花青素對(duì)牛血清白蛋白的光譜特性及構(gòu)象的影響

趙旭紅，夏彩芬，周紫薇，莊文麗，郭梅英

（湖北工程學(xué)院化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，湖北孝感 432000）

花青素（Anthocyanin, ACN）是一類水溶性天然色素，屬黃酮類化合物，主要來源于蘿卜、爬山虎、紫薯、葡萄、板栗等植物中[1-3]?；ㄇ嗨厥翘烊豢寡趸瘎?，具有強(qiáng)效抗氧化性，可與生物體內(nèi)其他分子相互作用而產(chǎn)生抗氧化等功效，減少自由基對(duì)人體細(xì)胞的傷害，起到抗氧化及抗衰老的作用，從而保護(hù)人體免疫系統(tǒng)[4-7]。有研究表明，花青素有抑菌活性，能影響腸道微生物菌群，可以抑制部分腸道病原菌數(shù)量，增加雙歧桿菌和乳酸桿菌等益生菌的數(shù)目，增強(qiáng)腸道屏障功能，花青素基于天然色素和抗氧化性這兩個(gè)特性，在醫(yī)藥、食品及化妝品工業(yè)均有所應(yīng)用[5,7-10]。

牛血清白蛋白（BSA）常用作小分子藥物研究的作用靶標(biāo)，同時(shí)基于BSA中三個(gè)發(fā)射熒光氨基酸殘基（色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸），ACN與BSA結(jié)合，能減緩BSA的氧化進(jìn)程，從而起到保護(hù)BSA的作用[11]。為了進(jìn)一步研究ACN與BSA作用機(jī)理及對(duì)BSA功能構(gòu)象的影響，本文采用熒光光譜法、紫外-可見光吸收法、圓二色譜法、傅利葉紅外光譜法等聯(lián)用的方式分析了ACN與BSA相互作用過程中的光譜變化情況，獲取BSA熒光強(qiáng)度、發(fā)射峰、吸收峰特征等指標(biāo)。通過理論模型對(duì)這些指標(biāo)參數(shù)的分析，計(jì)算得到結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、結(jié)合距離等信息，從而闡明ACN與BSA相互作用的機(jī)理及對(duì)BSA功能結(jié)構(gòu)的影響，為ACN在醫(yī)藥、食品及化妝品工業(yè)的發(fā)展提供可靠的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花青素（anthocyanin，ACN） 分析純，大連美侖生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)中濃度為4×10-3mol/L；牛血清白蛋白（BSA） Sigma公司；華法林 分析純，山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；布洛芬 分析純，上海薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司；實(shí)驗(yàn)用水 均為超純水。

FLS920熒光光譜儀 英國愛丁堡儀器有限公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Chirascan圓二色光譜儀

英國應(yīng)用光物理公司；Nicolet-380傅利葉紅外光譜儀 美國熱電高力公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制 BSA溶液：將BSA（Mr=66430）溶于PBS緩沖溶液中，配制成濃度為1×10-3mol/L的BSA儲(chǔ)備液，保存于4 ℃冰箱備用，使用時(shí)根據(jù)需要以PBS稀釋至所需濃度；ACN溶液：用無水乙醇配制成本體濃度為4×10-3mol/L的ACN儲(chǔ)備液[2-3]。

1.2.2 熒光光譜 熒光實(shí)驗(yàn)中設(shè)置比色皿內(nèi)BSA溶液終濃度為1×10-5mol/L，ACN溶液本體濃度為4×10-3mol/L。各熒光實(shí)驗(yàn)中滴入的ACN含量呈濃度梯度增加[2]。

1.2.2.1 變溫?zé)晒?設(shè)置ACN與BSA濃度比為0:1（a）、1:1（b）、2:1（c）、3:1（d）、4:1（e）、5:1（f）、6:1（g）、7:1（h）、8:1（i）。在激發(fā)波長280 nm和狹縫3 nm條件下，分別掃描298、304和310 K時(shí)，ACN-BSA體系的熒光光譜，波長范圍為300～500 nm[2]。

1.2.2.2 同步熒光 設(shè)置ACN與BSA濃度比為0:1（a）、1:1（b）、2:1（c）、3:1（d）、4:1（e）、5:1（f）、6:1（g）、7:1（h）、8:1（i）。固定Δλ=15 nm和Δλ=60 nm，在激發(fā)波長280 nm、狹縫寬度3 nm和發(fā)射波長340 nm、狹縫寬度5 nm的條件下，掃描250～400 nm范圍內(nèi)BSA和ACN溶劑體系的同步熒光光譜[2,6]。

1.2.2.3 位點(diǎn)競爭 設(shè)置ACN與BSA混合后的濃度比例分別為1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1。選用兩種位點(diǎn)競爭劑布洛芬和華法林，固定激發(fā)波長為280 nm，在298 K的條件下分別測定不同探針下的熒光光譜[12]。

1.2.3 紫外-可見吸收光譜 據(jù)文獻(xiàn)[3]報(bào)道，ACN加入會(huì)導(dǎo)致BSA在280 nm處吸光度下降，經(jīng)過重復(fù)實(shí)驗(yàn)，本研究中設(shè)置紫外光譜實(shí)驗(yàn)中BSA濃度為1×10-5mol/L(a)，ACN與BSA混合后的濃度比例分別為1:1（b）、2:1（c）、3:1（d）、4:1（e）、5:1（f）、6:1（g）。固定掃描區(qū)間為190～400 nm，測定在298 K條件下的紫外-可見吸收光譜。

1.2.4 圓二色譜 BSA終濃度為5×10-6mol/L(a)，ACN和BSA混合液濃度比分別為1:1（b）和2:1（c），固定波長在180 ～260 nm之間，在持續(xù)通氮?dú)獾臈l件下，分別測定298 K時(shí)不同溶劑體系的圓二色譜圖[12]。

1.2.5 紅外光譜 BSA終濃度為1×10-5mol/L，BSA與ACN混合體系的濃度比為1:6。固定掃描區(qū)間為2000～1600 cm-1，利用液膜法分別測定不同溶劑體系的紅外光譜[2]。

參與式學(xué)習(xí)的互動(dòng)由兩部組成：一是老師引導(dǎo)為主，學(xué)生參與；二是學(xué)生發(fā)現(xiàn)問題主動(dòng)與老師交流教師與學(xué)生之間的互動(dòng)和教師引導(dǎo)下的學(xué)生之間的互動(dòng)。在這種模式下，學(xué)習(xí)過程中學(xué)生是積極地一方。學(xué)生只有積極參與學(xué)習(xí)內(nèi)容或任務(wù)，才能深入學(xué)習(xí)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文運(yùn)用Origin 2018、OMNIC 8.0、CDNN等軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，獲得ACN與BSA相互作用的機(jī)理及熱力學(xué)特征。根據(jù)熱力學(xué)公式計(jì)算得到ACN與BSA之間的熱力學(xué)常數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光光譜分析

2.1.1 變溫?zé)晒夥治?/p>

2.1.1.1 ACN對(duì)BSA猝滅方式的判定 熒光猝滅類型分為動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅，可以依據(jù)體系對(duì)溫度的變化趨勢(shì)來判斷動(dòng)態(tài)和靜態(tài)猝滅[12]，動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)隨著溫度的增大而增大，而靜態(tài)猝滅常數(shù)隨著溫度的增大而減小。假設(shè)ACN對(duì)BSA的熒光猝滅為靜態(tài)猝滅，則該猝滅服從Stern-Volmer方程[13-15]：

式（1）中：F0、F為未加入和已加入ACN時(shí)BSA的熒光強(qiáng)度；[Q]為ACN的摩爾濃度；Ksv為猝滅常數(shù)；Kq為猝滅速率常數(shù)；τ0為無ACN存在時(shí)熒光分子的平均壽命，一般τ0約為10-8s[16]。

作出F0/F-[Q]關(guān)系圖并計(jì)算出不同溫度下的靜態(tài)猝滅常數(shù)Ksv，結(jié)果如圖1和表1。隨著ACN的加入，BSA熒光強(qiáng)度減小，BSA的最大發(fā)射波長發(fā)生微小藍(lán)移，表明ACN對(duì)BSA的內(nèi)源熒光有明顯的猝滅作用，說明ACN與BSA發(fā)生了結(jié)合作用使其構(gòu)象發(fā)生改變。隨著溫度的升高，猝滅常數(shù)Ksv減小，表明ACN與BSA的熒光猝滅類型屬于靜態(tài)猝滅。

圖1 ACN與BSA作用的熒光猝滅圖（A，298 K）和Stern-Volmer曲線（B）Fig.1 Fluorescence spectra (A，298 K) and Stern-Volmer curve(B) of interaction between ACN and BSA

表1 不同溫度下ACN與BSA作用的Stern-Volmer猝滅常數(shù)Table 1 Stern-Volmer quenching constants of interaction between ACN and BSA at different temperatures

2.1.1.2 ACN對(duì)BSA結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的計(jì)算

式（2）中：F0、F分別為未加入和已加入ACN時(shí)BSA的熒光強(qiáng)度；[Q]為ACN的濃度；Ka為結(jié)合常數(shù)；n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。

作出lg[(F0-F)/F]-lg[Q]關(guān)系圖并計(jì)算出不同溫度下的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n，結(jié)果如圖2和表2所示。Ka隨溫度升高呈下降趨勢(shì)，表明ACN和BSA結(jié)合能力不斷降低；n值從1.12增至1.61，總體趨近于1，表明ACN在BSA上主要有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。

2.1.1.3 ACN對(duì)BSA結(jié)合作用力的判定 靜態(tài)猝滅反應(yīng)的焓變?chǔ)、熵變?chǔ)和吉布斯自由能變?chǔ)可通過不同溫度下ACN與BSA作用的靜態(tài)猝滅常數(shù)Ksv求出。假設(shè)該反應(yīng)的焓變?chǔ)不隨溫度的改變而改變，故熱力學(xué)參數(shù)可采用以下方程計(jì)算[18]：

圖2 不同溫度下ACN與BSA作用的結(jié)合常數(shù)擬合圖Fig.2 Fitting diagram of binding constants of interaction between ACN and BSA at different temperatures

表2 不同溫度下ACN與BSA作用的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)nTable 2 The binding constants Ka and the number of binding sites n for the interaction between ACN and BSA at different temperatures

式（3）中：R為氣體摩爾常數(shù)，8.31 J·mol-1·K-1；Ka為結(jié)合常數(shù)。

結(jié)合Ross和Subramanian利用小分子與蛋白質(zhì)反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)的變化判斷其作用力類型的規(guī)律[19-20]，由表3可知，ΔH＞0，ΔS＞0時(shí)結(jié)合作用力是疏水作用力，即ACN進(jìn)入BSA的疏水空腔內(nèi)部是利用疏水作用力完成的，進(jìn)而形成較穩(wěn)定的配合物。結(jié)合猝滅反應(yīng)的ΔG＜0和ΔH＞0，說明該反應(yīng)自發(fā)正向進(jìn)行。

表3 ACN與BSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)Table 3 Thermodynamic parameters of the interaction between ACN and BSA

2.1.1.4 ACN與BSA結(jié)合距離的計(jì)算 根據(jù)Forster偶極-偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移機(jī)理及下列關(guān)系式[11]：

式（5）中：F0是熒光發(fā)射強(qiáng)度，F(xiàn)是熒光發(fā)射體與熒光受體濃度比為1:1時(shí)的熒光強(qiáng)度，R0為臨界轉(zhuǎn)移能量距離，r為花青素與BSA結(jié)合時(shí)結(jié)合位置處BSA分子中熒光發(fā)射基團(tuán)之間的距離；式（6）中，K、N、φ、J分別表示偶極空間取向因子、介質(zhì)的折射常數(shù)、BSA的熒光量子產(chǎn)率、BSA的熒光發(fā)射譜與花青素的吸收光譜的重疊積分；式（7）中：F（λ）是BSA在波長λ處的熒光強(qiáng)度，ε（λ）是花青素在波長λ處的摩爾吸光系數(shù)。

在進(jìn)行非輻射能量轉(zhuǎn)移效率及結(jié)合距離的計(jì)算時(shí)，J值是通過實(shí)驗(yàn)濃度條件下猝滅劑ACN紫外譜和熒光體BSA的熒光譜重疊獲得（如圖3中陰影部分面積）。根據(jù)Forster能量轉(zhuǎn)移理論公式可以確定，K2、N-4、φ分別取1.5、1.36、0.15，ACN與BSA間的能量轉(zhuǎn)移效率E為9.43%，轉(zhuǎn)移效率為50%時(shí)的臨界距離R0為1 nm，ACN與BSA的結(jié)合距離為1 nm，小于7 nm，說明二者發(fā)生了非輻射能量轉(zhuǎn)移[21]。

圖3 BSA的熒光光譜與ACN的紫外吸收光譜重疊圖Fig.3 Overlapping absorbance spectra of ACN and fluorescence spectra of BSA

2.1.2 同步熒光分析 BSA分子中的酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸能產(chǎn)生熒光，但BSA的熒光強(qiáng)度主要取決于色氨酸殘基。蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度與其氨基酸殘基所處環(huán)境的極性密切相關(guān)，在蛋白質(zhì)的同步熒光光譜中，Δλ=15 nm表示的是酪氨酸殘基的光譜性質(zhì)，Δλ=60 nm表示的是色氨酸殘基的光譜性質(zhì)[6]。由圖4可知，隨著ACN濃度的增加，BSA熒光強(qiáng)度均下降，酪氨酸的熒光發(fā)射峰的位置紅移了2 nm，色氨酸的熒光發(fā)射峰的位置藍(lán)移了6 nm，表明ACN受到酪氨酸殘基的影響作用很小，主要受到色氨酸殘基的影響，則ACN與BSA的結(jié)合位點(diǎn)主要是色氨酸殘基。

2.1.3 位點(diǎn)競爭分析 朱國飛等[21]通過研究發(fā)現(xiàn)，布洛芬和華法林的結(jié)合位點(diǎn)主要是site II和site I，本實(shí)驗(yàn)分別采用布洛芬和華法林作為位點(diǎn)競爭探針，進(jìn)一步確定ACN在BSA上的結(jié)合位點(diǎn)。

由式（2）計(jì)算得知，無位點(diǎn)探針時(shí)結(jié)合常數(shù)為0.13，加入布洛芬后結(jié)合常數(shù)為0.084，加入華法林后結(jié)合常數(shù)為0.062。結(jié)合圖5可知，加入華法林后結(jié)合常數(shù)降低的幅度比加入布洛芬的大，說明華法林探針對(duì)ACN與BSA作用的影響效果更強(qiáng)，表明ACN與BSA結(jié)合位點(diǎn)是在site I。

圖4 ACN與BSA相互作用的同步熒光光譜Fig.4 Synchronous luorescence spectroscopy of the interaction between CAN and BSA

圖5 在不同探針下ACN與BSA相互作用圖Fig.5 Interaction diagram of ACN and BSA under different probes

2.2 紫外-可見吸收光譜分析

在小分子與蛋白質(zhì)相互作用的研究中，紫外-可見吸收光譜是常用的研究方法。BSA與不同濃度的ACN作用后的紫外吸收光譜圖如圖6所示。

由圖6可知，278 nm處的吸收峰是由BSA分子上的色氨酸和酪氨酸殘基的芳雜環(huán)π-π*躍遷引起的[22-23]，隨著ACN濃度的增加，BSA在278 nm處的吸收峰強(qiáng)度降低，同時(shí)伴隨著微小紅移，表明ACN的加入使BSA的構(gòu)象發(fā)生了變化，進(jìn)一步證明了ACN和BSA的作用類型以靜態(tài)猝滅為主。

圖6 BSA與ACN相互作用的紫外-可見吸收光譜Fig.6 UV-Vis absorption spectra of interaction between BSA and ACN

2.3 圓二色譜分析

為進(jìn)一步研究ACN對(duì)BSA構(gòu)象的影響，運(yùn)用圓二色譜進(jìn)行分析，ACN與BSA作用結(jié)果如圖7所示。

由圖7可知，BSA分子在208和222 nm處具有負(fù)峰，這是α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征吸收峰[23]，隨著加入ACN濃度的升高，這兩處的負(fù)峰所表示的摩爾橢圓率降低，表明ACN與BSA結(jié)合破壞了其分子內(nèi)氫鍵[24]，根據(jù)儀器自帶的CDNN計(jì)算軟件可知，隨著ACN濃度的增大，α-螺旋含量降低了3.1%，β-折疊含量增加了0.6%，疏水性降低，無規(guī)則卷曲含量降低了1.0%，推測ACN的加入使BSA分子的生理結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，所以發(fā)生了猝滅現(xiàn)象。

圖7 ACN與BSA作用的圓二色譜圖Fig.7 Circular dichroic diagram of ACN and BSA

2.4 紅外光譜分析

紅外光譜可以明確提供蛋白質(zhì)各二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的詳細(xì)數(shù)據(jù)，因而被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究。與蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)的有酰胺Ⅰ帶（1600～1700 cm-1）和酰胺Ⅱ帶（1500～1600 cm-1）[25-27]。酰胺Ⅰ帶主要由C=O鍵伸縮振動(dòng)引起，而酰胺Ⅱ帶由C-N的伸縮振動(dòng)和N-H的彎曲振動(dòng)造成，其中酰胺Ⅰ帶的研究價(jià)值更高[28]。

由于C=O雙鍵的存在，ACN與BSA中都含有酰胺Ⅰ帶。由圖8可知，加入ACN后，BSA的酰胺Ⅰ帶由1636.4 cm-1藍(lán)移到1637.3 cm-1，酰胺Ⅱ帶改變不明顯。所以隨著ACN濃度增加，酰胺Ⅰ帶的改變更明顯，進(jìn)一步證明ACN與BSA發(fā)生相互作用并對(duì)BSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響。

圖8 ACN對(duì)BSA紅外光譜的影響Fig.8 Influence of ACN on BSA by infrared spectrum

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在模擬生理環(huán)境的情況下，研究ACN與BSA結(jié)合機(jī)理及對(duì)BSA生理功能的影響。結(jié)果表明：ACN對(duì)BSA的猝滅類型是靜態(tài)猝滅，計(jì)算得到的熱力學(xué)參數(shù)說明二者間作用力類型是疏水作用力，反應(yīng)過程自發(fā)進(jìn)行。ACN與BSA結(jié)合位點(diǎn)數(shù)約為1，位于site I，此位點(diǎn)更接近于色氨酸殘基，ACN的加入引起B(yǎng)SA中酪氨酸殘基、色氨酸殘基所處的環(huán)境極性增強(qiáng)，從而改變了BSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使BSA的功能構(gòu)象發(fā)生變化。本研究為ACN在醫(yī)藥、食品及化妝品工業(yè)的發(fā)展提供了可靠的科學(xué)依據(jù)和實(shí)際參考價(jià)值。然而，本研究僅對(duì)ACN與BSA的作用機(jī)理進(jìn)行了探討，ACN的穩(wěn)定性及吸收效果還需進(jìn)一步研究。