基因共表達(dá)對(duì)人源LysoPLD異源可溶性表達(dá)、純化及酶學(xué)性質(zhì)的影響

馬文君，滕 琳，王培培，衛(wèi)宏遠(yuǎn)，鄭春陽(yáng)

（1.天津大學(xué)，天津 300350；2.天津強(qiáng)微特生物科技有限公司，天津 300384；3.守正創(chuàng)新生物科技（天津）有限公司，天津 300384）

磷脂酶是催化磷脂水解的第一步關(guān)鍵酶，根據(jù)水解磷脂的部位不同可以把磷脂酶分為磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶 B、磷脂酶C和磷脂酶D[1]。磷脂酶D（PLD）是一個(gè)復(fù)雜的蛋白家族，普遍存在于哺乳動(dòng)物、植物和細(xì)菌中[2-3]。磷脂酶D能夠水解細(xì)胞膜中的磷脂，其水解產(chǎn)物參與細(xì)胞的多種生理過(guò)程如抗凋亡、傷口愈合、促進(jìn)血管生成、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、腫瘤進(jìn)展等[4-5]。人溶血磷脂酶D（LysoPLD）因其與PLD的氨基酸序列具有相似性，也具有磷脂酶活性。作為PLD家族一員，它不僅可以水解溶血磷脂分子中磷酸二酯鍵生成溶血磷脂酸（LPA）和一個(gè)自由的頭部基團(tuán)，還能夠催化磷脂和某些醇類發(fā)生堿基交換反應(yīng)生成另一種磷脂[6-8]。

在食品工業(yè)中，PLD廣泛作用于多種磷脂，以卵磷脂為底物，富集自然界稀少、難以分離提純的單體磷脂，如磷脂酰絲氨酸（PS）、磷脂酰肌醇（PI）和磷脂酰甘油（PG）等，這些磷脂都具有非常高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[9-11]。如磷脂酰絲氨酸，是一種新資源食品，具有改善阿爾茲海默癥、治療抑郁癥和緩解精神壓力等作用，市場(chǎng)前景十分廣闊[12-13]。酶法合成磷脂酰絲氨酸主要取決于PLD催化作用，但市售的PLD主要是從植物中提取，存在的問(wèn)題主要是種類少、活力低、價(jià)格高。鑒于LysoPLD的PLD活性及其人源的低免疫原性，采用微生物異源表達(dá)LysoPLD具有解決市售PLD存在問(wèn)題的潛力。

如何提升外源蛋白高效、可溶表達(dá)一直是工業(yè)酶生產(chǎn)與應(yīng)用的瓶頸。目前，多個(gè)課題組嘗試了磷脂酶D的異源表達(dá)，大多呈包涵體表達(dá)[14-15]。由于蛋白表達(dá)速度過(guò)快、活性二硫鍵來(lái)不及正確配對(duì)等原因，外源蛋白在大腸桿菌胞內(nèi)往往會(huì)以無(wú)活性的包涵體形式表達(dá)。由于包涵體復(fù)性折疊機(jī)制不明確，把無(wú)活性的包涵體復(fù)性為完全的天然活性狀態(tài)不僅操作繁瑣而且復(fù)性效率較低。較低的復(fù)性效率依然是大腸桿菌體系表達(dá)的許多外源蛋白造成損失或者難以有效制備的主要原因[16]。原核表達(dá)系統(tǒng)及可溶性表達(dá)優(yōu)化確實(shí)均屬于非常成熟的技術(shù)，但在重組蛋白的表達(dá)過(guò)程中，合適的載體和分子伴侶對(duì)重組蛋白的正確折疊，防止包涵體的形成具有積極作用[17]。因此在實(shí)踐過(guò)程中需要對(duì)不同標(biāo)簽蛋白和分子伴侶進(jìn)行大量的篩選研究，確定合適的促溶表達(dá)條件。本研究首次嘗試用觸發(fā)因子（Triggering factor，Tig），作為第一個(gè)與新生多肽鏈相互作用的伴侶分子，以期協(xié)助LysoPLD蛋白共翻譯折疊，有效促進(jìn)其可溶表達(dá)。

前人通過(guò)定點(diǎn)突變研究發(fā)現(xiàn)，LysoPLD的活性中心（LysoPLD催化結(jié)構(gòu)域）位于胞外結(jié)構(gòu)域的Thr-210到His-475序列附近[18]，確定含有Ser 48的C末端的胞外結(jié)構(gòu)域是LysoPLD的主體，可以獲得可溶、具有活性的重組分子[19]。在此基礎(chǔ)上，本研究在大腸桿菌中分別構(gòu)建含促溶標(biāo)簽MBP和分子伴侶tig共表達(dá)兩種促LysoPLD可溶表達(dá)體系，并研究了兩種促溶體系對(duì)重組蛋白的可溶表達(dá)、純化方法、酶活性等方面的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株和質(zhì)粒大腸桿菌Escherichia coliDH5α、Escherichia coliBL21（DE3） 均由本實(shí)驗(yàn)室保存；pET28a-MBP質(zhì)粒 由本實(shí)驗(yàn)保存；Chaperone Competent Cells pTf16/BL21 Takara公司；pET28a-MBPPLD 本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建；限制性內(nèi)切酶 美國(guó)NEB公司；膠回收試劑盒 美國(guó)Promega公司；質(zhì)粒小提試劑盒 中國(guó)天根生物公司；SDS-PAGE電泳凝膠試劑盒、高保真PCR聚合酶 天津強(qiáng)微特生物科技有限公司；實(shí)驗(yàn)所用純化填料 美國(guó)GE公司；麥芽糖等其他試劑 為國(guó)產(chǎn)分析純。

AKTApurifier TM100純化系統(tǒng) 美國(guó)GE公司；SCIE10TI-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；Bio-radPowerPac HV垂直電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；BioDoc-It2 315 Imaging System凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)UVP公司；GL-21M高速冷凍離心機(jī) 中國(guó)湘儀公司；UV3100紫外可見光分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人源LysoPLD基因的克隆及載體構(gòu)建 根據(jù)NCBI上人LysoPLD（ENPP2）基因編碼的氨基酸序列信息及催化反應(yīng)的信息，確定本實(shí)驗(yàn)的目的克隆序列。通過(guò)信號(hào)肽分析程序（http://www.detaibio.com/tools /index.php?r=signal-peptide/index）對(duì)此序列進(jìn)行信號(hào)肽分析，確定Ser-48至C末端全序列為本研究的目的基因序列。經(jīng)密碼子優(yōu)化后，由通用生物合成目的基因序列，獲得質(zhì)粒pET28a-LysoPLD質(zhì)粒。通過(guò)Snapgene設(shè)計(jì)麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）上下游引物，將MBP作為促溶標(biāo)簽與人LysoPLD基因融合表達(dá)，上游引物P1：5’-GTTTAACTTTAAG AAGGAGATATACC atgaaaatcgaagaaggtaaactg；下游引物P2：5’-AATATTGGTCCACGGACTCATATT GGATTGGAAGTACAGGTTTTCCTCGATCCCagt ctgcgcgtctttcagggc；設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增pET28a-LysoPLD骨架的引物，上游引物P3：5’-ATGAGTCCGTGGA CCAATATTAG；下游引物P4：5’-GGTATATCTCC TTCTTAAAGTTAAAC。

首先以P1、P2為引物對(duì)，PCR擴(kuò)增MBP基因片段，再以P3、P4為引物對(duì)，PCR擴(kuò)增pET28a-LysoPLD骨架，PCR的擴(kuò)增條件為：98 ℃，3 min；（98 ℃，10 s；60 ℃，30 s；72 ℃，3.5 min） × 30循環(huán)；72 ℃，7 min；4 ℃，∞。將得到片段采用膠回收試劑盒進(jìn)行片段回收，回收的片段以摩爾比1:3（MBP片段的摩爾數(shù)＞pET28a-LysoPLD骨架的摩爾數(shù)）于室溫采用同源重組的方法連接1 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)，篩選陽(yáng)性克隆，并進(jìn)行測(cè)序鑒定。經(jīng)鑒定的重組表達(dá)載體為pET28a-MBPLysoPLD，轉(zhuǎn)化E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞后于-80 ℃進(jìn)行保存[20]。

1.2.2 MBP-LysoPLD的誘導(dǎo)表達(dá)及條件優(yōu)化 將-80 ℃保藏的重組表達(dá)菌株pET28a-MBP-PLDBL21（DE3）復(fù)蘇后，接種于5 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃，100 r/min振蕩過(guò)夜活化。將活化的pET28a-MBP-PLD-BL21（DE3）繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，接種于100 mL含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，當(dāng)菌液A600達(dá)0.5～0.7時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。6000 × g離心10 min收集菌體，超聲破菌后，離心得到菌液上清和沉淀，再用0.5 mmol/L Tris-HCl將沉淀復(fù)溶，進(jìn)行SDS-PAGE分析，配制10%分離膠和5%濃縮膠，恒定功率10 W跑45 min[21]。

1.2.3 Tig分子伴侶與PLD共表達(dá)實(shí)驗(yàn) Takara公司的pTf16質(zhì)粒中存在tig表達(dá)基因，受araB啟動(dòng)子調(diào)控，pET28a-LysoPLD質(zhì)粒中目的基因LysoPLD受Lac調(diào)控系統(tǒng)控制，兩個(gè)質(zhì)粒具有不同的抗生素標(biāo)記可進(jìn)行共表達(dá)，且tig和LysoPLD可獨(dú)立誘導(dǎo)表達(dá)[22]。將pET28a-LysoPLD和pTf16兩個(gè)質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)化BL21（DE3），采用雙抗LB培養(yǎng)基（25 μg/mL卡那霉素和17 μg/mL氯霉素）篩選同時(shí)具有兩種質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子，-80 ℃凍存。取出轉(zhuǎn)化子，接種到雙抗培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)活化；活化后，接種于100 mL含雙抗和0.5 mg/mL L-Arabinose的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)（此時(shí)已開始表達(dá)Tig），當(dāng)A600達(dá)0.4～0.6時(shí)，于15 ℃放置30 min，加入終濃度為0.5 mmol/L IPTG于15 ℃振蕩培養(yǎng)12～24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，6000×g離心10 min收集菌體，超聲破菌，根據(jù)SDS-PAGE電泳（具體方法同1.2.2）、活性測(cè)定結(jié)果確認(rèn)目的產(chǎn)物的表達(dá)量及溶解性。

1.2.4 重組LysoPLD的純化 MBP-LysoPLD的純化：將誘導(dǎo)后收集的pET28a-MBP-LysoPLD的BL21（DE3）菌體均勻懸浮于50 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）溶液中，經(jīng)超聲破菌后，20000×g離心20 min，收集上清，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后，采用Amylose親和柱進(jìn)行純化。采用Amylose-A（20 mmol/L Tris-HCl pH7.4，1 mmol/L EDTA，0.2 mol/L NaCl）進(jìn)行洗滌、平衡，得到流穿蛋白，采用Amylose-B（20mmol/L Tris-HCl pH7.4，1 mmol/L EDTA，0.2 mol/LNaCl，10 mmol/L麥芽糖）進(jìn)行洗脫，收集洗脫組分，得到洗脫收集蛋白，進(jìn)行10%SDS-PAGE分析，具體方法同1.2.2。

LysoPLD（tig）的純化：將誘導(dǎo)后收集的同時(shí)含有pTf16(tig)和pET28a-LysoPLD的BL21（DE3）菌體，均勻懸浮于50 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）溶液中，經(jīng)超聲破碎后，20000×g離心20 min，收集上清，過(guò)0.45 μm濾膜。首先采用SP柱，經(jīng)SP-A（20 mmol/L Tris-HCl（pH6.0））洗滌后，得到流穿蛋白。采用SPB（20 mmol/L Tris-HCl（pH6.0），1 mol/L NaCl）進(jìn)行洗脫，洗脫流速為1 mL/min，洗脫梯度為0～100%B，10 min收集洗脫組分，得到洗脫收集蛋白。再過(guò)Q柱純化，經(jīng)Q-A Buffer（20 mmol/L Tris-HCl pH8.0，1 mmol/L EDTA，5%Glycerol）洗滌后，得到流穿蛋白，采用Q-B Buffer（20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1 mmol/L EDTA，5%Glycerol，1 mmol/L NaCl）進(jìn)行洗脫，收集洗脫組分，得到洗脫收集蛋白，將上述得到的蛋白進(jìn)行10%SDS-PAGE分析，具體方法同1.2.2。

1.2.5 LysoPLD的酶活測(cè)定 LysoPLD的酶活測(cè)定方法參考對(duì)硝基苯酚方法[23]，對(duì)硝基苯酚粉末用50 mmol/L Tris-HCl （pH8.0）進(jìn)行溶解并稀釋，溶液濃度梯度為0、0.005、0.01、0.02和0.04 μmol/L，并測(cè)定其在波長(zhǎng)為405 nm的分光光度值擬合得到對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=28.36x，R2=0.9991。

取30 mg對(duì)硝基酚棕櫚酸酯溶于10 mL異丙醇后，用含10% Triton-100的Tris-HCl(pH8.0)的溶液混合溶解，放入37 ℃恒溫水浴5 min，加入適量酶液，測(cè)定405 nm處紫外分光光度值隨時(shí)間變化的曲線，算出每分鐘吸光值的值，酶水解活力計(jì)算公式為：

式中，△A為酶促反應(yīng)的吸光變化值；V為測(cè)量試樣總體積；Vs為所加酶液體積；K為對(duì)硝基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；T為反應(yīng)時(shí)間；277為轉(zhuǎn)化系數(shù)。

1.2.6 最適溫度、最適離子濃度和最適pH 將重組酶置于含有50 mmol/L CaCl2的40 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0）中，在20～80 °C溫度范圍內(nèi)，每間隔10 °C進(jìn)行酶反應(yīng)，研究溫度對(duì)重組酶活性的影響。

將50 μL20 mmol/L的重組酶添加到含有底物和100 μL 10、50和100 mmol/L不同金屬離子（Zn2+、Ca2+和Mg2+）的溶液中后測(cè)量活性。另外，以40 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0）溶液為緩沖液進(jìn)行對(duì)照。通過(guò)將不同因素的酶活性除以對(duì)照組的100%，計(jì)算出重組酶的相對(duì)活性（%）。

參照侯海娟等的方法，將純化得到的兩種磷脂酶D（10 μL）在50 °C下預(yù)孵育30 min，以含有對(duì)硝基酚棕櫚酸酯的反應(yīng)混合物為底物，以40 μL不同pH（5.0～8.5）緩沖液100 mmol/L乙酸鹽、50 mmol/L三氯化甘油和8 mmol/L CaCl2作為緩沖液進(jìn)行反應(yīng)。

將20 mmol/L 50 μL的重組酶添加到含有底物對(duì)硝基酚棕櫚酸酯和不同濃度（0、10、25、45和100mmol/L）Ca2+離子（100 μL）的溶液中后測(cè)量活性。另外，以Triton X-100溶液為緩沖液進(jìn)行對(duì)照。通過(guò)將不同因素的酶活性除以對(duì)照組的100%，計(jì)算出重組酶的相對(duì)活性（%）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中每個(gè)處理重復(fù)3次，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析，應(yīng)用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 pET28a-LysoPLD和pET28a-MBP-LysoPLD質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

根據(jù)前述方法，通過(guò)PCR分別擴(kuò)增MBP片段（～1100 bp，圖1A）和pET28a-LysoPLD骨架（～7700 bp，圖1B），同源重組后，獲得的質(zhì)粒采用T7/T7t引物對(duì)，對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，并采用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，出現(xiàn)～3500 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，其大小恰好與MBP（～1100 bp） + LysoPLD（～2400 bp）大小相吻合（圖1C）。重組質(zhì)粒經(jīng)抽提測(cè)序，BLAST比對(duì)，與目的基因序列相符，未發(fā)生突變，表明pET28a-MBP-LysoPLD載體構(gòu)建成功。

圖1 MBP基因、pET28a-LysoPLD載體骨架和pET28a-MBP-LysoPLD基因的PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 PCR amplification and identification of MBP gene、pET28a-LysoPLD and pET28a-MBP-LysoPLD

2.2 pET28a-MBP-LysoPLD-BL21（DE3）的誘導(dǎo)表達(dá)分析

分別培養(yǎng)pET28a-LysoPLD-BL21（DE3）和pET28a-MBP-LysoPLD-BL21（DE3），并經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，收集菌體，超聲破菌，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。如圖2A可以看出，誘導(dǎo)后的全菌在110 kDa處有一明顯蛋白質(zhì)條帶，但上清中卻并未發(fā)現(xiàn)此蛋白的表達(dá)（圖2A，泳道3），都在沉淀中（圖2A，泳道4），證明沒有MBP標(biāo)簽的LysoPLD蛋白幾乎全部呈包涵體表達(dá)。MBP是一種大腸桿菌的內(nèi)源性的蛋白質(zhì)，由大腸桿菌K12的malE基因編碼，分子量為40 kDa[24]，在大腸桿菌中具有極高的表達(dá)量。在目的蛋白的氨基端添加MBP標(biāo)簽蛋白時(shí)，可大幅度地提高目的蛋白的可溶性表達(dá)量，并且可幫助目的蛋白在大腸桿菌中正確折疊并保持原有的活性[25]。因此。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了pET28a-MBP-LysoPLD，將LysoPLD蛋白與MBP進(jìn)行融合表達(dá)，融合蛋白MBP-LysoPLD分子量大于116 kDa紅色箭頭標(biāo)示的條帶，由圖2B顯示，大約1/3的MBP-LysoPLD可在誘導(dǎo)表達(dá)后超聲破碎離心得到的上清中表達(dá)（圖2B，泳道4）。后續(xù)通過(guò)發(fā)酵工藝的優(yōu)化，目的蛋白質(zhì)的可溶表達(dá)量可能會(huì)有進(jìn)一步的提高。

圖2 大腸桿菌表達(dá)的重組PLD和MBP-LysoPLD的SDS-PAGE分析Fig.2 Analysis of the recombinant of LysoPLD and MBP-LysoPLD expressed in E. coli by SDS-PAGE

2.3 Tig與LysoPLD的共誘導(dǎo)表達(dá)分析

鑒于LysoPLD的原核表達(dá)主要以包涵體形式存在，除了用促溶標(biāo)簽的方法，本實(shí)驗(yàn)還嘗試了共表達(dá)分子伴侶Tig的方法。如圖3所示，在加入IPTG誘導(dǎo)前（圖3，條帶1）就已經(jīng)在50 kDa左右出現(xiàn)了tig的誘導(dǎo)表達(dá)條帶，在加入IPTG后，在66.2～116 kDa區(qū)間出現(xiàn)LysoPLD目的蛋白（圖3，條帶2），部分呈上清表達(dá)（圖3，條帶3），部分在破菌后離心沉淀中，即呈包涵體表達(dá)（圖3，條帶4），包涵體蛋白沒有經(jīng)過(guò)正確折疊的聚集體，不具備其應(yīng)有的生物活性。對(duì)比SDS-PAGE圖2B第4條泳道和圖3中第3條泳道破菌離心的上清結(jié)果得到的可溶蛋白量大于促溶標(biāo)簽法。tig分子伴侶促溶法在誘導(dǎo)表達(dá)操作上較復(fù)雜，但經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后可直接獲得LysoPLD蛋白本身。而促溶標(biāo)簽法誘導(dǎo)表達(dá)的是融合蛋白，后續(xù)需要把促溶標(biāo)簽通過(guò)蛋白酶進(jìn)行切除后再純化。

圖3 大腸桿菌表達(dá)的重組LysoPLD（tig）的SDS-PAGE分析Fig.3 Analysis of the recombinant of pTf16-LysoPLD（tig）expressed in E.coli by SDS-PAGE

2.4 LysoPLD（tig）和MBP-LysoPLD的分離純化比較分析

根據(jù)MBP標(biāo)簽特性，本實(shí)驗(yàn)采用了Amylose親和柱層析對(duì)MBP-LysoPLD融合蛋白的純化，目標(biāo)蛋白條帶大于116 kDa，對(duì)Amylose親和柱吸附特異性強(qiáng)，可以被洗脫，結(jié)果如圖4箭頭所示，最終條帶3為目標(biāo)蛋白MBP-LysoPLD，所得最終樣品約4 mL，濃度0.46 mg/mL，根據(jù)凝膠成像分析系統(tǒng)分析其純度達(dá)到90%以上。

圖4 Amylose Resin純化洗脫MBP-LysoPLDFig.4 Purification and elution of MBP-LysoPLD by Amylose Resin

tig協(xié)助下的LysoPLD蛋白表達(dá)菌株經(jīng)超聲破碎，細(xì)胞上清液依次經(jīng)過(guò)SP瓊脂糖凝膠柱（圖5A）和陰離子Q柱（圖5B），進(jìn)行目的蛋白洗脫，最終獲得分子量為110 kDa的目標(biāo)蛋白（圖5B）。在設(shè)計(jì)LysoPLD的表達(dá)時(shí)，PLD序列設(shè)計(jì)了His標(biāo)簽，但無(wú)論His標(biāo)簽在C端或在N端，PLD蛋白都無(wú)法掛Ni柱（結(jié)果未示出），因此采用離子交換柱Q柱進(jìn)行PLD蛋白的純化，根據(jù)凝膠成像分析系統(tǒng)分析其純度達(dá)到80%以上。

比較tig協(xié)助下的LysoPLD蛋白和融合蛋白MBP-LysoPLD的分離純化步驟發(fā)現(xiàn)，MBP-LysoPLD由于存在MBP標(biāo)簽，只采用Amylose親和層析就可以得到純度在90%的融合蛋白，但后續(xù)也會(huì)涉及采用TEV進(jìn)行MBP標(biāo)簽切割步驟；而tig協(xié)助下的LysoPLD蛋白由于不能掛Ni柱純化，需要進(jìn)行兩步離子柱洗脫，在操作方法上來(lái)講較為復(fù)雜，但不需要再進(jìn)一步切除多余的標(biāo)簽。因此，從純化步驟的角度兩種方法復(fù)雜度類似。

圖5 蛋白純化后的SDS-PAGE電泳圖Fig.5 SDS-PAGE analysis of purified PLD protein

2.5 LysoPLD（tig）與MBP-LysoPLD的酶活比較分析

采用同樣100 mL發(fā)酵液體積，MBPLysoPLD融合蛋白得到4.91 mg，tig協(xié)助折疊的LysoPLD蛋白得到5.79 mg，tig協(xié)助的PLD蛋白比融合蛋白MBP-PLD得率約高17.9%。根據(jù)1.2.5中的酶活測(cè)定方法，分別測(cè)定融合蛋白MBPLysoPLD和tig協(xié)助折疊的PLD的酶活力，MBPLysoPLD的總活力為20.98 U，比活力為4.27 U/mg，LysoPLD（tig）總活力為42.61 U，比活力為7.32 U/mg（表1）。

表1 兩種LysoPLD酶活性質(zhì)比較Table 1 Comparison of two LysoPLD enzyme activity

目前報(bào)道的LysoPLD蛋白的表達(dá)系統(tǒng)有Sf 9昆蟲細(xì)胞和COS-7細(xì)胞表達(dá)[19]，現(xiàn)有結(jié)果表明這兩類表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白缺乏修飾，蛋白表達(dá)量低，無(wú)法滿足LysoPLD蛋白結(jié)構(gòu)及功能研究，也有研究者對(duì)LysoPLD蛋白進(jìn)行HEK293細(xì)胞的規(guī)?；磉_(dá)，但其表達(dá)的LysoPLD蛋白含有FC標(biāo)簽，標(biāo)簽較大，后續(xù)需要切去標(biāo)簽，獲得蛋白純度低[26]。本試驗(yàn)構(gòu)建的LysoPLD（tig）可以有效避免切標(biāo)簽帶來(lái)的操作，與其他來(lái)源的標(biāo)簽相比，表達(dá)效率高，可溶性效果好，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

2.6 pH、溫度及金屬離子對(duì)LysoPLD酶活的影響比較

圖6（A）表明LysoPLD在pH為5.5，鈣離子濃度為50 mmol/L時(shí)，其相對(duì)酶活的最適溫度為40 ℃。溫度達(dá)到60 ℃仍保留50%的酶活力，高于60 ℃時(shí)活性降低并逐漸消失。故LysoPLD的溫度耐受范圍在20～60 ℃。不同濃度的金屬離子處理LysoPLD蛋白，檢測(cè)其對(duì)LysoPLD活性影響(圖6B)可知，不同金屬離子明顯影響重組酶的活性，且呈現(xiàn)濃度依賴性，尤其是50 mmol/L鈣離子時(shí)，重組酶活性最高，與重組酶有Ca2+的結(jié)合位點(diǎn)有關(guān)，與相關(guān)文獻(xiàn)的研究結(jié)果一致[27]。

LysoPLD的酶催化功能依賴于Ca2+離子，同時(shí)pH對(duì)其酶活的影響也很大，因此，本研究對(duì)比了LysoPLD（tig）和MBP-LysoPLD在Ca2+離子依賴性及最佳pH方面的特性[28]（圖7）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種LysoPLD均呈現(xiàn)顯著Ca2+的依賴性。隨著pH的提高，在不同鈣離子濃度作用下，兩種PLD的相對(duì)酶活均呈現(xiàn)先增高后降低，且LysoPLD（tig）和MBPLysoPLD二者的最佳pH都在5.5～5.6之間，最佳酶活時(shí)需要的鈣離子濃度是45 mmol/L。因此，通過(guò)PLD（tig）及MBP-LysoPLD蛋白的酶活特性比較分析可以發(fā)現(xiàn)，在最適pH和最適鈣離子濃度條件下，兩種酶的相對(duì)酶活均達(dá)到90%以上，因此，促溶標(biāo)簽法和tig共表達(dá)方法都可獲得發(fā)揮正常功能，具有一致特性的LysoPLD。

圖6 LysoPLD（tig）與MBP-LysoPLD在不同溫度相對(duì)酶活（A）和LysoPLD（tig）在不同金屬離子下相對(duì)酶活（B）Fig.6 Relative enzyme activities of LysoPLD (tig) and MBP-LysoPLD at different temperature (A) and LysoPLD (tig)at different metal ions (B)

圖7 PLD（tig）與MBP-LysoPLD在不同pH和濃度Ca2+下相對(duì)酶活Fig.7 Relative enzyme activities of LysoPLD (tig) and MBP-LysoPLD at different pH and Ca2+ concentration

3 結(jié)論

成功構(gòu)建了人PLD的原核表達(dá)質(zhì)粒pET28apTf16-LysoPLD（tig）和pET28a-MBP-LysoPLD，建立了LysoPLD（tig）和MBP-LysoPLD蛋白大腸桿菌促進(jìn)可溶性表達(dá)系統(tǒng)，獲得了純度80%以上的LysoPLD蛋白。兩種LysoPLD酶反應(yīng)最適pH在5.5～5.6之間，最佳酶活時(shí)需要的鈣離子濃度是45 mmol/L，兩種促進(jìn)可溶性表達(dá)方式都可以獲得具有一致特性的LysoPLD。