2017-2019年重慶市自制抗酸染色標(biāo)本室間質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果分析

王淑玲，顏 令，徐蘭蘭，張 震，李 甜，廖 璞

中國(guó)科學(xué)院大學(xué)重慶醫(yī)院檢驗(yàn)科/重慶市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科/重慶市臨床檢驗(yàn)中心，重慶 400014

由于人類免疫缺陷病毒感染、人群老年化、空氣污染等因素影響，結(jié)核病發(fā)病率逐年增高，其仍然是一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。世界衛(wèi)生組織(WHO)最新發(fā)布的《2019年全球結(jié)核病報(bào)告》顯示，我國(guó)仍為全球30個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，每年新發(fā)結(jié)核病患者約90萬(wàn)例，位居全球第3位[1]。及時(shí)篩選出結(jié)核帶菌人群，及時(shí)隔離及治療，減少結(jié)核病傳播已成為我國(guó)傳染病防治的重點(diǎn)。用于診斷結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)雖然發(fā)生了變化，但直接痰涂片抗酸染色仍是診斷和監(jiān)測(cè)結(jié)核病的最具成本效益的方法[2]。痰涂片染色顯微鏡檢查錯(cuò)誤可能會(huì)導(dǎo)致無(wú)法發(fā)現(xiàn)感染結(jié)核病的患者，而未被檢測(cè)到的患者可能會(huì)繼續(xù)在社區(qū)中傳播疾病，或進(jìn)行不必要的治療。為了解本市各級(jí)實(shí)驗(yàn)室抗酸染色及顯微鏡檢查能力，提高本市臨床微生物抗酸染色顯微鏡檢查能力，重慶市臨床檢驗(yàn)中心于2017年下半年開(kāi)始開(kāi)展抗酸染色顯微鏡檢查室間質(zhì)量評(píng)價(jià)(EQA)，至今開(kāi)展了5次，現(xiàn)將結(jié)果總結(jié)分析如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株 膿腫分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC19977(CICC10381)購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.1.2自制EQA標(biāo)本 在生物安全柜內(nèi)刮取血平板上生長(zhǎng)3 d的膿腫分枝桿菌，調(diào)菌懸液到0.50麥?zhǔn)蠁挝唬?%胰蛋白酶37 ℃消化臨床膿痰30 min，分別用消化后的痰液將菌懸液稀釋10倍(4+)、50倍(3+)、100倍(2+)、200倍(1+)，取10 μL不同稀釋倍數(shù)的菌懸液可制備成不同等級(jí)的樣品，涂抹玻片中央呈2 cm2菌膜，經(jīng)過(guò)穩(wěn)定性和均一性評(píng)價(jià)合格后方可作為抗酸染色EQA標(biāo)本[3-4]。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本發(fā)放及檢測(cè) EQA通過(guò)批量測(cè)試方式進(jìn)行。重慶市臨床檢驗(yàn)中心向申請(qǐng)參加EQA的實(shí)驗(yàn)室發(fā)送未染色的涂片標(biāo)本，由參加實(shí)驗(yàn)室人員自行染色，顯微鏡檢查讀片，然后由重慶市臨床檢驗(yàn)中心對(duì)讀片結(jié)果進(jìn)行分析評(píng)估。EQA標(biāo)本每年發(fā)放2次，每次5個(gè)標(biāo)本。本市參加EQA的實(shí)驗(yàn)室按照通知，收到標(biāo)本后立即檢測(cè)，或放置室溫保存并在規(guī)定日期前檢測(cè)和上報(bào)檢測(cè)結(jié)果。檢測(cè)時(shí)按照實(shí)驗(yàn)室臨床標(biāo)本抗酸染色及顯微鏡檢查操作規(guī)程進(jìn)行。

1.2.2數(shù)據(jù)收集 依據(jù)CNAS-GL002：2018《能力驗(yàn)證結(jié)果的統(tǒng)計(jì)處理和能力評(píng)價(jià)指南》[5]，統(tǒng)計(jì)參評(píng)實(shí)驗(yàn)室對(duì)質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)本的測(cè)定結(jié)果與預(yù)期結(jié)果的符合程度。預(yù)期陰性報(bào)告陽(yáng)性不得分；預(yù)期陽(yáng)性報(bào)告陰性不得分；預(yù)期陽(yáng)性與預(yù)期上下差1個(gè)數(shù)量級(jí)皆為符合得20分；預(yù)期陽(yáng)性標(biāo)本與預(yù)期上下差2個(gè)及以上數(shù)量級(jí)得10分。參照WS/T 644-2018《臨床檢驗(yàn)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)》，根據(jù)符合率來(lái)判斷參評(píng)實(shí)驗(yàn)室的能力是否合格(合格標(biāo)準(zhǔn)為大于等于80分)。對(duì)每一個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目的評(píng)價(jià)為：(某項(xiàng)目測(cè)定結(jié)果可接受標(biāo)本數(shù)/某項(xiàng)目標(biāo)本總數(shù))×100=本次某項(xiàng)目測(cè)定得分，如果該項(xiàng)目得分大于等于80分則為滿意(合格)；對(duì)于所有檢測(cè)項(xiàng)目的評(píng)價(jià)為：(所有項(xiàng)目測(cè)定結(jié)果可接受標(biāo)本數(shù)/標(biāo)本總數(shù))×100=本次所有項(xiàng)目測(cè)定得分，如果所有項(xiàng)目得分大于等于80分則為滿意(合格)[6]。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Excel 2016對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)、率表示。

2 結(jié) 果

2.1參加抗酸染色顯微鏡檢查并上報(bào)數(shù)據(jù)的實(shí)驗(yàn)室數(shù)和合格率 參加該項(xiàng)目EQA的實(shí)驗(yàn)室數(shù)從2017年58家增加至2019年88家，合格率從2017年的96.6%增加至2019年的97.7%，見(jiàn)表1。

表1 2017-2019年參加并上報(bào)數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)室數(shù)和合格率

2.2參加抗酸染色顯微鏡檢查實(shí)驗(yàn)室級(jí)別構(gòu)成和合格情況 參加EQA的單位主要是綜合性二、三級(jí)醫(yī)院和中醫(yī)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室，民營(yíng)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室和獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室也逐步加入。2019年綜合性二級(jí)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室35家，占39.8%，綜合性三級(jí)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室24家，占27.3%，系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室20家，占22.7%。參加實(shí)驗(yàn)室合格率逐步上升，見(jiàn)表2。

表2 2017-2019年參加EQA實(shí)驗(yàn)室級(jí)別構(gòu)成和合格情況

2.32017-2019年抗酸染色顯微鏡檢查結(jié)果 抗酸染色顯微鏡檢查各標(biāo)本符合率在88.2%～100.0%，見(jiàn)表3。

表3 2017-2019年抗酸染色顯微鏡檢查結(jié)果

2.4實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本抗酸染色顯微鏡檢查結(jié)果符合情況 5次抗酸染色鏡檢EQA，共發(fā)放陰性標(biāo)本1 158份，陰性標(biāo)本符合率97.8%；發(fā)放陽(yáng)性標(biāo)本772份，陽(yáng)性標(biāo)本符合率98.1%；總體符合率97.9%，見(jiàn)表4。

表4 實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本抗酸染色鏡檢結(jié)果符合情況[n(%)]

2.5實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本抗酸染色顯微鏡檢查錯(cuò)誤結(jié)果分析 高假陽(yáng)性(HFP)即陰性標(biāo)本錯(cuò)誤報(bào)告為2+～4+；高假陰性(HFN)即陽(yáng)性標(biāo)本2+～4+錯(cuò)誤報(bào)告為陰性；低假陽(yáng)性(LFP)即陰性標(biāo)本報(bào)告為1+及以下；低假陰性(LFN)即1+及以下陽(yáng)性標(biāo)本錯(cuò)誤報(bào)告為陰性[7-8]。陰性標(biāo)本1 158份，回報(bào)結(jié)果HFP錯(cuò)誤的占1.1%，LFP錯(cuò)誤占1.1%；陽(yáng)性標(biāo)本772份，回報(bào)結(jié)果HFN錯(cuò)誤的占1.9%；1 930份標(biāo)本的總錯(cuò)誤占2.1%，見(jiàn)表5。

表5 實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本抗酸染色顯微鏡檢查錯(cuò)誤結(jié)果分類[n(%)]

2.6實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本抗酸染色顯微鏡檢查陽(yáng)性結(jié)果量化誤差(QE) 陽(yáng)性級(jí)別判斷上相差2個(gè)及以上數(shù)量級(jí)，例如將4+報(bào)告為1+/2+或?qū)?+/2+報(bào)告為4+[6-7]，772份陽(yáng)性標(biāo)本中有42份標(biāo)本上報(bào)結(jié)果存在QE，占5.4%。

2.7涂片抗酸染色儀器使用情況 使用全自動(dòng)染片儀的實(shí)驗(yàn)室僅有3家，占3.4%，96.6%實(shí)驗(yàn)室仍是傳統(tǒng)人工染色。

3 討 論

WHO在2017年11月全球結(jié)核病部長(zhǎng)級(jí)會(huì)議上重申了到2030年終止結(jié)核病流行的宣言。印度(27%)、中國(guó)(14%)和俄羅斯(9%)是全球耐藥結(jié)核病負(fù)擔(dān)最大的3個(gè)國(guó)家，我國(guó)控制結(jié)核疫情形勢(shì)相當(dāng)嚴(yán)峻，發(fā)現(xiàn)病例的創(chuàng)新方法將有助于降低結(jié)核病發(fā)病率[9]。結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁內(nèi)富含的脂質(zhì)和分枝菌酸，可抵抗鹽酸酒精的脫色，苯酚復(fù)紅將其染成紅色。隨著實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)的發(fā)展，很多先進(jìn)的技術(shù)被應(yīng)用，如Gene Xpert MTB/RIF檢測(cè)具有準(zhǔn)確、快速、安全等優(yōu)點(diǎn)，但費(fèi)用昂貴；培養(yǎng)法雖然靈敏度高，而且能鑒定到菌種和藥敏試驗(yàn)，但是操作繁瑣，培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，報(bào)告陽(yáng)性的時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)12周[10]。涂片抗酸染色目前仍是各級(jí)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的基本方法。WHO宣布，控制結(jié)核病最佳策略的重要一步是通過(guò)痰涂片顯微鏡檢查來(lái)識(shí)別可疑患者，在涂片中找到結(jié)核桿菌是確診結(jié)核的金標(biāo)準(zhǔn)[11]。醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可和各級(jí)醫(yī)院評(píng)審都對(duì)抗酸染色提出要進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控和參加EQA的要求。為了加強(qiáng)標(biāo)本抗酸染色顯微鏡鏡檢的準(zhǔn)確性，促進(jìn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部人員結(jié)果的一致性，重慶市臨床檢驗(yàn)中心于2017年在全國(guó)較早地開(kāi)展了抗酸染色顯微鏡檢查EQA。目前抗酸染色EQA包括實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)場(chǎng)評(píng)價(jià)、盲法復(fù)檢以及批量測(cè)試?，F(xiàn)場(chǎng)評(píng)價(jià)的優(yōu)點(diǎn)是能直接觀察實(shí)驗(yàn)室實(shí)際工作，能核實(shí)并驗(yàn)證設(shè)備和耗材，因此有利于發(fā)現(xiàn)問(wèn)題；缺點(diǎn)是工作時(shí)間短，工作強(qiáng)度大，而且花費(fèi)高。盲法復(fù)檢是組織者現(xiàn)場(chǎng)抽取實(shí)驗(yàn)室保存的陽(yáng)性和陰性標(biāo)本片子送到另一個(gè)實(shí)驗(yàn)室顯微鏡檢查，這種方式可評(píng)估顯微鏡檢查結(jié)果，但不能更好地評(píng)估實(shí)驗(yàn)室染色過(guò)程。本中心自制抗酸染色涂片標(biāo)本，以批量測(cè)試方式發(fā)放到參與實(shí)驗(yàn)室，可以發(fā)現(xiàn)抗酸染色過(guò)程和顯微鏡檢查方面存在的問(wèn)題。

隨著實(shí)驗(yàn)室建設(shè)規(guī)范化及質(zhì)控意識(shí)日益增強(qiáng)，本市各級(jí)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室積極參加EQA，由2017年最初的58家增加至2019年的88家實(shí)驗(yàn)室，綜合三級(jí)醫(yī)院由17家增加至24家，綜合二級(jí)醫(yī)院由21家增加至35家，中醫(yī)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室由14家增加至20家，民營(yíng)醫(yī)院由3家增加至6家。經(jīng)過(guò)5次EQA項(xiàng)目的開(kāi)展，實(shí)驗(yàn)室總合格率從96.6%上升至97.7%，抗酸染色顯微鏡檢查正確率明顯提高，這也正是抗酸染色顯微鏡檢查EQA開(kāi)展的目的體現(xiàn)。

2017-2019年共發(fā)放涂片標(biāo)本1 930張，陽(yáng)性標(biāo)本符合率為98.1%，陰性標(biāo)本符合率為97.8%，總符合率97.9%。在埃塞俄比亞南部，SHARGIE等[12]進(jìn)行了一項(xiàng)盲目復(fù)查研究，結(jié)果顯示總體錯(cuò)誤為3.2%，總符合率為96.8%。本市抗酸染色鏡檢總符合率稍高于此文獻(xiàn)報(bào)道。

201814號(hào)標(biāo)本有9家實(shí)驗(yàn)室發(fā)生了HFN結(jié)果，是符合率最低的標(biāo)本。本中心對(duì)此進(jìn)行了調(diào)查分析發(fā)現(xiàn)，本次發(fā)放的5個(gè)標(biāo)本中201814號(hào)標(biāo)本制備時(shí)標(biāo)本性質(zhì)不如其他4個(gè)標(biāo)本黏稠，該標(biāo)本更容易脫色，造成有些實(shí)驗(yàn)室染色呈陰性。這提醒實(shí)驗(yàn)室抗酸染色時(shí)由于標(biāo)本性質(zhì)的不同，具體脫色時(shí)間應(yīng)根據(jù)標(biāo)本情況決定，否則易產(chǎn)生假陽(yáng)性或假陰性。201913號(hào)標(biāo)本5家實(shí)驗(yàn)室報(bào)告了LFP，實(shí)驗(yàn)室忽略了陰性片子的質(zhì)控。報(bào)告假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果都是重大的錯(cuò)誤，本市室間質(zhì)評(píng)項(xiàng)目總錯(cuò)誤率為2.1%，陰性標(biāo)本檢測(cè)回報(bào)結(jié)果假陽(yáng)性率達(dá)到2.2%。MOSISSA等[13]報(bào)道不染色標(biāo)本有1.6%假陽(yáng)性率，比本市實(shí)驗(yàn)室自己染色標(biāo)本假陽(yáng)性低。假陽(yáng)性結(jié)果會(huì)造成嚴(yán)重后果，會(huì)因誤診而對(duì)病人造成傷害，增加社會(huì)成本，并導(dǎo)致對(duì)實(shí)驗(yàn)室提供的服務(wù)失去信心。假陽(yáng)性結(jié)果可能與實(shí)驗(yàn)室專業(yè)人員培訓(xùn)水平有關(guān)，如染色技術(shù)、實(shí)驗(yàn)室人員顯微鏡檢查技術(shù)、批量測(cè)試等因素引起。假陽(yáng)性結(jié)果預(yù)防措施：注意染色質(zhì)量問(wèn)題，染液結(jié)晶會(huì)誤認(rèn)成抗酸桿菌；染色時(shí)玻片保持一定距離，相互徹底分開(kāi)，避免菌漂移污染；染色時(shí)勿使玻片染液干燥；染色時(shí)標(biāo)本按一定順序擺放；保證染色完畢標(biāo)本標(biāo)簽完整可視。

本市室間質(zhì)評(píng)項(xiàng)目陽(yáng)性標(biāo)本檢測(cè)回報(bào)結(jié)果假陰性率為1.9%，MOSISSA等[13]研究報(bào)道假陰性率高達(dá)9.7%，AYANA等[14]研究報(bào)道假陰性率高達(dá)15.0%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于本市結(jié)果。這與MOSISSA研究標(biāo)本數(shù)為32個(gè)，AYANA研究標(biāo)本數(shù)為80個(gè)，都遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于本市標(biāo)本數(shù)有關(guān)。假陰性結(jié)果患者可能不會(huì)接受治療，從而導(dǎo)致進(jìn)一步的社區(qū)傳播和結(jié)核病的防控失敗。通過(guò)將上報(bào)假陰性結(jié)果的標(biāo)本回收發(fā)現(xiàn)，由于標(biāo)本脫色過(guò)度，造成假陰性。假陰性結(jié)果預(yù)防措施：先閱讀室內(nèi)質(zhì)控片是否在控；報(bào)告陰性前，閱片滿足300個(gè)視野。

本市QE率高達(dá)5.4%，QE反映大家在閱片時(shí)存在一個(gè)以上數(shù)量差異，這個(gè)數(shù)據(jù)低于MOSISSA等[13]報(bào)道的不染色標(biāo)本的11.6%。造成QE原因有染色時(shí)加熱不充分，未能使抗酸桿菌充分著色；觀察涂片視野數(shù)量不足；陽(yáng)性涂片的分級(jí)報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)掌握差。這需要加強(qiáng)人員培訓(xùn)和實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)，逐步實(shí)現(xiàn)結(jié)果一致性。

抗酸染色顯微鏡檢查對(duì)染色過(guò)程和顯微鏡鏡檢都有要求。目前本市實(shí)驗(yàn)室抗酸染色使用染片儀有3家，絕大多數(shù)都是人工進(jìn)行染色。針對(duì)人工染色，更需要做好室內(nèi)質(zhì)控，保證試劑的有效性和人員操作的正確性。顯微鏡鏡檢與一般檢測(cè)不同，要求人員具有豐富的形態(tài)學(xué)工作經(jīng)驗(yàn)，具備一定的臨床知識(shí)和綜合分析能力。在實(shí)際工作中，由于標(biāo)本性質(zhì)、細(xì)菌本身對(duì)染液的親和力以及細(xì)菌受到藥物影響后形態(tài)的變異等，往往給實(shí)驗(yàn)室鏡檢人員對(duì)細(xì)菌的認(rèn)知帶來(lái)很大的困難，這要靠培訓(xùn)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)來(lái)提高對(duì)細(xì)菌辨識(shí)能力[15]。

EQA可發(fā)現(xiàn)和糾正常規(guī)工作中的問(wèn)題。通過(guò)自制標(biāo)本開(kāi)展抗酸染色顯微鏡檢查EQA工作，實(shí)驗(yàn)室對(duì)抗酸染色顯微鏡檢查質(zhì)量控制越來(lái)越重視，抗酸染色顯微鏡檢查質(zhì)量有明顯改進(jìn)，推動(dòng)了抗酸染色顯微鏡檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性、可比性，為臨床診療提供快速可靠的依據(jù)，為結(jié)核病控制發(fā)揮積極作用。