響應(yīng)面法優(yōu)化黑胡蘿卜紅色素雙水相萃取工藝

李治城，武玉倩，張婕妤，展亞莉，常秀蓮,

（1.煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺(tái) 264005；2.青島鵬遠(yuǎn)康華天然產(chǎn)物有限公司，山東萊西 266612）

黑胡蘿卜（Daucus carotaL.），十字花科蘿卜屬，起源于土耳其、埃及和遠(yuǎn)東國(guó)家[1]，近些年來(lái)在我國(guó)開(kāi)始種植，但由于種植面積較小，產(chǎn)量較低，并未在市面上廣泛流通。黑胡蘿卜根部呈紫黑色，其中的花青素是自然界中廣泛存在于植物中的天然水溶性色素，也是植物當(dāng)中主要的呈色物質(zhì)之一[2]，同時(shí)也具有多種生理活性，例如清除自由基、抗氧化、抗癌等[3-5]。黑胡蘿卜花青素作為一種新型的天然水溶性植物色素，因其含有?；幕鶊F(tuán)，在弱酸性和中性條件下能夠表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性[6]。隨著消費(fèi)者對(duì)食品安全的關(guān)注度不斷提高，天然植物提取的色素更易受到人們的青睞，因此，將黑胡蘿卜紅色素作為傳統(tǒng)合成色素的替代品添加到食品當(dāng)中具有十分廣闊的市場(chǎng)前景[7-8]。

目前花青素的提取方法主要有溶劑提取法、超聲波輔助提取法、超臨界流體萃取等[9-10]方式，但存在提取液雜質(zhì)過(guò)多、耗能較大，無(wú)法實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的問(wèn)題。大孔吸附樹(shù)脂廣泛應(yīng)用于花青素的分離、純化[11-12]，可以實(shí)現(xiàn)色素與其糖類(lèi)物質(zhì)的分離，但生產(chǎn)周期較長(zhǎng),色素的穩(wěn)定性差，容易導(dǎo)致色素產(chǎn)品的損失。雙水相萃取作為一種新型、快速、低成本的操作方式，能夠較好地保留目標(biāo)產(chǎn)物的生物活性，且選擇性強(qiáng)，易于工業(yè)放大[13-14]，廣泛應(yīng)用于花青素的提取分離[15-16]。翟碩等[17]通過(guò)比較研究得出采用雙水相萃取的方法提取黑豆皮花青素的效果最好，得率最高為2.81 mg/g；Liu等[18]利用響應(yīng)面法優(yōu)化雙水相體系對(duì)紫甘薯花青素進(jìn)行萃取，在最佳條件下花青素的得率可以達(dá)到90.02%。

本文以黑胡蘿卜作為研究對(duì)象，使用PEG6000/硫酸銨雙水相體系來(lái)實(shí)現(xiàn)黑胡蘿卜紅色素與糖類(lèi)物質(zhì)分離。根據(jù)先前的研究[19-20]優(yōu)化對(duì)雙水相萃取效果影響較大的三個(gè)因素（硫酸銨、PEG6000和粗提液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)），并通過(guò)響應(yīng)面分析法優(yōu)化萃取工藝，為工業(yè)上快速提取黑胡蘿卜紅色素提供了參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

黑胡蘿卜 青島鵬遠(yuǎn)康華天然產(chǎn)物有限公司；D-無(wú)水葡萄糖、硫酸銨（分析純） 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；硫酸、L（+）-抗壞血酸（分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；苯酚（優(yōu)級(jí)純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；PEG6000（分析純） 無(wú)錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司；鹽酸（分析純） 萊陽(yáng)經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠(chǎng)；DPPH（1.1-二苯基-2-苦肼基自由基）（分析純） 如吉生物科技。

pH211酸度計(jì) 意大利哈納公司；JYZ-V5PLUS榨汁機(jī) 杭州九陽(yáng)小家電有限公司；GT10-2高速臺(tái)式離心機(jī) 北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司；XW-80A漩渦混合器 海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司；752S紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司；AR1530分析天平 奧豪斯國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黑胡蘿卜色素粗提液制備 取1000.0 g黑胡蘿卜洗凈、切碎，使用榨汁機(jī)榨取原汁，260目濾布過(guò)濾，3000 r/min離心30 min，取上層色素溶液使用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至3.0，于2～4 ℃冷藏保存。

1.2.2 構(gòu)建雙水相體系 固定體系質(zhì)量為30.0 g，在50 mL離心管中分別加入一定質(zhì)量的硫酸銨和400 g/L的PEG6000原液，加入一定質(zhì)量的pH為3.0的色素粗提液，加入去離子水補(bǔ)至體系質(zhì)量為30.0 g，置于漩渦混合器上于室溫下混合25 min后取下，置于離心機(jī)中，4000 r/min離心10 min后取出，靜置至上下相體積不再發(fā)生變化。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 分別考察硫酸銨、PEG6000和色素粗提液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)選擇性系數(shù)和萃取率的影響，具體方法如下：

固定體系質(zhì)量為30.0 g，在離心管中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18.0%的PEG6000原液，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18.0%的色素粗提液，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16.0%、18.0%、20.0%、22.0%、24.0%的硫酸銨，剩余的質(zhì)量由去離子水補(bǔ)充，考察不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的硫酸銨對(duì)選擇性系數(shù)β和萃取率Y的影響。

固定硫酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為上述實(shí)驗(yàn)優(yōu)化值，其它條件不變，分別加入質(zhì)量分為10.0%、12.0%、14.0%、16.0%、18.0%的PEG6000原液，考察不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEG6000對(duì)選擇性系數(shù)β和萃取率Y的影響。

固定硫酸銨、PEG6000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為上述實(shí)驗(yàn)優(yōu)化值，其它條件不變，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.0%、10.0%、12.0%、14.0%、16.0%的色素粗提液，考察不同色素粗提液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)選擇性系數(shù)β和萃取率Y的影響。

1.2.4 響應(yīng)面分析法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取誤差相對(duì)較小的萃取率Y為響應(yīng)值，選擇硫酸銨、PEG6000以及粗提液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為實(shí)驗(yàn)因素組成三因素三水平Box-Behnken試驗(yàn)，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Design of response surface experiment

1.2.5 黑胡蘿卜紅色素抗氧化性評(píng)價(jià) 以VC作為陽(yáng)性對(duì)照，分別對(duì)萃取前后的黑胡蘿卜紅色素進(jìn)行DPPH自由基清除能力實(shí)驗(yàn)[21-22]。取1.0 mL不同濃度的樣品溶液，加入0.4 mmol/L DPPH乙醇溶液0.50 mL，加水2.0 mL，混勻后暗處反應(yīng)30 min，于517 nm處測(cè)定其吸光度值。根據(jù)公式（1）計(jì)算DPPH自由基的清除率。

式中：A0：空白對(duì)照的吸光度值；A1：加入樣品反應(yīng)后的吸光度值；A2：樣品自身干擾的吸光度值。

1.2.6 總花色苷含量及總糖含量測(cè)定 黑胡蘿卜紅色素屬于花色苷類(lèi)化合物，采用示差法按公式（2）對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定[23]，以矢車(chē)菊-3-葡萄糖苷計(jì)。

式中：吸光度A = (A520- A700)pH1.0- (A520-A700)pH4.5；M：矢車(chē)菊-3-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量，449.2 g/mol；D：樣品儲(chǔ)備液的稀釋倍數(shù)；1：光路長(zhǎng)，cm，測(cè)試中采用1 cm光路長(zhǎng)的比色皿；ε：26900，矢車(chē)菊-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)，L·mol-1·cm-1；1000：由g換算成mg的轉(zhuǎn)換系數(shù)。

采用苯酚-硫酸法對(duì)上下相中總糖含量進(jìn)行測(cè)定[24]。分別精密吸取上下相樣品稀釋液1.0 mL于試管中，加入5%的苯酚溶液1.0 mL，迅速加入濃硫酸溶液5.0 mL，搖勻，放置10 min后于40.0 ℃水浴加熱10 min[25]，取出后冷卻至室溫，以相應(yīng)試劑為空白，在490 nm處測(cè)定吸光度，得到回歸方程為：y=8.5971x+0.0165，R2=0.9989，表明在0.00～0.10 mg/mL范圍內(nèi)，葡萄糖濃度與其吸光度呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系。

1.2.7 選擇性系數(shù)β及萃取率Y的計(jì)算 用注射器分別移取上下相溶液于試管中，讀取上下相溶液體積，并根據(jù)示差法和苯酚硫酸法分別對(duì)上下相中花青素的含量和總糖含量進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)公式（3）、（4）和（5）分別計(jì)算相比R、選擇性系數(shù)β和萃取率Y[26]。

式中：Vt、Vb：分別為上、下相的體積，mL；K花、K糖：分別為花青素、糖類(lèi)物質(zhì)的分配系數(shù)；C上花、C下花：分別為上相、下相中花青素的濃度，mg/L；C上糖、C下糖：分別為上相、下相中糖類(lèi)物質(zhì)的濃度，mg/mL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert V 8.0.6.1和Origin Pro 8.0進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 硫酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)選擇性系數(shù)和萃取率的影響 由圖1可知，隨著硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，選擇性系數(shù)β和萃取率Y先升高后降低，但選擇性系數(shù)升高較快而后緩慢下降，萃取率升高較緩后快速下降。在硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.0%時(shí)兩者達(dá)到最高值，分別為283.57和90.3%。這可能因?yàn)殡S著硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，下相水合能力逐漸增強(qiáng)，加強(qiáng)了上下兩相物質(zhì)的分離效果，提高了上相中花青素的濃度[27]，但硫酸銨的過(guò)量加入會(huì)存在于上相中，不利于色素的萃取[28]。因此，硫酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)選擇為20%。

圖1 硫酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)選擇性系數(shù)和萃取率的影響Fig.1 Effect of mass fraction of ammonium sulfate on selectivity coefficient and extraction rate

圖2 PEG6000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)選擇性系數(shù)和萃取率的影響Fig.2 Effect of mass fraction of PEG6000 on selectivity coefficient and extraction rate

2.1.2 PEG6000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)選擇性系數(shù)和萃取率的影響 由圖2可知，隨著PEG6000質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，選擇性系數(shù)β和萃取率Y大體呈現(xiàn)出相同的上升和下降的趨勢(shì)，并在PEG6000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14.0%時(shí)兩者達(dá)到最高值，分別為318.28和91.2%。在黑胡蘿卜粗提液質(zhì)量一定的情況下，PEG6000質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高可以增加對(duì)黑胡蘿卜花青素的萃取效果。但隨著PEG6000的繼續(xù)加入使得整個(gè)體系黏度增加傳質(zhì)受阻[29]，不利于花青素在上相中的分配，使β值出現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，PEG6000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)選擇為14%。

2.1.3 粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)選擇性系數(shù)和萃取率的影響圖3可知，在粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)在8.0%～12.0%范圍內(nèi)，隨著粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增高，選擇性系數(shù)β也逐漸增加，而萃取率Y趨于平緩，在粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.0%時(shí)選擇性系數(shù)和萃取率分別達(dá)到最大值269.01和90.8%。隨著粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的繼續(xù)增高，上相PEG對(duì)花青素的萃取能力趨近飽和，下相當(dāng)中花青素的含量開(kāi)始上升，選擇性系數(shù)和萃取率均呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)。因此，粗提液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)選擇為12%。

圖3 粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)選擇性系數(shù)和萃取率的影響Fig.3 Effect of mass fraction of crude extract on selectivity coefficient and extraction rate

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果分析 Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)雙水相萃取黑胡蘿卜紅色素中的硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、PEG6000質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及粗提液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)優(yōu)化的結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of response surface experiment

采用Design-Expert V8.0對(duì)黑胡蘿卜紅色素的萃取得率Y進(jìn)行數(shù)據(jù)分析得到各因素的回歸擬合方程如下：

為證明此方程的有效性，對(duì)上述模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。由表3可知，模型中的A2和C2對(duì)黑胡蘿卜紅色素萃取率的影響極顯著（P＜0.01），A和B2對(duì)黑胡蘿卜紅色素萃取率的影響顯著（P＜0.05），而硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、PEG6000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及粗提液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間的兩兩交互作用的影響并不顯著（P＞0.05）?；貧w模型屬于極顯著水平（P=0.0009＜0.01）；失擬項(xiàng)差異不顯著（P= 0.9371＞0.05）；模型決定系數(shù)R2為0.9496，證明所選的二次回歸模型是合理的，且所選模型的擬合程度較好，可以對(duì)雙水相萃取黑胡蘿卜紅色素的結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。根據(jù)回歸方程和方差分析可知，各因素對(duì)黑胡蘿卜紅色素萃取率的影響程度由大到小依次為A＞C＞B，即硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞PEG6000質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 3 Results of analysis of variance of response surface experiment

硫酸銨、PEG6000、粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間相互作用的響應(yīng)面曲線(xiàn)如圖4所示。由圖（a）和圖（b）可以看出，響應(yīng)面呈現(xiàn)一定程度的凸起，響應(yīng)面圖中硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)曲線(xiàn)較陡，說(shuō)明A（硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)）對(duì)萃取率Y的影響較大；A（硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)）和B（PEG6000質(zhì)量分?jǐn)?shù)），B（PEG6000質(zhì)量分?jǐn)?shù)）和C（粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的交互作用不顯著；由圖（c）可以看出B（PEG6000質(zhì)量分?jǐn)?shù)）和C（粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)）之間的交互作用不顯著，但從曲線(xiàn)的陡峭程度可以看出，粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)萃取率的影響程度要高于PEG6000質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.2.2 最佳工藝條件的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)響應(yīng)面模型預(yù)測(cè)雙水相萃取黑胡蘿卜紅色素的實(shí)驗(yàn)條件為：硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.21%、PEG6000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13.89%、粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11.83%，理論黑胡蘿卜紅色素萃取率為94.38%。根據(jù)實(shí)驗(yàn)實(shí)際操作，將最佳工藝條件調(diào)整為：硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.0%、PEG6000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14.0%、粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.0%，在此工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，做重復(fù)試驗(yàn)3次，黑胡蘿卜紅色素的平均萃取率為94.17%，與模型預(yù)測(cè)值基本符合，表明所選模型合理，能夠模擬和預(yù)測(cè)該雙水相體系對(duì)黑胡蘿卜紅色素的萃取效果。

圖4 各因素相互作用響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface plot of the interaction between various factors

2.3 黑胡蘿卜紅色素抗氧化性評(píng)價(jià)DPPH自由基清除能力實(shí)驗(yàn)

由圖5可知，隨著樣品質(zhì)量濃度的提高，萃取前后的黑胡蘿卜紅色素對(duì)DPPH自由基的清除能力也逐漸提升，且VC在質(zhì)量濃度達(dá)到20.0 mg/L后出現(xiàn)平臺(tái)期，對(duì)DPPH自由基的清除率均在95%以上。IC50值可以用來(lái)反映樣品的抗氧化性，且數(shù)值越小，樣品抗氧化的能力越強(qiáng)[30]。經(jīng)計(jì)算，VC和萃取前、后黑胡蘿卜紅色素的IC50值分別為8.09、26.32、30.51 mg/L，可以看出萃取前、后的黑胡蘿卜紅色素均具有較好的抗氧化性，但都弱于VC。萃取后仍然保留了黑胡蘿卜紅色素的抗氧化能力，但有所下降，這可能是雙水相萃取將糖類(lèi)物質(zhì)萃取到下相造成的。

圖5 黑胡蘿卜紅色素和VC的DPPH自由基清除能力Fig.5 DPPH free radical scavenging ability of black carrot red color and VC

3 結(jié)論

研究了PEG6000/硫酸銨雙水相體系萃取黑胡蘿卜紅色素的工藝條件，最佳工藝條件如下：硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.0%，PEG6000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14.0%，粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)12.0%，黑胡蘿卜花青素的平均萃取率為94.17%。對(duì)采用本方法得到的黑胡蘿卜紅色素進(jìn)行抗氧化性實(shí)驗(yàn)，計(jì)算得到IC50值為30.51 mg/L，仍保留了其較好的清除DPPH自由基的效果。本研究為黑胡蘿卜紅色素的提取方法提供了參考，能夠?qū)崿F(xiàn)黑胡蘿卜紅色素與其糖類(lèi)物質(zhì)的有效分離，但對(duì)于實(shí)現(xiàn)企業(yè)生產(chǎn)而言，如何實(shí)現(xiàn)聚合物與花青素的分離，仍然需要進(jìn)一步的研究。