基于SDF-1/CXCR4 信號(hào)通路探討新安鼻淵方流浸膏對(duì)急性鼻竇炎大鼠嗅上皮神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響

張 田,喻國凍,顧 平,葉惠平,金 瑩

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉科,貴陽 550004)

急性鼻竇炎是一種鼻竇黏膜的炎癥性疾病[1],作為耳鼻喉科最常見的疾病之一,在全球范圍內(nèi)具有較高的發(fā)病率。 在我國,急性鼻竇炎的發(fā)病率逐年增加,主要臨床癥狀包括頭痛,鼻塞、記憶力下降等[2],其病情反復(fù),難以治愈,嚴(yán)重影響患者的身心健康,是臨床上亟需解決的健康問題。 目前,關(guān)于鼻竇炎的治療手段主要是采用鼻內(nèi)鏡外科手術(shù)及抗炎藥物[3-4],對(duì)于患者創(chuàng)傷性大,而且預(yù)后效果不佳,存在復(fù)發(fā)率高、耐藥性以及其他不良反應(yīng)等一系列問題。 新安鼻淵方流浸膏由中草藥敗醬草、黃芪等藥物組成,主要用于治療急、慢性鼻竇炎,起效迅速,且經(jīng)過長期臨床使用證實(shí)其療效確切[5]。 但是對(duì)于新安鼻淵方流浸膏改善急性鼻竇炎的機(jī)制研究還未見報(bào)道,因此本研究通過建立大鼠急性鼻竇炎模型來探討新安鼻淵方流浸膏對(duì)大鼠急性鼻竇炎嗅上皮神經(jīng)元細(xì)胞凋亡影響的相關(guān)機(jī)制,為進(jìn)一步研究以及臨床用藥提供客觀的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8～10 周齡 SPF 級(jí) SD 雄性大鼠,體重(200±20) g 40 只購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0011],依照我院最新的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理辦法,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均在本實(shí)驗(yàn)室SPF 級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)[SYXK(黔)2018-0001],每籠 3 ～4 只動(dòng)物,自由飲水、攝食,12 h 光照/ 12 h 黑暗,溫度 20℃ ～25℃,相對(duì)濕度 40%～70%。,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后入組,進(jìn)行相應(yīng)的操作。 整個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)期間嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3R 原則給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人道主義關(guān)懷,本實(shí)驗(yàn)獲本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(IACUC2018-027)。

1.2 主要試劑與儀器

新安鼻淵方流浸膏由我院中藥制劑實(shí)驗(yàn)室制備;金黃色葡萄球菌由我院微生物室從患者標(biāo)本中分離獲得;AMD3100 購買于美國Sigma 公司;TNF-α、IL-1β 酶聯(lián)免疫試劑盒以及 AEC 顯色試劑盒、PBS 購買于北京索萊寶科技有限公司;嗅標(biāo)記蛋白(olfactorymarkerprotein,OMP)、TUNEL、SDF-1 以及CXCR4 免疫組化試劑以及 cleaved caspase 3、Bax 以及Bcl-2 一抗試劑盒購買于英國Abcam 公司;切片機(jī)(Leica,德國);倒置顯微鏡(OLYMPUS,日本);高速離心機(jī)(Eppendorf,德國);紫外分光光度計(jì)(Thermo,美國);超低溫冰箱(Siemens,德國)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組及建模

本研究中40 只大鼠分為4 組每組10 只,包括對(duì)照組,模型組(急性鼻竇炎),治療組(急性鼻竇炎+新安鼻淵方流浸膏),抑制劑組(急性鼻竇炎+CXCR4 特異性抑制劑AMD3100)。 除對(duì)照組外,其余各組大鼠均構(gòu)建急性鼻竇炎模型,建模過程如下:麻醉大鼠,剃除鼻背部毛、沿鼻中線部位皮下注射利多卡因麻醉大鼠,切開皮膚,分離粘膜以暴露上頜竇前壁區(qū),可見左側(cè)上頜竇前壁,暴露上頜竇骨壁,采用2 mm 鉆頭鉆開上頜竇前壁,將無菌生物止血棉塞入竇腔,0.2 mL 金黃色葡萄球菌懸液注入竇腔,縫合傷口,對(duì)照組注射等量無菌生理鹽水代替,其余操作與同上。 造模后第7 天開始采用灌胃方式連續(xù)給藥1 周,每天1 次。 其中治療組給藥新安鼻淵方流浸膏按照大鼠體重計(jì)算(7 g/kg),抑制劑組給予1 mg/kg AMD3100,對(duì)照組以及模型組灌胃等量的生理鹽水。 模型的建立通過大鼠鼻竇炎癥狀評(píng)分進(jìn)行檢測[5]:于給藥前、末次給藥后1 h 分別觀察30 min 內(nèi)大鼠鼻竇炎癥狀,評(píng)分規(guī)則如表1,鼻竇炎癥狀評(píng)分總計(jì)大于7 分認(rèn)為模型建立成功。

1.3.2 鼻粘膜組織炎性細(xì)胞因子檢測

將各組大鼠處死后,分離鼻粘膜并用生理鹽水洗滌,收集鼻腔流出液體,離心取上清,采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒對(duì)各組大鼠鼻腔灌洗液中炎性因子TNF-α 以及 IL-1β 的濃度進(jìn)行測定。 使用多功能酶標(biāo)儀檢測450 nm 處吸光度,用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞因子以及對(duì)應(yīng)濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組樣本中TNF-α 以及 IL-1β 的濃度。

1.3.3 免疫熒光觀察OMP 蛋白的表達(dá)

處死動(dòng)物后,用手術(shù)刀劃取左側(cè)竇口1 mm×1 mm 大小鼻頂部黏膜,4%甲醛溶液固定,常規(guī)石蠟切片。 切片經(jīng)PBS 漂洗后加入蛋白酶K-鹽酸緩沖液恒溫孵育20 min,再經(jīng)PBS 漂洗后加入山羊血清封閉30 min;滴加稀釋好的(1 ∶500)山羊抗鼠OMP,4℃過夜;再加稀釋好的(1 ∶500)兔抗山羊熒光二抗,PBS 漂洗后甘油封片,置于熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.3.4 HE 以及免疫組化檢測

將上述制備好的各組大鼠的石蠟切片采用二甲苯脫蠟,乙醇脫水,過氧化物酶滅活,血清封閉后分別加入SDF-1 以及CXCR4 的一抗,4℃ 條件下過夜孵育;加入二抗,孵育30 min 后加入鏈霉素卵白素工作液并在37℃條件下孵育30 min;使用DAB顯色,顯微鏡下觀察染色情況。 陽性細(xì)胞表示為細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色或棕褐色,并采用Image J 軟件對(duì)于對(duì)各組光密度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.3.5 TUNEL 染色檢測各組大鼠嗅上皮神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡

取各組大鼠嗅上皮組織,常規(guī)方法固定,石蠟包埋切片,二甲苯浸洗兩次,梯度乙醇浸洗5 min,風(fēng)干后3%雙氧水-甲醇浸泡10 min,PBS 漂洗3 次,每次3 min,然后4℃預(yù)冷乙醇上進(jìn)行如下操作:0.1%TRItonX-100、0.1%緩沖液處理2 min,PBS 漂洗3 次,每次3 min,加入TUNEL 反應(yīng)混合液,封口膜密封,暗濕盒反應(yīng)1 h,溫度37℃,PBS 漂洗,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹脂封片,顯微鏡進(jìn)行觀察,采用Image J 軟件對(duì)各組光密度值進(jìn)行分析。

表1 急性鼻竇炎癥狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Score criteria for acute sinusitis symptoms

1.3.6 Western blot 檢測

將各組大鼠嗅上皮組織樣本加入300 μL RIPA裂解液,裂解10 min 后離心5 min(15000 r/min),收集上清。 每組上樣20 μg 蛋白樣本。 將蛋白樣品和上樣緩沖液混合均勻,100℃水浴變性3 min,采用10% SDS-PAGE 分離膠電泳,轉(zhuǎn)膜,室溫封閉2 h,加入稀釋后的 cleaved caspase 3 一抗(1 ∶1000)、Bax 一抗(1 ∶500)、Bcl-2 一抗(1 ∶500)、β-actin 一抗(1 ∶2500),搖床 4℃孵育過夜。 復(fù)溫后用 PBST 洗滌PVDF 膜三次后加入 HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠 IgG,37℃孵育2 h 之后ECL 顯影拍照,保存圖像, Image J 軟件分析條帶的灰度值,以β-actin 作為內(nèi)參計(jì)算各蛋白的相對(duì)表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用軟件 SPSS 21.0、GraphPad Prism 5 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s),兩組數(shù)據(jù)間比較采用獨(dú)立t檢驗(yàn),P＜0.05 表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 大鼠鼻竇炎癥狀評(píng)分

給藥前模型組與各給藥組評(píng)分相比,評(píng)分無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05),模型組和各治療組評(píng)分結(jié)果顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。 給藥后模型組評(píng)分顯著高于對(duì)照組,各治療組評(píng)分顯著低于模型組(P＜0.05),治療組與抑制劑組組在評(píng)分上相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)見表2。

2.2 OMP 熒光標(biāo)記結(jié)果

成熟的嗅上皮神經(jīng)細(xì)胞OMP 熒光染色后紅色熒光表示陽性,本實(shí)驗(yàn)中標(biāo)本切片為OMP 陽性細(xì)胞,說明實(shí)驗(yàn)取材位置為嗅覺黏膜,可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究,見圖1。

2.3 大鼠嗅上皮組織HE 染色以及炎性因子檢測

與對(duì)照組比較,模型組大鼠嗅上皮組織損傷嚴(yán)重,且 TNF-α 以及 IL-1β 顯著增加(P＜0.05);治療組與模型組相比嗅上皮組織損傷減輕,TNF-α 以及IL-1β 表達(dá)明顯降低(P＜0.05);治療組組與抑制劑組相比,炎性因子 TNF-α 以及 IL-1β 表達(dá)無顯著差異(P＞0.05),見圖 2。

2.4 大鼠嗅上皮神經(jīng)元細(xì)胞凋亡

與對(duì)照組比較,模型組大鼠嗅上皮神經(jīng)元細(xì)胞凋亡顯著增多(P＜0.05);與模型組相比,治療組組與抑制劑組大鼠嗅上皮神經(jīng)元細(xì)胞凋亡減少(P＜0.05),治療組與抑制劑組相比無明顯差異(P＞0.05)見圖 3。

2.5 大鼠嗅上皮組織SDF-1、CXCR4 的蛋白表達(dá)

相比于對(duì)照組,模型組大鼠嗅上皮組織SDF-1、CXCR4 的蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.05);治療組與抑制劑組大鼠與模型組相比嗅上皮組織SDF-1、CXCR4 的蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.05);治療組與抑制劑組相比無明顯差異(P＞0.05),見圖4。

2.6 大鼠嗅上皮組織caspase-3、Bax 以及Bcl-2 的表達(dá)

相比于對(duì)照組,模型組大鼠嗅上皮組織重促凋亡蛋白cleaved caspase 3、Bax 的表達(dá)顯著升高(P＜0.05),抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05);治療組與抑制劑組大鼠與模型組相比嗅上皮組織促凋亡蛋白cleaved caspase 3、Bax 的表達(dá)明顯降低(P＜0.05)抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)顯著增加(P＜0.05);治療組與抑制劑組相比無明顯差異(P＞0.05),見圖 5。

3 討論

急性鼻竇炎是發(fā)生于鼻竇粘膜的一種炎癥性疾病,主要病理特征為各種竇口狹窄或阻塞,以及黏膜纖毛功能發(fā)生障礙。 作為耳鼻咽喉科的常見病和多發(fā)病,其主要的臨床表現(xiàn)為嗅覺功能障礙,同時(shí)會(huì)伴有鼻塞、鼻癢、流涕、打噴嚏、頭痛、頭昏等癥狀[6]。 其病因復(fù)雜,發(fā)病機(jī)制尚不明確,牽涉因素眾多,可能與細(xì)菌感染、過敏反應(yīng)、環(huán)境因素等多種因素有關(guān)[7-9]。 在急性期若沒有得到及時(shí)治療則會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)槁员歉]炎,嚴(yán)重影響患者正常生活。

近年來,中藥應(yīng)用于鼻炎的研究受到眾多研究者的重視[10-11]。 新安鼻淵方流浸膏主要包含中藥敗醬草、黃芪、魚腥草、辛夷等[12-13]。 該方具有清熱解毒、祛瘀排膿、止痛通竅的功效。 敗醬草具清熱解毒、排膿消癰、止痛之功,被廣泛用于治療肺經(jīng)蘊(yùn)熱、膽經(jīng)(腑)郁熱所導(dǎo)致的鼻淵癥狀[14]。 黃芪能排膿通竅,補(bǔ)益正氣,斂瘡生肌,現(xiàn)代藥理學(xué)證實(shí)其可增強(qiáng)機(jī)體免疫[15]。 相關(guān)研究[5]表明新安鼻淵方流浸膏對(duì)于急性鼻竇炎有很好的治療效果。 常見的急性鼻竇炎致病菌有金黃色葡萄球菌、肺炎雙球菌等[16],因此本研究中,采用金黃色葡萄球菌構(gòu)建急性鼻竇炎大鼠模型。 結(jié)果表明模型組大鼠鼻竇炎癥狀評(píng)分以及嗅上皮神經(jīng)元細(xì)胞凋亡比例顯著多于對(duì)照組,證明模型建立成功。 新安鼻淵方流浸膏組大鼠的嗅上皮神經(jīng)細(xì)胞凋亡以及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)明顯低于模型組,表明新安鼻淵方流浸膏對(duì)于大鼠急性鼻竇炎具有明顯的改善作用。 但是,對(duì)于新安鼻淵方流浸膏治療急性鼻竇炎的相關(guān)機(jī)制目前仍不清楚。 因此,本研究構(gòu)建大鼠急性鼻竇炎模型來探究新安鼻淵方流浸膏對(duì)于鼻竇炎的調(diào)節(jié)作用以及其相關(guān)機(jī)制。

圖1 OMP 免疫熒光結(jié)果Figure 1 Results of OMP immunofluorescence

圖2 HE 染色觀察各組大鼠鼻黏膜病理變化Note. A, Control group. B, Model group. C, Treatment group. D,Inhibitor group. Compared with the control group, *P ＜0.05.Compared with the model group, #P ＜0.05. The same as below.Arrow indicates eosinophilic infiltration.Figure 2 Pathological changes of nasal mucosa of rats in each group were observed by HE staining

圖3 各組大鼠嗅上神經(jīng)元細(xì)胞凋亡Figure 3 Apoptosis of upper olfactory neurons in each group

圖4 免疫組化檢測各組大鼠SDF-1、CXCR4 的表達(dá)Figure 4 Expression of SDF-1 and CXCR4 in each group was detected by immunohistochemistry

圖 5 caspase-3、Bax 以及 Bcl-2 蛋白表達(dá)水平Note. A, Control group. B, Model group. C, Treatment group. D,Inhibitor group. Compared with control group,*P＜0.05.Compared with the model group,#P＜0.01.Figure 5 Expression levels of cleaved caspase 3, Bax and Bcl-2

表2 給藥前后大鼠鼻竇炎評(píng)分表(n=10)Table 2 Scores of sinusitis of rats before and after administration

近年來,趨化因子受體 CXCR4 以及 SDF-1/CXCR4 相互作用形成的信號(hào)通路由于參與多種疾病的發(fā)生以及發(fā)展而備受關(guān)注[17]。 其中SDF-1 作為一種趨化因子,由炎性反應(yīng)因子如TNF-α、IL-1β所誘導(dǎo),由于其對(duì)炎性反應(yīng)細(xì)胞具有強(qiáng)大的趨化能力,因此常被作為炎性反應(yīng)的特異性指標(biāo)。 此外,CXCR4 是一個(gè)G 蛋白偶聯(lián)受體,作為SDF-1 唯一的受體,CXCR4 多表達(dá)于免疫細(xì)胞之中,對(duì)細(xì)胞生長發(fā)育至關(guān)重要。 目前,研究證明SDF-1/CXCR4 信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞凋亡具有明顯的調(diào)節(jié)作用[18-19]。 此外,相關(guān)研究[20-21]表明SDF-1/CXCR4 在鼻炎鼻粘膜中呈現(xiàn)高表達(dá)現(xiàn)象,提示該通路參與鼻炎鼻粘膜病變的發(fā)生和發(fā)展。 B 淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)是一種抗凋亡蛋白,以線粒體為單位參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控,其同源二聚體X 蛋白(Bax)是一種促凋亡蛋白,Bcl-2 和Bax 是在凋亡調(diào)控過程中功能對(duì)立的一對(duì)重要的調(diào)控基因,cleaved caspase 3 作為凋亡過程中最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶誘發(fā)細(xì)胞凋亡[22-23]。 眾多研究[24-25]證實(shí):SDF-1/CXCR4 通路的激活導(dǎo)致 Bax、cleaved caspase 3 等促凋亡蛋白表達(dá)升高,抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)降低最終誘發(fā)細(xì)胞凋亡。 本研究中,相比于模型組,治療組大鼠SDF-1 以及CXCR4 的表達(dá)顯著降低,同時(shí)促凋亡蛋白表達(dá)明顯降低,抗凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)顯著增高,而給予CXCR4 特異性抑制劑AMD3100 處理后,大鼠病理變化與治療組相似。 以上結(jié)果提示,新安鼻淵方流浸膏對(duì)于急性鼻竇炎大鼠嗅上神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的改善作用可能是通過抑制SDF-1/CXCR4 信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述,本研究通過建立大鼠急性鼻竇炎模型驗(yàn)證了新安鼻淵方流浸膏可能通過抑制SDF-1/CXCR4 的表達(dá),從而抑制嗅上皮神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡,最終改善急性鼻竇炎癥狀。 然而急性鼻竇炎的發(fā)生發(fā)展涉及因素眾多,機(jī)制復(fù)雜,因此新安鼻淵方流浸膏改善變急性鼻竇炎嗅上皮神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制有待深入研究。