基于靜態(tài)頂空氣相離子遷移譜技術(shù)的果啤種類判別

龔 霄，周 偉，李積華, ，涂京霞 ，楊濤華，霍羽佳

（1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江 524001；2.海南省果蔬貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江 524001；3.廣州珠江啤酒股份有限公司，廣東廣州 510308；4.山東海能科學(xué)儀器有限公司GAS事業(yè)部，山東德州 251500）

果啤作為一種重要的精釀啤酒產(chǎn)品，兼具啤酒清爽口感和水果的香甜味道，受到越來越多消費(fèi)者的青睞[1]。我國(guó)啤酒市場(chǎng)的果啤產(chǎn)品主要有果味啤酒、果汁啤酒和果釀啤酒三個(gè)類型[2]。據(jù)報(bào)道，啤酒中超過1000種化合物已被鑒定出來，包括如酯、醇、酸、醛、酮、烴、醚、硫化物、脂環(huán)族化合物、芳香族化合物、雜環(huán)化合物等，它們?cè)醋喳溨?、啤酒花和酵母等原料本身。制麥及糖化、啤酒花的添加、酵母的酒精發(fā)酵等生產(chǎn)工藝都對(duì)啤酒最終的香氣和風(fēng)味有著重要影響[3]。果啤中由于添加的水果原料來源及方式不同，其風(fēng)味更加多樣化[4]。目前，針對(duì)啤酒中揮發(fā)性香氣成分的判別研究主要基于電子鼻（electronic nose，EN）[5]、電子舌（electronic tongue，ET）[6]、核磁共 振（nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）[7]、GC-MS[8]和GC-O[9]的方法，存在樣品必須經(jīng)過衍生化處理、色譜柱分離溫度高、分析時(shí)間長(zhǎng)和受人工經(jīng)驗(yàn)的限制等不足之處。離子遷移譜（ion mobility spectrometry, IMS）技術(shù)是二十世紀(jì)七十年代發(fā)展起來的一門新興的化學(xué)分析技術(shù)，它是以離子化分子在載體緩沖氣體中的遷移率為基礎(chǔ)，在氣相中對(duì)其進(jìn)行分離和識(shí)別，然后根據(jù)電場(chǎng)中氣相離子遷移速率的差異來表征化學(xué)離子物質(zhì)，最早被用于痕量化學(xué)戰(zhàn)劑和非法藥物的探測(cè)[10]。鑒于其體積小、靈敏度高、適用范圍廣、分析時(shí)間快、樣品前處理簡(jiǎn)單，且可在常壓和室溫下工作，近年來在生物化學(xué)[11]、藥劑學(xué)[12]和食品[13]等諸多領(lǐng)域得到廣泛關(guān)注。在食品科學(xué)領(lǐng)域，IMS被嘗試用于食品組分分析、加工過程監(jiān)測(cè)、產(chǎn)品風(fēng)味評(píng)價(jià)和溯源等方面[14-15]。與傳統(tǒng)GC-MS的方法相比，氣相離子遷移譜（GC-IMS）要求樣品處理及分析的溫度較低，更能反映樣品真實(shí)狀態(tài)，目前在白酒、黃酒和果酒關(guān)鍵香氣物質(zhì)解析過程中得到廣泛關(guān)注[16-19]，但關(guān)于啤酒中香氣成分分析的研究未見報(bào)道[20]。

本研究選擇菠蘿、蘋果和蔓越莓三種果啤為研究對(duì)象，采用靜態(tài)頂空氣相離子遷移譜技術(shù)構(gòu)建揮發(fā)性有機(jī)物（volatile organic compounds，VOCs）的風(fēng)味指紋圖譜，通過提取差異化合物的特征離子遷移峰，結(jié)合主成分分析（principal component analysis，PCA）對(duì)不同果啤樣品中關(guān)鍵香氣物質(zhì)進(jìn)行判別，以期為果啤生產(chǎn)過程的質(zhì)量控制、產(chǎn)品溯源、品牌鑒定與保護(hù)提供新的思路，為進(jìn)一步闡明不同種類果啤的香氣形成機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菠蘿、蘋果和蔓越莓果啤 均為廣州珠江啤酒股份有限公司2019年生產(chǎn)，購(gòu)自當(dāng)?shù)爻?；Nketones C4～C9標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)AccuStandard公司。

Flavour Spec?食品風(fēng)味分析與質(zhì)量控制系統(tǒng)（配有CTC自動(dòng)頂空進(jìn)樣器、Laboratory Analytical Viewer（LAV）分 析 軟 件、三 款 插 件（Reporter、Gallery Plot、Dynamic PCA）以及GC × IMS Library Search） 德國(guó)G.A.S公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 靜態(tài)頂空氣相離子遷移譜（static headspace-gas chromatography-ion mobility spectroscopy，SH-GCIMS）分析 啤酒樣品存放于4 ℃條件下，分析前輕輕打開，在酒體中部快速吸取2 mL并轉(zhuǎn)移至20 mL體積的頂空進(jìn)樣瓶中，半旋瓶蓋，置于4 ℃超聲水浴28 kHz下脫氣3 s，停止5 s，再脫氣3 s，以除去CO2。Flavour Spec?風(fēng)味分析儀頂空進(jìn)樣體積100 μL；孵育時(shí)間5 min；孵育溫度60 ℃；進(jìn)樣針溫度65 ℃；孵化轉(zhuǎn)速500 r/min；高純度氮?dú)鉃檩d氣；清洗時(shí)間0.5 min。

1.2.2 GC條件 FS-SE-54-CB-1 15 m ID: 0.53 mm石英毛細(xì)管柱，柱溫60 ℃；載氣：高純度氮?dú)猓ā?9.999%）；載氣流速程序：初始2.0 mL/min，保持2 min，8 min內(nèi)線性增至100 mL/min，10 min內(nèi)線性增至150 mL/min，運(yùn)行時(shí)間20 min。

1.2.3 IMS條件 漂移管長(zhǎng)度98 mm；管內(nèi)線性電壓500 V/cm；漂移管溫度45 ℃；漂移氣為高純度氮?dú)猓ā?9.999%）；漂移氣流速150 mL/min；放射源為β射線（氚，3H）；離子化N-ketones C4～C9模式：正離子。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品分析均重復(fù)四次。LAV：用于查看分析譜圖，圖中每一個(gè)點(diǎn)代表一種揮發(fā)性有機(jī)物；對(duì)其建立標(biāo)準(zhǔn)曲線后可進(jìn)行定量分析；Reporter插件：直接對(duì)比樣品之間的譜圖差異（二維俯視圖和三維譜圖）；Gallery Plot插件：指紋圖譜對(duì)比，直觀且定量地比較不同樣品之間的揮發(fā)性有機(jī)物差異；Dynamic PCA插件：動(dòng)態(tài)主成分分析，用于將樣品聚類分析，以及快速確定未知樣品的種類；GC × IMS Library Search：通過軟件內(nèi)置的NIST數(shù)據(jù)庫(kù)和IMS數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)化合物進(jìn)行定性分析，其中N-ketones為標(biāo)準(zhǔn)參照物。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種果啤的揮發(fā)性化合物GC-IMS圖譜分析

應(yīng)用SH-GC-IMS技術(shù)對(duì)菠蘿、蘋果和蔓越莓果啤中的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，得到氣相離子遷移譜圖（圖1），其中，A為揮發(fā)性有機(jī)物的三維譜圖（保留時(shí)間、遷移時(shí)間和峰強(qiáng)度），從圖1中可以直觀看出，菠蘿、蘋果和蔓越莓果啤樣品間揮發(fā)性有機(jī)物存在明顯差異。進(jìn)一步通過數(shù)據(jù)的降維處理，得到二維譜圖（B），其中，橫坐標(biāo)代表離子遷移時(shí)間（min），縱坐標(biāo)代表氣相色譜的保留時(shí)間（s）。通過比較離子漂移時(shí)間和離子峰強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)對(duì)各組分的定性和相對(duì)定量分析。橫坐標(biāo)8.0處紅色豎線為反應(yīng)離子峰（RIP峰），RIP峰兩側(cè)的每一個(gè)信號(hào)點(diǎn)代表一種揮發(fā)性成分。顏色代表物質(zhì)的濃度，白色表示濃度較小，紅色表示濃度較大，顏色越深表示濃度越大。

2.2 不同品種果啤的揮發(fā)性化合物GC-IMS圖譜分析

根據(jù)揮發(fā)性成分氣相色譜保留時(shí)間和離子遷移時(shí)間對(duì)果啤揮發(fā)性組分進(jìn)行定性分析，共計(jì)確定檢測(cè)出35種揮發(fā)性化學(xué)成分（表1），同一種化合物的單體和二聚體視為一種化合物。這35種物質(zhì)主要為酯類、醇類、酚類、烯類和醛類，這與文獻(xiàn)中報(bào)道的揮發(fā)性成分測(cè)定結(jié)果較一致[21-22]。其中，22種為酯類。

圖1 不同果啤樣品的GC-IMS圖譜Fig.1 GC-IMS chromatogram of different fruit beer samples

2.3 果啤揮發(fā)性化合物指紋圖譜比較

為進(jìn)一步快速對(duì)比出不同品種果啤之間風(fēng)味物質(zhì)的差異，通過Gallery Plot插件做指紋圖譜對(duì)比，在特定果啤的譜圖上選取信號(hào)峰，系統(tǒng)生成特征指紋圖譜，該特征指紋圖譜用于鑒別待測(cè)樣品是否為特定種類的果啤。由圖2可以看出，乙醇和異戊醇在三種果啤中都存在，異戊醇是啤酒中重要的醇，賦予啤酒水果香味和指甲油氣味[23]。乙酸乙酯、乙酸異戊酯和己酸乙酯在三種果啤中都有較高的濃度，它們賦予啤酒水果味、甜味和花香味[24]。從圖2可以看出，不同果啤揮發(fā)性有機(jī)物差別較大。菠蘿果啤中，辛酸甲酯、乙酸庚酯、己酸丙酯、庚酸乙酯、己酸乙酯和丁酸乙酯濃度較高，且酯在菠蘿啤酒中占比最大，與前述文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果非常吻合[25]。值得注意的是，辛酸甲酯是菠蘿啤酒的特征揮發(fā)性物質(zhì)，它可能來源于菠蘿[26]。蘋果果啤中，乙酸異戊酯、3-甲基戊醇、乙酸丁酯、乙酸異丁酯、丁醛、庚酸甲酯和2-甲基丁酸甲酯濃度較高，乙酸丁酯是唯一在蘋果啤酒中檢測(cè)到的揮發(fā)性物質(zhì)，它賦予啤酒好的風(fēng)味，對(duì)蘋果果啤香氣骨架起到重要支撐作用[27]。蔓越莓果啤中異戊醛、辛酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、丙酸、2,3-二乙基-5-甲基吡嗪、己酸、α-蒎烯、苯乙醛、甲硫基丙醛、水楊酸甲酯和檸檬烯濃度較高，辛酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯和己酸在蔓越莓果汁和蔓越莓果酒中都有檢出[28]。根據(jù)GC-IMS的指紋圖譜可找到三種果啤中揮發(fā)性風(fēng)味成分的關(guān)鍵差異物，通過關(guān)鍵差異物質(zhì)建立特征香氣模型，即可實(shí)現(xiàn)不同品種果啤產(chǎn)品的鑒別。

表1 GC-IMS鑒別不同果啤樣品中的揮發(fā)性成分Table 1 Identification of volatile compounds in different fruit beers by GC-IMS

圖2 不同果啤樣品中揮發(fā)性化合物的指紋圖譜Fig.2 Volatile fingerprints of different fruit beer samples

2.4 果啤特征揮發(fā)性化合物的主成分分析

由圖2可以直觀看出不同果啤中揮發(fā)性成分差異較大，但不同品種之間的數(shù)字化表達(dá)沒能實(shí)現(xiàn)，需進(jìn)一步用化學(xué)計(jì)量方法來確定。因此，運(yùn)用數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析方法，對(duì)不同果啤樣品中的揮發(fā)性化合物進(jìn)行主成分分析和聚類分析，將不同品種果啤的特征差異明顯化，以建立更精準(zhǔn)的區(qū)分方法。前述三種果啤樣品的PCA得分圖和載荷圖見圖3。由圖3可以看出，乙醇、乙酸異戊酯、己酸乙酯、異戊醇、丁酸乙酯、苯甲醛、辛酸乙酯分布在PC1的正向軸，對(duì)PC1（67%）貢獻(xiàn)較大。乙醇、乙酸異戊酯、己酸乙酯、異戊醇、丁酸乙酯、己酸丙酯、庚酸乙酯、辛酸甲酯分布在PC2的正向軸，對(duì)PC2（31%）貢獻(xiàn)較大。蘋果果啤和蔓越莓果啤中異戊醇含量較高，菠蘿果啤中己酸乙酯含量相對(duì)較高，與圖2結(jié)果吻合。三組果啤樣品在得分圖上彼此相距都比較遠(yuǎn)，說明離散性良好，關(guān)鍵揮發(fā)性化合物得到了很好地分離。上述結(jié)果表明，采用HS-GC-IMS聯(lián)合PCA統(tǒng)計(jì)分析方法，能夠很好地辨別菠蘿、蘋果和蔓越莓果啤的香氣類型。

圖3 不同果啤樣品PCA分析的得分圖和載荷圖Fig.3 The score and loading map of PCA analysis of different fruit beer samples

3 結(jié)論

采用SH-GC-IMS技術(shù)對(duì)菠蘿、蘋果和蔓越莓三種果啤進(jìn)行揮發(fā)性化合物組成分析，獲得了不同樣品揮發(fā)性化合物指紋譜圖，通過IMS指紋圖譜的二維數(shù)據(jù)可視化技術(shù)篩選出乙醇、乙酸異戊酯、己酸乙酯、異戊醇、丁酸乙酯、苯甲醛、辛酸乙酯等35種揮發(fā)性化合物的特征離子峰，作為表征三種果啤產(chǎn)品風(fēng)味差異信息的特征變量，不同種類的果啤樣品在PCA圖中得到了較好地歸類，兩個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率達(dá)到98%，可以有效區(qū)分三種不同果啤產(chǎn)品的主要香氣。結(jié)合聚類分析可辨別出三種果啤揮發(fā)性成分之間的主要差異。不同的揮發(fā)性成分組成決定了不果啤風(fēng)味差異，以此可以區(qū)分不同種類果啤產(chǎn)品，這為果啤企業(yè)實(shí)施生產(chǎn)過程控制、產(chǎn)品溯源、品牌鑒定與保護(hù)提供了新方法。