基于微觀結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析影響豬肉持水性的差異蛋白

楊波若，李華健，蘇婭寧，李 霞，瞿 靜，陳 韜

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201）

蛋白質(zhì)組學(xué)是通過(guò)將基因表達(dá)的信息翻譯為蛋白質(zhì)，進(jìn)而研究蛋白質(zhì)的一門(mén)學(xué)科[1]。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)可以對(duì)肉類在蛋白質(zhì)水平進(jìn)行定性、定量分析[2]。目前，被廣泛用于肉及其制品研究的定量蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定技術(shù)主要有無(wú)標(biāo)記定量（Label-free）測(cè)定技術(shù)和標(biāo)記（Stable isotope labeling）定量測(cè)定技術(shù)[3-4]。無(wú)標(biāo)記測(cè)定蛋白組學(xué)技術(shù)，具有通量大、線性范圍廣和檢測(cè)價(jià)格低等優(yōu)勢(shì)，但對(duì)前期樣品制備和質(zhì)譜穩(wěn)定性要求較高，在檢測(cè)豐富度較低的蛋白時(shí)靈敏度低[5]。標(biāo)記定量技術(shù)主要包括多肽體外標(biāo)記技術(shù)（Tandem Mass Tag, TMT）和標(biāo)記相對(duì)定量技術(shù)（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）。標(biāo)記定量技術(shù)在檢測(cè)中靈敏度高，但在樣品復(fù)雜的情況下，母離子共篩選和共碎裂會(huì)對(duì)其結(jié)果產(chǎn)生干擾[6]。

持水性（Water-holding capacity, WHC）是指宰后肌肉對(duì)其內(nèi)部水分束縛的能力，常用汁液流失率（drip loss）的高低來(lái)衡量。研究發(fā)現(xiàn)，汁液流失率的高低受宰后溫度、pH下降速率、細(xì)胞骨架蛋白降解程度、氧化應(yīng)激反應(yīng)程度和肌細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)的變化等因素影響[7-8]。目前有研究發(fā)現(xiàn)，宰后汁液流失現(xiàn)象與蛋白質(zhì)變化有密切的聯(lián)系[9-10]。已有研究人員利用蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定技術(shù)對(duì)宰后牛肉、鵝肉、雞肉和豬肉進(jìn)行持水性的研究，其中，Luca等[11]通過(guò)SDSPAGE和質(zhì)譜分析對(duì)貯藏期的豬肉滲出液進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定，發(fā)現(xiàn)高汁液流失組滲出液中Hsp70表達(dá)量顯著高于低汁液滲出組；Gap-Don等[12]通過(guò)液相二級(jí)質(zhì)譜對(duì)宰后豬最長(zhǎng)肌的不同部位進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)各段磷酸甘油變位酶的表達(dá)量不同可能導(dǎo)致不同段豬最長(zhǎng)肌的持水性不同。國(guó)內(nèi)外學(xué)者在研究宰后蛋白質(zhì)組變化對(duì)肉品質(zhì)的影響時(shí)多采用無(wú)標(biāo)記蛋白組學(xué)和iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行分析，然而有研究表明iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定技術(shù)比TMT多肽體外標(biāo)記技術(shù)靈敏度低，噪音信號(hào)干擾較大[13]。

本實(shí)驗(yàn)采用TMT多肽體外標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，結(jié)合UniProt蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)宰后初期不同持水能力的豬背最長(zhǎng)肌樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)組比較，找到兩組間存有差異的蛋白，探討兩組豬肉持水能力不同的原因，為提高肉的持水能力提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

三元雜交豬 在曲靖市東恒經(jīng)貿(mào)集團(tuán)食品有限公司屠宰場(chǎng)選擇品種和飼養(yǎng)條件相同、體重相近（105±5 kg）的三元雜交豬（大河烏豬 × 約克夏 × 長(zhǎng)白豬）作為樣品；蛋白酶抑制劑 Calbiochem公司；胰蛋白酶 Promega公司；碘代乙酰胺（分析純）、二硫蘇糖醇（分析純）、尿素（分析純）、三乙基碳酸氫銨（TEAB）（分析純）、三氟乙酸（分析純） 美國(guó)Sigma公司；BCA試劑盒 碧云天公司；TMT標(biāo)記試劑盒、預(yù)染標(biāo)記物 Thermo Fisher Scientific公司；二甲苯（分析純） 中國(guó)上海試劑廠；檸檬酸（分析純） 湖北津樂(lè)達(dá)化工有限公司；醋酸鈾（分析純）

北京中科光析化工技術(shù)研究所。

Bio Rad通用迷你垂直電泳細(xì)胞電泳槽、電泳儀電源、IMARK酶標(biāo)儀 伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)有限公司；JY92-ⅡN高強(qiáng)度超聲處理、Velocity 18R離心機(jī)英國(guó)Dynamica Scientific Ltd.公司；HI9025C便攜式pH計(jì) 意大利哈納；1000納米高效液相色譜、164568液相柱、Q-Exactive質(zhì)譜儀 Thermo Fisher Scientific公司；JEM-1011透射電子顯微鏡 日本電子株式會(huì)社（JEOL）；Agilent 1260高pH反向液相色譜 美國(guó)安捷倫科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 依照生豬屠宰操作規(guī)程（GB /T17236-2008）進(jìn)行屠宰，宰后進(jìn)行四分體分割。依據(jù)Warner等[14]和Florowski等[15]的標(biāo)準(zhǔn)，選取10條蒼白發(fā)軟表面有汁液滲出的肉（pale, soft exudative，PSE）樣品：L*＞50， 汁液流失率≥5%，pH45min≤5.8, pH24h≤5.5；;10條正常肉（Reddish-pink,firm, nonexudative，RFN）樣品：L*=42～50, 汁液流失率＜5%， pH45min＞5.8， pH24h=5.6～6.0。樣品為左側(cè)背最長(zhǎng)肌第七腰椎段至最后腰椎段肌肉。樣品用保鮮膜包裹，放在4 ℃的條件，在不同時(shí)間點(diǎn)取樣用于基本指標(biāo)測(cè)定、蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)和電鏡拍攝。測(cè)定汁液流失率后，挑選汁液流失率最高的3個(gè)樣品（汁液流失率分別為：5.66%、5.78%和6.36%）和汁液流失率最低的3個(gè)樣品（汁液流失率分別為：0.57%、0.81%和1.06%）用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析和其他指標(biāo)測(cè)定。

1.2.2 檢測(cè)指標(biāo)及其測(cè)定方法

1.2.2.1 基本肉質(zhì)指標(biāo)測(cè)定 在4 ℃的冷藏環(huán)境中，將矯正好的便攜式pH計(jì)的pH探頭和溫度探頭插入待檢測(cè)豬背最長(zhǎng)肌樣品內(nèi)部3 cm處，測(cè)定宰后9、24 h時(shí)樣品背最長(zhǎng)肌的溫度和pH。

參照Honikel等[16]的方法測(cè)定汁液流失，具體如下：將之前準(zhǔn)備好的樣品切成2.5 cm的肉片，用精度為萬(wàn)分之一的天平稱重，記做W1，稱重后用細(xì)鐵絲穿過(guò)肉片進(jìn)行固定，使肌纖維始終保持垂直向下，放置在清潔干燥的聚乙烯薄膜袋中（肉片與袋壁要保持距離，不能接觸袋壁），扎緊袋口后吊掛于4 ℃冷庫(kù)中，24 h后取出肉片再次稱重，記做W2，依據(jù)公式計(jì)算汁液流失率。

稱取25 g樣品，剔除外表脂肪和筋膜，剁成鮮肉肉糜，取10 g肉糜放在105 ℃的恒溫干燥箱中干燥至恒重，將肉糜用濾紙包裹好放入萃取套管中，啟動(dòng)通風(fēng)櫥。將160 mL石油醚加入萃取杯中沒(méi)過(guò)濾紙包，萃取循環(huán)設(shè)置在10 次/h，連續(xù)萃取6 h，取出抽提杯（包括濾紙包）并放置于硅膠干燥器中過(guò)夜，第二日將抽提杯放入真空干燥箱內(nèi)（80 ℃，13 kPa）干燥1.5 h后取出稱重記做B1，依據(jù)公式計(jì)算肌間脂肪含量。

1.2.2.2 肌肉微觀結(jié)構(gòu)觀察 參照Luo等[17]的方法，將樣品置入3.5%戊二醛試劑（pH 7.2）中進(jìn)行2 h的前期固定，用0.1 mol/L磷酸緩沖液沖洗樣品表面殘留的前期固液，沖洗完成后，用2%的鋨酸進(jìn)行1.5 h的后期固定。兩次固定完成后，將樣品取出放入乙醇溶液中脫水，脫水完成后從乙醇溶液中移至室溫下的丙酮溶液中，用Epon-618滲透包埋并切片。用檸檬酸鉛-醋酸鈾對(duì)切片進(jìn)行染色，在4000倍的電子顯微鏡下得到細(xì)胞內(nèi)外間隙圖片。對(duì)每個(gè)樣品的9和24 h分別進(jìn)行8～10張數(shù)字照片的拍攝，用Image-Pro Plus 5.1（Image House, Denmark）軟件測(cè)量肌細(xì)胞膜與細(xì)胞體之間的平均寬度（細(xì)胞內(nèi)間隙）和肌細(xì)胞之間的平均寬度（細(xì)胞外間隙）。

1.2.3 TMT定量蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)

1.2.3.1 蛋白質(zhì)提取 稱取0.8 g組織樣品放置于提前用液氮預(yù)冷的研缽中，添加液氮充分研磨至粉末狀，加入1%的蛋白酶抑制劑裂解緩沖液，在高強(qiáng)度超聲處理機(jī)中進(jìn)行超聲裂解后，放入離心機(jī)，調(diào)至4 ℃，12000×g離心10 min，去除細(xì)胞膜等碎片，將上清液吸取至干凈的離心管內(nèi)，利用BCA試劑盒在IMARK酶標(biāo)儀中對(duì)蛋白濃度測(cè)定。

1.2.3.2 高速液相色譜分級(jí) 使用色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）對(duì)酶解后肽段進(jìn)行多肽體外標(biāo)記（Tandem mass tag，TMT），用pH反向高速液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）分級(jí)，具體操作如下：肽段用pH=9、分級(jí)梯度為8%（8 min）、16%（35 min）、32%（25 min）的乙腈，流速均為1.0 mL/min，分離出60組分后將分離的肽段以9組分合并，合并完成后再次進(jìn)行真空冷凍干燥處理以便后續(xù)操作。

1.2.3.3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析 使用液相色譜流動(dòng)相A相溶解肽段后用超高效液相系統(tǒng)將肽段分離。流動(dòng)相A、B均為甲酸乙腈混合而成的水溶液，流動(dòng)相A[0.1（v/v）甲酸、0.2（v/v）乙腈]；流動(dòng)相B（0.1%甲酸、90%乙腈）。對(duì)液相進(jìn)行梯度設(shè)置：0～38 min，6%～22% B；38～52 min，22%～32% B；52 ～56 min，32%～80% B；56～60 min，80% B, 維持流速75 nL/s。通過(guò)數(shù)據(jù)依賴型掃描（DDA）程序?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行采集匯總，將一級(jí)掃描中信號(hào)強(qiáng)度前20%的肽段用28%的能量碎裂，后用二級(jí)質(zhì)譜逐個(gè)進(jìn)行分析。

1.2.3.4 蛋白質(zhì)鑒定 使用UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)中Sus_scrofa_9823_PR_20190816庫(kù)作為搜索數(shù)據(jù)庫(kù)，利用Proteome Discoverer 2.2軟件對(duì)檢索數(shù)據(jù)過(guò)濾：認(rèn)為可信度99%以上的肽段為可信肽段PSMs（peptide spectrum matches），含有單個(gè)肽段（特有肽段）的蛋白為可信蛋白，只保留可信的肽段和可信蛋白，使用FDR對(duì)其驗(yàn)證，舍棄FDR大于1%的肽段和蛋白。對(duì)鑒定到的蛋白進(jìn)行GO蛋白注釋。

1.2.3.5 差異蛋白的確定 根據(jù)譜圖峰面積可得每個(gè)樣品中各個(gè)可信肽段的相對(duì)定量值，將鑒定出的特有肽段中所包含所有肽段匹配定量信息校正后，得到特有肽段的相對(duì)定量值，最后將通過(guò)特有肽段在蛋白質(zhì)中的含量對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行相對(duì)定量。將高汁液組和低汁液組中多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到的質(zhì)譜峰面積的均值之比作為差異倍數(shù)（Fold Change，F(xiàn)C），對(duì)FC≥1.2倍的蛋白的質(zhì)譜峰面積值進(jìn)行t-檢驗(yàn)，P值作為顯著性指標(biāo)，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)計(jì)算P值，以P≤0.05為閾值，將FC≥1.2倍，且P≤ 0.05的蛋白定義為高汁液流失組和低汁液流失組中表達(dá)量存在顯著差異的蛋白，最后針對(duì)篩選出來(lái)的差異蛋白進(jìn)行GO功能富集分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0（SPSS程序，SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）進(jìn)行平均值、標(biāo)準(zhǔn)誤差、聚類分析和相關(guān)性分析。使用image J測(cè)量軟件對(duì)現(xiàn)有電鏡圖片進(jìn)行細(xì)胞間距的測(cè)量。使用Inter Pro Scan v.5.14-53.0對(duì)差異蛋白進(jìn)行GO注釋，R package networkD3 v.0.4繪制差異蛋白互作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉樣基本指標(biāo)測(cè)定及微觀結(jié)構(gòu)觀察

從采集到的樣品中挑取汁液流失率最低的三個(gè)樣品和汁液流失率最高的三個(gè)樣品（每個(gè)樣品重復(fù)5次），分為兩組，即高汁液流失組（High Drip Loss Group，H組，n=3）和低汁液流失組（Low Drip Loss Group, L組, n=3）。將兩組樣品存放在4 ℃環(huán)境下，于9 和24 h后分別測(cè)量?jī)山M樣品的pH、溫度、肌細(xì)胞內(nèi)間隙（Intracellular space）、肌細(xì)胞外間隙（Extracellular space）和肌間脂肪（instramusclar fat,IFM）含量（見(jiàn)表1）。

表1 宰后存放在4 ℃下9 和24 h的H組與L組的樣品的肉質(zhì)指標(biāo)Table 1 Meat quality indicators of samples in the H-group and L-group after slaughter at 4 ℃ for 9 and 24 h

如表1所示，H組汁液流失率極顯著高于L組（P＜0.01）。宰后9 h時(shí)，H組pH顯著低于L組（P＜0.05），24 h時(shí)H組溫度極顯著高于L組（P＜0.01）。宰后溫度和pH的變化是由糖原代謝引發(fā)的，肌肉的pH下降主要是由肌糖原無(wú)氧糖酵解產(chǎn)生乳酸以及ATP分解產(chǎn)生的磷酸根離子造成的[18]。pH的下降加速了肌動(dòng)球蛋白形成和肌肉收縮，從而加速汁液流出。

在電子顯微鏡下，觀察到H組和L組樣品的肌細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)如圖1所示。宰后9 h的L組中（如圖1A），肌原纖維的排布有序且緊湊，肌細(xì)胞膜緊密地貼合在肌細(xì)胞周邊，肌細(xì)胞與肌細(xì)胞間幾乎沒(méi)有縫隙，而H組中（見(jiàn)圖1C），肌原纖維排布松散，部分肌細(xì)胞膜脫離肌細(xì)胞，肌細(xì)胞間的間隙大于9 h的L的組。在宰后24 h的L組中（見(jiàn)圖1B），大面積細(xì)胞膜脫離肌細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)間隙和細(xì)胞外間隙對(duì)比9 h均增大。而H組中（見(jiàn)圖1D），肌細(xì)胞膜與肌細(xì)胞間的間隙增大，與24 h時(shí)L組相比，肌細(xì)胞之間呈現(xiàn)出更大程度的分離。為了量化宰后肌細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)變化，使用Image-Pro Plus 5.1測(cè)量肌細(xì)胞內(nèi)、外間隙。測(cè)量結(jié)果如表1所示，宰后9～24 h，H組和L組的肌細(xì)胞內(nèi)外間隙值均增大，且L組細(xì)胞內(nèi)外間隙小于H組，其中在24 h時(shí)，L組的細(xì)胞外間隙極顯著小于H組（P＜0.01）。肌細(xì)胞內(nèi)外間隙的大小與汁液流失的相關(guān)性分析如表2所示。肌細(xì)胞內(nèi)外間隙均與汁液流失率呈正相關(guān)。在24 h時(shí)，肌細(xì)胞外間隙同汁液流失呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），這表明細(xì)胞內(nèi)外間隙越大的樣品汁液流失率越高，即保水性（WHC）越弱。Sch?fer等[19]研究也發(fā)現(xiàn)宰后肌細(xì)胞間隙大，對(duì)肉的WHC有負(fù)面影響，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論相同。

圖1 宰后9 h和24 h時(shí)的兩組不同汁液流失率肉樣微觀圖片F(xiàn)ig.1 Microscopic photos of two groups of meat samples with different drip loss at 9 h and 24 h after slaughter

表2 宰后背最長(zhǎng)肌中細(xì)胞內(nèi)外間隙與汁液流失率的相關(guān)性Table 2 Correlation between intracellular and extracellular spaces and drip loss rate in the longissimus dorsi muscle

2.2 蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果

對(duì)宰后9 、24 h時(shí)L組與H組的樣品采用肽質(zhì)量指紋法進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定，對(duì)所有鑒定到的酶解后肽段進(jìn)行蛋白分析。成功識(shí)別出2299個(gè)蛋白質(zhì)，可以進(jìn)行定量的蛋白質(zhì)為1476個(gè)。兩組中有57個(gè)蛋白的表達(dá)量差異顯著，如表3所示。

2.2.1 結(jié)構(gòu)蛋白 結(jié)構(gòu)蛋白變化對(duì)肉的持水性有重要影響，宰后結(jié)構(gòu)蛋白降解會(huì)破壞肌纖維的穩(wěn)定性[8]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在宰后24 h兩組間錨蛋白1（Ankyrin 1）和層粘連蛋白（Laminin）亞基表達(dá)量存在顯著差異。錨蛋白1是結(jié)構(gòu)蛋白家族中重要的一員，可將細(xì)胞骨架蛋白固定在細(xì)胞上，維持細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定[20]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，宰后24 h，L組中錨蛋白的表達(dá)量為H組1.32倍。這表明錨蛋白表達(dá)量高，有助于增強(qiáng)細(xì)胞穩(wěn)定性，減少汁液流失。與Aslan等[21]研究的錨蛋白1基因表達(dá)量越多，肌肉的持水性越強(qiáng)一致。層粘連蛋白是位于細(xì)胞膜上的結(jié)構(gòu)蛋白，與細(xì)胞外基質(zhì)相連。本實(shí)驗(yàn)觀察到宰后24 h時(shí)L組層粘連蛋白的亞基（Laminin α4）表達(dá)量為H組的1.21倍，且24 h的L組細(xì)胞外間隙明顯小于H組（表1）。L組中鑒定到的層黏連蛋白亞基表達(dá)量越高，說(shuō)明該蛋白在L組中存在越完整，細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的連接更加緊密，Sch?fer等[19]等發(fā)現(xiàn)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間間距小，有助于減小細(xì)胞間間隙，從而提高肌肉的持水能力。本文推測(cè)L組中汁液流失量低可能與其內(nèi)laminin表達(dá)量大，細(xì)胞間間隙小有關(guān)。

2.2.2 糖酵解相關(guān)蛋白 宰后由肌肉向肉轉(zhuǎn)化的過(guò)程中，無(wú)氧呼吸逐步代替有氧呼吸，肌細(xì)胞中與糖酵解相關(guān)的酶隨即也發(fā)生變化，這些酶變化會(huì)影響糖酵解的速率，從而影響汁液流失率。宰后9、24 h時(shí)，L組中葡萄糖磷酸變位酶-1的表達(dá)量均高于H組，而轉(zhuǎn)酮醇酶和磷酸甘油變位酶的表達(dá)量均低于H組。

葡萄糖磷酸變位酶-1（Phosphoglucomutase 1，PGM1）是肌間脂肪（intramuscular fat；IMF）合成的還原性輔因子[22]。有研究表明，在葡萄糖磷酸變位酶-1基因表達(dá)量高的樣品中IMF含量高，汁液流失率低[23]。Watanabe等[24]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在豬最長(zhǎng)肌中，IMF含量高的組，汁液流失率低，持水能力強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在宰后9、24 h時(shí)，L組的葡萄糖磷酸變位酶-1表達(dá)量分別為H組的1.34倍和1.23倍，且L組的IFM含量（表1）顯著高于H組（P＜0.05）。L組肉具有較低的汁液流失率可能是因?yàn)槠咸烟橇姿嶙兾幻?1表達(dá)量高，IFM含量大，肌肉持水性強(qiáng)。

磷酸甘油變位酶（Phosphoglycerate mutase，PGAM2）是糖酵解途徑中重要的酶，參與了糖酵解途徑的最后一個(gè)步驟：丙酮酸在厭氧條件下轉(zhuǎn)化為乳酸。肌細(xì)胞中磷酸甘油變位酶表達(dá)量高會(huì)導(dǎo)致3-磷酸甘油酸和磷酸烯醇丙酮酸表達(dá)量升高，進(jìn)而能促進(jìn)丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸[25]，降低肌肉的pH，影響肉的持水性、肉色和肌間脂肪表達(dá)量[26]。有報(bào)道證明磷酸甘油變位酶基因表達(dá)量與肉的WHC呈負(fù)相關(guān)[27]，即磷酸甘油變位酶表達(dá)量越高，汁液流失率越高。實(shí)驗(yàn)顯示，在9、24 h時(shí)H組中磷酸甘油變位酶表達(dá)量分別為L(zhǎng)組的1.21和1.24倍。導(dǎo)致H組肉樣高汁液流失的原因可能是肌細(xì)胞中磷酸甘油變位酶表達(dá)量高，促使丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸，造成低pH和高汁液流失（表1）。

表3 宰后9 h和24 h高低汁液流失組存在顯著差異的57個(gè)蛋白Table 3 57 proteins with significant differences in high and low drip loss groups were identified at 9 h and 24 h postmortem

轉(zhuǎn)酮醇酶（Transketolase，TKT）在磷酸戊糖途徑的非氧化階段起著關(guān)鍵作用。與戊糖磷酸途徑中其他酶一樣，它位于細(xì)胞質(zhì)中[28]，是碳水化合物在戊糖磷酸途徑轉(zhuǎn)化中非氧化階段的關(guān)鍵限速酶，其表達(dá)量越高，糖酵解反應(yīng)速率越快，產(chǎn)生乳酸量越多[29]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在宰后9 、24 h時(shí)，H組的轉(zhuǎn)酮醇酶表達(dá)量分別是L組的2.5倍和1.6倍。推測(cè)H組汁液流失率高的原因，可能是H組中轉(zhuǎn)酮醇酶表達(dá)量高，糖酵解反應(yīng)劇烈，乳酸產(chǎn)生速率加快，含量增多，導(dǎo)致pH下降快，汁液流失率高。因此，轉(zhuǎn)酮醇酶有可能作為宰后預(yù)測(cè)宰后肉類持水性的蛋白質(zhì)。前人的相關(guān)報(bào)道中未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)酮醇酶與汁液流失有關(guān)。

續(xù)表 3

圖2 差異蛋白的GO功能分類圖Fig.2 Identification of the differential proteins by GO functional classification

2.2.3 氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白 豬肉汁液流失率的高低受到遺傳、宰后蛋白質(zhì)變化和氧化應(yīng)激反應(yīng)的劇烈程度等多種因素的影響[30]。從肌細(xì)胞中熱休克蛋白70（Hsp70）的表達(dá)量可以看出宰前應(yīng)激反應(yīng)的劇烈程度[31]。宰前機(jī)體內(nèi)應(yīng)激反應(yīng)越劇烈，宰后肌細(xì)胞內(nèi)的Hsp70的表達(dá)量越低，樣品的汁液流失率越高[32]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)24 h時(shí)，L組中Hsp70表達(dá)量是H組的4.70倍，與前人研究發(fā)現(xiàn)Hsp70表達(dá)量越高，汁液流失率越低，持水性越強(qiáng)[33]，這一結(jié)論相符合。Traore等[34]學(xué)者證明氧化反應(yīng)會(huì)使肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和完整性遭到破壞。Liu等[35]通過(guò)電子顯微鏡觀察到，被氧化試劑處理過(guò)的豬最長(zhǎng)肌樣本的細(xì)胞間隙大于對(duì)照組（未使用氧化劑處理的組），且汁液流失率高于對(duì)照組。Jeong等[36]學(xué)者證明硒蛋白W（Selenoprotein W；SELENOW），具有抗氧化活性。Li等[37]的研究發(fā)現(xiàn)，宰后肌肉中硒蛋白W的表達(dá)量越多，肌肉的抗氧化能力越強(qiáng)，汁液流失率越低，持水性越強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)宰后9和24 h，L組比H組細(xì)胞間隙?。ū?），且L組的硒蛋白W表達(dá)量是H組的3.5倍和2.74倍。肉樣出現(xiàn)高汁液流率的原因可能為肌細(xì)胞中硒蛋白W表達(dá)量低，抗氧化能力弱氧，使肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞間間隙增大造成的。

圖3 差異蛋白的KEGG通路的富集圖Fig.3 Identification of the differential proteins by KEGG pathway enrichment analysis

圖4 宰后差異蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Identification of the differential proteins by interaction network diagram

2.3 生物信息學(xué)分析

對(duì)鑒定到的差異蛋白，進(jìn)行GO分類及KEGG富集，旨在尋找差異蛋白功能、涉及到的代謝途徑。使用InterProScan5.14-53.0軟件對(duì)差異蛋白進(jìn)行聚類分析（見(jiàn)圖2），發(fā)現(xiàn)H組和L組中的差異蛋白主要存在于細(xì)胞內(nèi)（intracellar，GO:0005622）、細(xì)胞器（intracellar organelle，GO:0043229）、和 膜 系 統(tǒng)（membrane-bounded organelle，GO:0012505）等。這些蛋白參與的生物過(guò)程（見(jiàn)圖2）有：有機(jī)環(huán)化合物結(jié)合（organic cyclic compound binding，GO:0071704）和生物調(diào)節(jié)過(guò)程（regulation of biological process，GO:0009056）等。這些差異蛋白的分子功能（見(jiàn)圖2）有：蛋白綁定（protein bounding, GO:0005515）等。京都基因和基因組百科全書(shū)的通路富集分析計(jì)數(shù)顯示57個(gè)差異蛋白質(zhì)所在的145通路（見(jiàn)圖3），這些通路包含糖酵解途徑（ssc00010）和戊醣酸途徑（ssc00030）等。如圖4，使用String 10.0對(duì)差異蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化展示（見(jiàn)圖4）。鑒定到的差異蛋白在互作網(wǎng)絡(luò)圖中可以分為三個(gè)關(guān)鍵的蛋白簇，從左至右依次為氧化應(yīng)激蛋白簇、糖酵解蛋白簇和細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白簇。前人的研究表明糖酵解蛋白簇是影響汁液流失的關(guān)鍵蛋白簇[38]。因糖酵解蛋白簇中的轉(zhuǎn)酮醇酶（Transketolase, TKT）可以調(diào)節(jié)乳酸產(chǎn)生量，所以推測(cè)轉(zhuǎn)酮醇酶與宰后肉的持水性有關(guān)。

3 結(jié)論

本次TMT蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)分析和證實(shí)了一些蛋白質(zhì)與汁液流失有關(guān)，葡萄糖磷酸變位酶-1、硒蛋白W、Hsp70和磷酸甘油變位酶在H組和L組中存有顯著差異（P＜0.05）。結(jié)合透射電鏡和差異蛋白推測(cè)，laminin表達(dá)量越大，細(xì)胞間間隙可能小，肌肉持水性越好。本實(shí)驗(yàn)推測(cè)轉(zhuǎn)酮醇酶與肉類持水性有關(guān)，轉(zhuǎn)酮醇酶表達(dá)量高會(huì)加速磷酸戊糖途徑中乳酸的形成，導(dǎo)致肉樣持水性降低，所以轉(zhuǎn)酮醇酶有可能作為宰后預(yù)測(cè)肉汁液流失的蛋白。對(duì)宰后初期蛋白質(zhì)變化與持水性的關(guān)系還需進(jìn)一步研究，以便更好地了解因蛋白質(zhì)變化導(dǎo)致的持水性變化。