)[SYXK(京)-2019-0105],并經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(IACUC-20190018),實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合3R 原則,且遵守視覺(jué)與眼科學(xué)研究會(huì)制定的關(guān)于科研動(dòng)物規(guī)范。

1.2 主要試劑與儀器

miR-20a-5p agomir 購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司;引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成;實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾,貨號(hào):K1622;蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色試劑盒購(gòu)自碧云天科技有限公司,貨號(hào):C0105;VEGF 抗體購(gòu)自英國(guó)abcam 公司,貨號(hào):ab32152;眼科裂隙燈顯微鏡購(gòu)自意大利CSO 公司,型號(hào):SL990/SL980;氧箱購(gòu)自寧波華儀寧創(chuàng)智能科技有限公司,型號(hào):Attendor-110pro;qRT-PCR 儀購(gòu)自美國(guó)ABI 公司,型號(hào):ViiA7。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及OIR 小鼠模型建立

實(shí)驗(yàn)前對(duì)所有小鼠在眼科裂隙燈顯微鏡下檢查眼部,均未發(fā)現(xiàn)異常。 實(shí)驗(yàn)分為正常組、模型組、高氧對(duì)照組、miR-20a-5p 高表達(dá)組,每組24 只。 除正常組外,其余各組參照文獻(xiàn)[7]在出生后第7 天建立OIR 小鼠模型,測(cè)氧儀時(shí)刻監(jiān)測(cè)氧濃度,小鼠置于氧濃度(75.00±2.00)%氧箱中,12 h 光照12 h 黑暗,高氧環(huán)境5 d 后置于常氧中飼養(yǎng),在高氧環(huán)境結(jié)束前一天(出生后第11 天)開(kāi)始,每組左眼作為陰性對(duì)照,右眼高氧對(duì)照組玻璃體腔內(nèi)注射1 μL 磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline, PBS),miR-20a-5p 高表達(dá)組右眼玻璃體腔內(nèi)注射1 μL miR-20a-5p 激動(dòng)劑(miR-20a-5p agomir)(1 μmol/L),處理完后立即置于氧箱中,模型組不進(jìn)行任何處理,1 d 后所有小鼠出氧箱。 正常組小鼠一直置于空氣中正常飼養(yǎng)。 高氧環(huán)境結(jié)束后各組小鼠正常空氣再飼養(yǎng)5 d(出生后第17 天)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 qRT-PCR 檢測(cè)視網(wǎng)膜組織 miR-20a-5p、VEGF、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGF receptor,VEGFR)-1、VEGFR-2 表達(dá)情況

每組隨機(jī)取8 只小鼠,右眼取視網(wǎng)膜組織,剪碎,加TRIzol 裂解。 氯仿、異丙醇法提取總RNA,并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,參照qRT-PCR 試劑盒說(shuō)明操作進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 引物序列:miR-20a-5p F:5’-ATGCTAAA GTGCTTATAGT-3’、 R: 5’-CAGTGCAGGGTCCGAG GTATTC-3’, U6 F: 5’-CGCTTCGGCAGCAGCACA TATAC-3’、R:5’-AATTTGCGTGTCATCCTTGC-3’,VEGF F:5’-GCTCTACCTCCACCATGCCAAGTGGTC CCA-3 ’、 R: 5 ’-GACCCTGGTGGACATCTTCCAG GAGTACCC-3 ’, VEGFR-1 F: 5 ’-CCACCTCCAT GTTTGAAGAC-3’、 R: 5’-TACCAGCAGTCTGCTG ACCTCCCC-3 ’, VEGFR-2 F: 5 ’-CTCCATCTTTT GGTGGGATG-3’、 R: 5’-AGGCCACAGACTCCCTG CTTTTACTG-3’, β-actin F: 5’-AAGACCTCTATG CCAACACAG-3’、R:5’-GGAGGAGCAATGATCTTG ATC-3’。 上樣體系均為 20 μL:cDNA 1 μL(50 ng/μL),F/R(10 μmol/L)各 0.5 μL,2×Mix 10 μL,ddH2O 8.0 μL。 反應(yīng)條件:95℃、10 min;95℃、15 s,62℃、30 s(miR-20a-5p)/60 s(VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2),40 個(gè)循環(huán)。 2-ΔΔCT法計(jì)算 miR-20a-5p、VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2 表達(dá)水平。

1.3.3 視網(wǎng)膜鋪片觀察視網(wǎng)膜血管形態(tài)

每組隨機(jī)取8 只小鼠,右眼進(jìn)行視網(wǎng)膜鋪片。1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉小鼠,左心室灌注4%多聚甲醛5 min 立即摘除右眼并固定,去除眼前節(jié),保留完整視網(wǎng)膜組織。 經(jīng)漂洗、孵育、顯色、甘油明膠封片,顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.4 HE 染色計(jì)數(shù)視網(wǎng)膜新生血管內(nèi)皮細(xì)胞核情況

每組剩余8 只小鼠立即處死并摘取右眼,經(jīng)4%多聚甲醛固定,切片后部分經(jīng)脫蠟、復(fù)水、染色,再脫水、透明、封片進(jìn)行HE 染色。 隨機(jī)、雙盲法顯微鏡下計(jì)數(shù)突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)量。 且僅計(jì)數(shù)與內(nèi)界膜有緊密聯(lián)系的細(xì)胞核,不計(jì)數(shù)與內(nèi)界膜無(wú)聯(lián)系的血管內(nèi)皮細(xì)胞核。

1.3.5 免疫組化檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中VEGF 陽(yáng)性細(xì)胞情況

1.3.4 中切片同HE 方法脫蠟、復(fù)水步驟,熱修復(fù)抗原、5%脫脂奶粉封閉后,滴加一抗VEGF(陰性對(duì)照用同型同種鼠IgG 代替一抗)2 h,滴加二抗20 min 后DAB 顯色,蘇木素復(fù)染核,分色、脫水、透明、封片。 光學(xué)顯微鏡拍照。 每張切片在高倍顯微鏡下隨機(jī)選擇10 個(gè)視野,采用 MetaMorph/Evolution MP5.0/BX51 分析軟件測(cè)量陽(yáng)性細(xì)胞積分光密度(integrated od total,IOD)值。 陽(yáng)性面積百分比=IOD/總面積×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量數(shù)據(jù)均采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,先采用單因素方差分析各組間總體比較,若存在差異則使用SNK-q檢驗(yàn)行組間兩兩比較。P＜0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-20a-5p 在各組小鼠視網(wǎng)膜組織中表達(dá)情況

與正常組相比,模型組、高氧對(duì)照組視網(wǎng)膜組織中miR-20a-5p 水平降低(P＜0. 05);分別與模型組、高氧對(duì)照組相比,miR-20a-5p 高表達(dá)組視網(wǎng)膜組織中miR-20a-5p 水平升高(P＜0. 05)。見(jiàn)表1。

2.2 miR-20a-5p 對(duì)小鼠視網(wǎng)膜血管形態(tài)的影響

正常組小鼠視網(wǎng)膜血管基本成熟,自視盤(pán)向周?chē)l(fā)出放射狀大血管,呈均勻分布,分支狀態(tài)良好延伸至視網(wǎng)膜周邊部位。 模型組和高氧對(duì)照組自視盤(pán)向周?chē)l(fā)出的放射狀大血管迂回、不規(guī)則擴(kuò)張,出現(xiàn)大量新生血管,新生血管結(jié)構(gòu)及分布紊亂,且周邊毛細(xì)血管網(wǎng)閉塞。 miR-20a-5p 高表達(dá)組自視盤(pán)向周?chē)l(fā)出的放射狀大血管迂回不明顯、不規(guī)則擴(kuò)張減輕,新生血管明顯減少。 見(jiàn)圖1。

2.3 miR-20a-5p 對(duì)小鼠新生血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)量的影響

與正常組相比,模型組、高氧對(duì)照組視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)量升高(P＜0.05);分別與模型組、高氧對(duì)照組相比,miR-20a-5p 高表達(dá)組視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)量降低(P＜0.05)。 見(jiàn)圖2、表2。

表1 4 組小鼠視網(wǎng)膜組織中miR-20a-5p 表達(dá)水平比較( ,n=8)Table 1 Comparison of miR-20a-5p expression in retina of mice in 4 groups

表1 4 組小鼠視網(wǎng)膜組織中miR-20a-5p 表達(dá)水平比較( ,n=8)Table 1 Comparison of miR-20a-5p expression in retina of mice in 4 groups

注:與正常組相比,#P＜0.05;與模型組相比,*P＜0.05;與高氧對(duì)照組相比,&P＜0.05。Note. Compared with normal group, #P ＜0.05. Compared with model group, *P ＜ 0.05. Compared with hyperoxia control group, &P ＜ 0.05.

組別Groups miR-20a-5p正常組Normal group 1.01±0.14模型組Model group 0.42±0.06#高氧對(duì)照組Hyperoxia control group 0.43±0.05#miR-20a-5p 高表達(dá)組miR-20a-5p overexpression group 1.38±0.15*&F P 146.368 0.000

2.4 miR-20a-5p 對(duì)小鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF 陽(yáng)性細(xì)胞的影響

VEGF 陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色,模型組和高氧對(duì)照主要存在視網(wǎng)膜內(nèi)界膜附近、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)核層。 miR-20a-5p 高表達(dá)組主要存在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)核層。 與正常組相比,模型組、高氧對(duì)照組視網(wǎng)膜中VEGF 蛋白陽(yáng)性面積百分比升高(P＜0.05);分別與模型組、高氧對(duì)照組相比,miR-20a-5p 高表達(dá)組視網(wǎng)膜中VEGF 蛋白陽(yáng)性面積百分比降低(P＜0.05)。 見(jiàn)圖 3、表 3。

表2 4 組小鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)量比較( ,n=8)Table 2 Comparison of nuclear number of retinal vascular endothelial cells in 4 groups

表2 4 組小鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)量比較( ,n=8)Table 2 Comparison of nuclear number of retinal vascular endothelial cells in 4 groups

注:與正常組相比,#P＜0.05;與模型組相比,*P＜0.05;與高氧對(duì)照組相比,&P＜0.05。Note. Compared with normal group, #P ＜0.05. Compared with model group, *P ＜ 0.05. Compared with hyperoxia control group, &P ＜ 0.05.

組別Groups血管內(nèi)皮細(xì)胞核(個(gè))Endothelial cell nucleus (n)正常組Normal group 3.16±0.16模型組Model group 25.35±3.15#高氧對(duì)照組Hyperoxia control group 25.94±3.47#miR-20a-5p 高表達(dá)組miR-20a-5p overexpression group 16.48±2.18*&F P 135.347 0.000

圖1 4 組小鼠視網(wǎng)膜血管形態(tài)情況Figure 1 The morphology of retinal vessels in 4 groups

圖2 4 組小鼠視網(wǎng)膜形態(tài)情況(HE 染色)Figure 2 Retinal morphology of the 4 groups of mice(HE staining)

2.5 miR-20a-5p 對(duì)小鼠視網(wǎng)膜組織中 VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2 mRNA 水平的影響

與正常組相比,模型組、高氧對(duì)照組視網(wǎng)膜組織中 VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2 mRNA 表達(dá)水平升高(P＜0.05);分別與模型組、高氧對(duì)照組相比,miR-20a-5p 高表達(dá)組視網(wǎng)膜中 VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2 mRNA 表達(dá)水平降低(P＜0.05)。 見(jiàn)表 4。

3 討論

OIR 表現(xiàn)為局部新生血管生成,會(huì)導(dǎo)致?tīng)坷砸暰W(wǎng)膜脫落、并發(fā)性白內(nèi)障、繼發(fā)性青光眼等,還可引起斜視、弱視等并發(fā)癥,影響患兒健康[8]。 本研究發(fā)現(xiàn),與正常組相比,模型組小鼠視網(wǎng)膜組織視盤(pán)向周?chē)l(fā)出的放射狀大血管迂回、不規(guī)則擴(kuò)張,大血管出現(xiàn)混亂,可能影響功能,促使出現(xiàn)大量新生血管,新生血管結(jié)構(gòu)及分布紊亂,且周邊毛細(xì)血管網(wǎng)閉塞,新生血管短暫時(shí)間內(nèi)補(bǔ)償大血管功能;但新生血管會(huì)破壞視網(wǎng)膜原有功能,誘發(fā)疾病。 及時(shí)有效的治療是減少該病致盲的主要方法。

表3 4 組小鼠視網(wǎng)膜中VEGF 蛋白表達(dá)水平比較( ,n=8)Table 3 Comparison of VEGF protein expression in retina of 4 groups

表3 4 組小鼠視網(wǎng)膜中VEGF 蛋白表達(dá)水平比較( ,n=8)Table 3 Comparison of VEGF protein expression in retina of 4 groups

注:與正常組相比,#P＜0.05;與模型組相比,*P＜0.05;與高氧對(duì)照組相比,&P＜0.05。Note. Compared with normal group, #P ＜0.05. Compared with model group, *P ＜ 0.05. Compared with hyperoxia control group, &P ＜ 0.05.

組別Groups 陽(yáng)性面積百分比(%)正常組Normal group 3.15±0.46模型組Model group 63.85±13.05#高氧對(duì)照組Hyperoxia control group 65.03±12.34#miR-20a-5p 高表達(dá)組miR-20a-5p overexpression group 13.15±3.51*&F 102.470 P 0.000

VEGF 被認(rèn)為是啟動(dòng)新生血管最為重要的細(xì)胞因子,可選擇性地增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞和淋巴管細(xì)胞的有絲分裂,促進(jìn)內(nèi)皮增生、遷移和分化,同時(shí)抑制內(nèi)皮細(xì)胞老化和抗凋亡[9];可增加小靜脈通透性,促使血漿大分子外滲,外滲蛋白可形成纖維蛋白原,從而支持內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng),為建立新生血管網(wǎng)提供可能[10]。 VEGFR 作為 VEGF 受體,屬跨膜酪氨酸激酶受體,其中VEFFR1 可介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移從而促進(jìn)血管新生[11];VEGFR2 是VEGF 介導(dǎo)血管生成的主要受體,激活VEGFR2 可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖,進(jìn)而促進(jìn)血管生成[12]。 在 OIR 中抑制VEGF 的表達(dá)可抑制 VEGFR2 的表達(dá)[13]。 本研究發(fā)現(xiàn),與正常組相比,模型組VEGF 陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色,主要存在視網(wǎng)膜內(nèi)界膜附近、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)核層,VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2 mRNA 水平升高,提示在OIR 視網(wǎng)膜組織中VEGF 及其受體均處于激活狀態(tài),VEGF 結(jié)合其受體增加小靜脈通透性,促使血漿大分子外滲,外滲蛋白加速形成纖維蛋白原,加速內(nèi)皮細(xì)胞遷移、生長(zhǎng)過(guò)程,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增生,加速新生血管生成,進(jìn)而影響視網(wǎng)膜功能。

圖3 4 組小鼠視網(wǎng)膜VEGF 蛋白表達(dá)情況(免疫組化染色)Figure 3 expression of VEGF protein in retina of 4 groups (immunohistochemical staining)

表4 4 組小鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2 mRNA 表達(dá)水平比較( ,n=8)Table 4 Comparison of mRNA expression levels of VEGF, VEGFR-1 and VEGFR-2 in retina of mice in 4 groups

表4 4 組小鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2 mRNA 表達(dá)水平比較( ,n=8)Table 4 Comparison of mRNA expression levels of VEGF, VEGFR-1 and VEGFR-2 in retina of mice in 4 groups

注:與正常組相比,#P＜0.05;與模型組相比,*P＜0.05;與高氧對(duì)照組相比,&P＜0.05。Note. Compared with normal group, #P ＜ 0.05. Compared with model group, *P ＜ 0.05. Compared with hyperoxia control group, &P ＜ 0.05.

組別Groups VEGF VEGFR-1 VEGFR-2正常組 Normal group 0.98±0.15 0.99±0.14 1.00±0.15模型組 Model group 4.15±0.31# 2.75±0.25# 1.98±0.08#高氧對(duì)照組 Hyperoxia control group 4.17±0.29# 2.76±0.24# 1.96±0.12#miR-20a-5p 高表達(dá)組miR-20a-5p overexpression group 1.38±0.25*& 1.93±0.17*& 1.32±0.09*&F 360.406 134.053 146.822 P 0.000 0.000 0.000

抗VEGF 已經(jīng)成為治療ROP 的重要靶位點(diǎn)之一[14]。 眼科血管疾病靶向治療中主要策略為抗VEGF 抑制劑和miRNA 為核心的基因治療[15],其中miRNA 作為單鏈小分子非編碼RNA,參與轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控,在真核生物中存在廣泛,且高度保守;構(gòu)建miRNA 模擬物或抑制劑調(diào)節(jié)信號(hào)通路、靶基因等,抑制VEGF 通路或其受體表達(dá)可達(dá)到治療疾病目的[16-17]。 miR-17-92 基因簇在人和小鼠的多種組織中廣泛表達(dá),包括 miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-19b-1、miR-20a、miR-92-1[18]。 miR-17 和 VEGF 在血管性癡呆中關(guān)系密切,影響血管受損后修復(fù)、神經(jīng)元損傷等過(guò)程[19]。 miR-20a 與血管新生關(guān)系密切,調(diào)節(jié)miR-20a 水平可以影響血管新生狀況[20]。本研究發(fā)現(xiàn),OIR 視網(wǎng)膜組織中miR-20a-5p 表達(dá)降低,升高miR-20a-5p 后可抑制視網(wǎng)膜組織中VEGF、VEGFR1、VEGFR2 mRNA 水平,降低視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)量,使放射狀大血管迂回不明顯,血管不規(guī)則擴(kuò)張現(xiàn)象減輕,新生血管明顯減少,從而改善血管狀態(tài)。

綜上所述,miR-20a-5p 可能抑制VEGF 通路減少OIR 小鼠視網(wǎng)膜血管新生,亦可能影響其他信號(hào)通路,從而減少OIR 小鼠視網(wǎng)膜血管新生,為OIR靶向治療提供一定參考。