GC-MS法比較分析不同產(chǎn)地川佛手精油成分

王春龍，羅 禹，段靈鑫，韓江云，鄒順梅，張 倩，羅金鳳，張 丹

（西南醫(yī)科大學藥學院，四川瀘州 646000）

中藥佛手為蕓香科植物佛手（Citrus medicaL.var.sarcodactylisSwingle）的干燥果實，其味辛、苦、酸，性溫，歸肝、脾、胃、肺經(jīng)，具有疏肝理氣、和胃止痛、燥濕化痰等功效[1]，主治用于肝胃氣滯、胸脅脹痛、胃脘痞滿、食少嘔吐、咳嗽痰多等癥。

在《中國藥典》（2015年版）和其他相關(guān)文獻的記載中，不同產(chǎn)地的佛手均來源于同一種植物，商品佛手因產(chǎn)地不同有川佛手、廣佛手、金佛手和建佛手之分[2]。據(jù)資料記載，以四川和廣東的佛手種植面積最大，產(chǎn)量最高[3]?！堆胖莞尽罚?739）卷之五·物產(chǎn)篇記載：雅安縣和蘆山縣產(chǎn)佛手、香櫞、柑子[4]，可見佛手在四川的栽培歷史源遠流長。四川佛手以產(chǎn)量大、質(zhì)量佳，暢銷國內(nèi)外市場，形成了佛手的道地品牌川佛手，其適宜于四川盆地邊緣山區(qū)，包括長江流域上游及岷江流域的沿岸丘陵地區(qū)，主要種植區(qū)有合江、宜賓、沐川、犍為、蘆山、雅安、滎經(jīng)、洪雅、峨眉、夾江[5]及重慶、云南等地[6]。

川佛手作為一味藥食同源的傳統(tǒng)名藥材和四川道地中藥，具有較大的經(jīng)濟價值[7]。精油是佛手中主要活性成分之一，在佛手中含量可達16 mL/kg[8]，其中的有效成分檸檬烯具有抗炎癥[9-10]、抗腫瘤[11-12]、抑菌[13-14]等作用；γ-松油烯具有抗氧化、抗真菌的作用[15-16]等。因其香味清香怡人，令人感到輕松愉悅，在國外通常被當做一種名貴的香料油，并且已經(jīng)在化妝品和食品等行業(yè)廣泛應(yīng)用[17]。

因為川佛手的種植區(qū)域廣泛，在不同地理位置和生長環(huán)境，可能藥材在成分上有所差異，導致其質(zhì)量良莠不齊[18]。目前關(guān)于川佛手的研究報道多集中于提取純化工藝及提取物的化學成分分析，為了更好地綜合比較不同產(chǎn)地川佛手精油的異同，本研究采用水蒸氣蒸餾法提取不同產(chǎn)地的川佛手精油，對其得率進行比較；采用氣質(zhì)聯(lián)用法（GC-MS）比較了不同產(chǎn)地川佛手精油的成分差異，通過面積歸一化法計算其精油中共有成分的相對質(zhì)量分數(shù)；采用相關(guān)性分析法及聚類分析法進行成分的分析和比較，旨在為后續(xù)更好地開發(fā)、利用川佛手精油提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

10 批川佛手鮮果樣品（編號：S1～S10） 分別購自四川、重慶、云南等地，均于2018～2019 年9～10月份果實成熟后進行采摘，由西南醫(yī)科大學生藥學教研室稅丕先教授鑒定為蕓香科植物佛手（Citrus medicaL.var.sarcodactylisSwingle）的新鮮果實，置于-80 ℃冰箱冷凍待用，其樣品來源信息見表1；無水硫酸鈉 分析純，成都科龍化工試劑廠；蒸餾水實驗室制備。

表1 川佛手鮮果樣品信息來源Table 1 Sample information of fresh fruit of bergamot

Christ Alpha 1-4 LSCbasic凍干機 北京博勱行儀器有限公司；Exceed-Cd-10艾柯實驗室超純水機 成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司；DB-5MS氣相毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國安捷倫科技公司；GCMS-QP2010 Plus氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 川佛手精油提取和處理方法 川佛手精油的提取采用水蒸氣蒸餾法，將新鮮川佛手果經(jīng)冷凍干燥后粉碎，過60 目篩備用。每次稱定100.00 g川佛手粉末裝入揮發(fā)油提取裝置，根據(jù)2015版《中國藥典》（四部）通則“2204揮發(fā)油測定法”中甲法進行提取。隨后將收集的精油（含少量水）進行高速離心處理，離心力3000 × g，離心時間10 min。加入適量的無水硫酸鈉進行脫水處理。按下列公式計算川佛手精油得率。

式中：X表示川佛手精油得率，%；m表示精油質(zhì)量，g；M表示川佛手生藥質(zhì)量，g。

最后將制備好的精油置于棕色密封瓶中，于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 氣相色譜-質(zhì)譜條件

1.2.2.1 GC條件 色譜柱：DB-5MS氣相毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：柱箱溫度40 ℃；進樣溫度290 ℃；進樣口溫度290 ℃，起始溫度40 ℃，保持5 min，以10 ℃/min升溫至160 ℃，保持2 min，再以5 ℃/min升溫至240 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min升溫至290 ℃，保持5 min；載氣（He）流量1.00 mL/min；進樣量1.00 μL；分流比10:1。

1.2.2.2 MS條件 質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）離子源；離子源溫度200 ℃；接口溫度220 ℃；溶劑延遲時間2.3 min；質(zhì)量掃描范圍22～600 m/z。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用GC-MS進行分析處理，通過島津氣質(zhì)聯(lián)用工作站GCMS solution工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，將所得的色譜和質(zhì)譜信息經(jīng)計算機檢索與質(zhì)譜檢索庫NIST14.L進行解析并對照CAS號，結(jié)合人工譜圖分析確定化合物。按照峰面積歸一化法計算各化學成分在川佛手揮發(fā)油中的相對百分含量。數(shù)據(jù)是利用SPSS Statistics 24.0 數(shù)據(jù)分析軟件進行相關(guān)性分析(Pearson系數(shù))和聚類分析（平方歐氏距離），文章中所有數(shù)值均以平均值±標準誤表示，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。圖表采用Excel制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 川佛手精油得率的比較

共測定10 批不同產(chǎn)地川佛手，每批平行測定3次，平均精油得率見表2。由表2可知，四川省瀘州市合江縣（S1）的精油得率最高（0.71%），四川省甘孜州瀘定縣（S3）的精油得率最低（0.22%）；四川省宜賓市長寧縣（S2）、重慶市萬州區(qū)（S5）、四川省綿陽市安州區(qū)（S6）、四川省綿陽市羅江區(qū)（S7）、重慶市梁平區(qū)（S8）的佛手精油得率均不低于0.50%，提示不同產(chǎn)地川佛手的精油含量存在較大差異。

表2 10 批川佛手鮮果樣品的精油得率（±SD，n=3）Table 2 The yield of essential oil of fresh fruit of bergamot from 10 batches (±SD, n=3)

表2 10 批川佛手鮮果樣品的精油得率（±SD，n=3）Table 2 The yield of essential oil of fresh fruit of bergamot from 10 batches (±SD, n=3)

編號 精油得率（%）S1 0.71±0.03 S2 0.66±0.02 S3 0.22±0.04 S4 0.38±0.03 S5 0.52±0.01 S6 0.60±0.02 S7 0.59±0.04 S8 0.55±0.02 S9 0.46±0.03 S10 0.38±0.02

2.2 川佛手精油成分分析

取“1.2.1”項下供試品適量，按“1.2.2”項下檢測條件進樣測定，分別得到各個產(chǎn)地川佛手精油的總離子流圖，其中圖1為四川省成都市金堂縣樣品（S9）。不同產(chǎn)地川佛手精油分離鑒別情況見表3。不同產(chǎn)地川佛手精油中共鑒別出117 個成分，其中單萜類成分22 個、倍半萜類19 個、醇類35 個、醛類 11個、酮類 7個、酯類 11個、羧酸類 5個、芳香烴 3個、酚類 3個、烷烴類 1個。按照峰面積歸一化法進行定量分析，分別求得不同產(chǎn)地川佛手精油各化學成分的相對含量結(jié)果見表4。

圖1 川佛手精油（S9）的總離子流圖Fig.1 Total ion flow diagram of bergamot essential oil（S9）

表3 不同產(chǎn)地川佛手精油成分分離鑒別情況Table 3 Isolation and identification of bergamot essential oil from different origins

由表4可知，10 個產(chǎn)地川佛手精油中鑒別出的117 種化學成分的相對分子量均在86～294之間，以C10、C12和C15化合物居多，其中相對分子量為136、152、154、204和222的同分異構(gòu)體所占比例較大，主要為單萜類、醇類、倍半萜類成分。

根據(jù)平均相對含量對10 個產(chǎn)地川佛手精油中鑒別出的117 種化學成分進行排序，其中檸檬烯（38.00%）和γ-松油烯（24.23%）占比超過了60%，二者為川佛手精油的最主要成分，其他超過2%的成分還有橙花醛（6.50%）、ρ-傘花烴（4.51%）、香葉醛（3.53%）、檸檬醛（3.18%）、α-松油醇（3.18%）、左旋-β-蒎烯（2.97%）、鄰-異丙基苯（2.71%）、(-)-4-萜品醇（2.59%）、蒎烯（2.56%）、2-異丙烯基-5-甲基己基-4-烯（2.54%）、4-萜烯醇（2.14%）、2-蒈烯（2.08%）。

10 個產(chǎn)地川佛手精油中有9 個共有成分，其平均相對含量由大到小依次為檸檬烯（38.00%）、γ-松油烯（24.23%）、α-松油醇（3.18%）、左旋-β-蒎烯（2.97%）、月桂烯（1.76%）、芳樟醇（0.78%）、α-苧烯（0.77%）、羅勒烯（0.64%）、莰烯（0.06%）；其中7 個為單萜烯類成分，2 個為醇類成分。

表4 不同產(chǎn)地川佛手精油成分相對含量（%）Table 4 Relative mass fraction of components in bergamot essential oil from different origins (%)

續(xù)表 4

續(xù)表 4

值得注意的是，有一些化學成分只在個別產(chǎn)地的樣品中有較高含量，而在其他產(chǎn)地中未檢出，比如鄰-異丙基苯在S1和S2中的含量均超過2%；ρ-傘花烴在S4、S9和S10中的含量均超過3%；2-異丙烯基-5-甲基己基-4-烯在S5和S8中的含量均超過1%；橙花醛在S6、S7和S9中的含量均超過5%；4-萜烯醇在S1、S2、S3和S5中的含量均超過1%；(-)-4-萜品醇在S4、S6、S7、S8和S9中的含量均超過1%；(R)-(+)-β-香茅醇在S5中的含量為1.81%，提示該成分可能和檢出的產(chǎn)地有一定關(guān)系。

2.3 相關(guān)性分析

對10 個不同產(chǎn)地川佛手精油的含量測定結(jié)果進行相關(guān)性分析，以表4中9 個共有成分的相對含量為數(shù)據(jù)，組建數(shù)據(jù)矩陣，其Pearson相關(guān)系數(shù)如表5所示。從表5中可知，川佛手精油中α-苧烯與左旋-β-蒎烯呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01)；（+）-檸檬烯與芳樟醇呈極顯著負相關(guān)（P＜0.01)；α-苧烯與羅勒烯、月桂烯，莰烯與左旋-β-蒎烯、芳樟醇，α-松油醇與芳樟醇呈顯著正相關(guān)（P＜0.05)；（+）-檸檬烯與α-松油醇，γ-松油烯與月桂烯、芳樟醇呈顯著負相關(guān)（P＜0.05)。

表5 共有成分相關(guān)性分析結(jié)果Table 5 The results of correlation analysis of common components

2.4 聚類分析

對不同產(chǎn)地川佛手精油的含量測定結(jié)果進行系統(tǒng)聚類，以表4中鑒別出的所有成分百分含量為聚類的變量，采用平方歐氏距離(squared Euclidean distance)獲得聚類分析譜系圖，結(jié)果見圖2。由圖2可知，10 個不同產(chǎn)地的川佛手可聚為4 類：S1、S2聚為一類，S6、S7、S9聚為一類，S3、S4、S5、S8聚為一類，S10為一類。

圖2 不同產(chǎn)地川佛手聚類分析譜系圖Fig.2 Pedigree of cluster analysis of bergamot from different origins

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，10 個不同產(chǎn)地川佛手精油樣品中四川省瀘州市合江縣樣品精油得率最高（0.71%），其次為四川省宜賓市長寧縣（0.66%）及四川省綿陽市安州區(qū)（0.60%）樣品；其化學成分相對含量均以(+)-檸檬烯和γ-松油烯較高，其中以四川省瀘州市合江縣樣品中檸檬烯（48.46%）和γ-松油烯（35.39%）的相對含量最高。這一結(jié)論與文獻[19-21]報道的新鮮佛手果油的主要成分是檸檬烯和γ-松油烯一致。但同時也出現(xiàn)與其他研究不一致的情況，如趙永艷等[22]研究發(fā)現(xiàn)全國范圍10 個不同產(chǎn)地佛手揮發(fā)油中的主要化學成分為檸檬烯和萜品烯；黃曉鈺等[23]研究發(fā)現(xiàn)佛手柑果（廣東德慶）外果皮揮發(fā)油成分以苧烯和萜品油烯為主；鄭孝華等[24]研究發(fā)現(xiàn)新鮮佛手果油（浙江金華）的主要成分為α-蒎烯和γ-松油烯。推測造成各研究間差異的原因可能與佛手品種、不同的采集時間、精油保存時間和色譜條件等有關(guān)，但仍有待后續(xù)研究進一步探討。

相關(guān)性分析（correlation analysis）是指對兩個或多個具備相關(guān)性的變量元素進行分析，旨在研究2個變量之間的變化趨勢[25]，從而衡量2個變量因素的相關(guān)密切程度，本研究對10 個不同產(chǎn)地川佛手精油中的9 個共有成分進行了相關(guān)性分析，由相關(guān)性分析結(jié)果可知，左旋-β-蒎烯與α-苧烯呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01)，α-苧烯與羅勒烯、月桂烯；莰烯、α-松油醇與芳樟醇之間顯著正相關(guān)（P＜0.05)，這些化學成分間相關(guān)性較強，表明此類化學成分可能在川佛手生長過程中存在內(nèi)在的相關(guān)關(guān)系。

聚類分析作為一種把相似的樣品或變量歸類的有效方法，在很大程度上可避免分類過程中夾雜的主觀因素，客觀準確地反映研究對象，并從中發(fā)現(xiàn)內(nèi)在的客觀規(guī)律，具有科學性、客觀性[26]。本文以鑒別出的117 種化學成分的相對含量為指標對10 個不同產(chǎn)地的川佛手精油樣品進行聚類分析，聚類分析結(jié)果將不同產(chǎn)地分為4 類: S1（四川省瀘州市合江縣）、S2（四川省宜賓市長寧縣）歸為一類，該類特征為(+)-檸檬烯、γ-松油烯和鄰-異丙基苯相對含量較高；S6（四川省綿陽市安州區(qū)）、S7（四川省綿陽市羅江區(qū)）、S9（四川省成都市金堂縣）歸為一類，該類特征為橙花醛相對含量較高；S3（四川省甘孜州瀘定縣）、S4（四川省雅安市滎經(jīng)縣）、S5（重慶市萬州區(qū)）、S8（重慶市梁平區(qū)）歸為一類，該類特征為香葉醇和芳樟醇相對含量較高；S10（云南省昆明市宜良縣）單獨歸為一類，該類特征為檸檬醛相對含量較高。把聚類分析結(jié)果結(jié)合10 個川佛手揮發(fā)油產(chǎn)地所處的地理位置信息，由北到南依次為第一類（S6、S7、S9）、第二類（S3、S4、S5、S8）、第三類（S1、S2）、第四類（S10），平均緯度分別為31°24’、30°29’、28°70’、24°92’，因此推測川佛手精油的聚類結(jié)果與樣品產(chǎn)地所處緯度有一定關(guān)系，接下來應(yīng)該對不同產(chǎn)地多個批次的川佛手揮發(fā)油進行分析，進一步探討是否存在這種趨勢。

綜上所述，本次研究采用GC-MS對不同產(chǎn)地的川佛手精油進行分析比較，對日后整個西南地區(qū)川佛手植物資源的種植開發(fā)和利用提供新的參考，而且對于提升川佛手的附加值，將佛手柑加工而成的高品質(zhì)佛手精油深加工并實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，具有非常重要的意義。