EPO和CEPO對(duì)心肌梗死大鼠梗死面積和血管新生的作用的比較△

黃 妍 冮洪生 李 鳴 徐 標(biāo) 李文華

(1.武漢市第四醫(yī)院，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院急診內(nèi)科 武漢 430033；2.武漢市第四醫(yī)院，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院心血管內(nèi)科 武漢 430033)

心肌梗死是冠狀動(dòng)脈急性、持續(xù)性缺氧或缺血引起的心肌梗死，發(fā)病后能出現(xiàn)心肌重塑，并在數(shù)小時(shí)到發(fā)生變化，能引起大量中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，能造成梗死區(qū)心肌局部變薄、分化，從而加重心肌缺血[1]。血管新生最早由1971年在腫瘤生長(zhǎng)中提出，逐步被應(yīng)用于嚴(yán)重缺血性疾病的研究中。既往研究表明[2]，血管新生具有兩種模式，即芽生式、分割式兩種，而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是一種選擇作用血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞因子，主要由垂體濾泡星狀細(xì)胞核平滑肌細(xì)胞分泌、產(chǎn)生，能增加血管通透性、促進(jìn)血管新生最強(qiáng)烈的因子之一[3]。血管新生在心肌梗死的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用，但是其具體機(jī)制尚未闡明。氨甲酰促紅細(xì)胞生成素(CEPO)屬于是人體內(nèi)源性糖蛋白激素，能刺激紅細(xì)胞生成，廣泛用于獲得性免疫缺陷、貧血、惡性腫瘤中，并發(fā)揮了重要作用[4]。同時(shí)，CEPO在心臟缺血再灌注損傷時(shí)對(duì)心臟發(fā)揮保護(hù)作用[5]，但是對(duì)心肌梗死新生血管的影響研究較少。本研究以SD大鼠為研究對(duì)象，探討CEPO和EPO對(duì)心肌梗死大鼠梗死面積和新生血管的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物資料

購置SD大鼠40只為研究對(duì)象，隨機(jī)取SD大鼠10只設(shè)為空白對(duì)照組，剩余30只SD大鼠，采用左冠狀動(dòng)脈結(jié)扎誘導(dǎo)大鼠發(fā)生急性心肌梗死動(dòng)物模型，建模后隨機(jī)分為模型對(duì)照組、EPO組和CEPO組各10只。40只SD大鼠，雄性，體質(zhì)量200～250g，平均(230.00±10.00)g。動(dòng)物合格證號(hào)：SCXX-2005-0001，所選動(dòng)物均購置于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，完成大鼠的常規(guī)喂養(yǎng)、光照。

1.2 儀器與設(shè)備(表1)

表1 儀器與設(shè)備

1.3 方法

1.3.1動(dòng)物處理

(1)建模方法：40只SD大鼠隨機(jī)取10只設(shè)為空白對(duì)照組，剩余30只SD大鼠采用左冠狀動(dòng)脈結(jié)扎誘導(dǎo)大鼠發(fā)生急性心肌梗死動(dòng)物模型。具體方法如下：術(shù)前給予75%酒精消毒，并于左胸4～5肋骨部位作橫切口，從左側(cè)肋間鈍性分離并將胸腔打開，輕輕擠壓胸腔，并暴露心臟，將心包剪開，在肺動(dòng)脈圓錐與左心耳交界部位略低處給予無創(chuàng)性縫線完成左側(cè)冠狀動(dòng)脈前降支的結(jié)扎，并記錄II導(dǎo)聯(lián)心電圖，對(duì)于結(jié)扎部位以下心肌變白、搏動(dòng)減弱，且心電圖下可見ST段弓背明顯向上視為建模成功。建模后隨機(jī)分為模型對(duì)照組、EPO組和CEPO組。(2)處理方法：空白對(duì)照組和模型對(duì)照組在相同時(shí)期給予相同劑量的生理鹽水耳緣靜脈注射；CEPO在冠脈結(jié)扎后即刻耳緣靜脈注射CEPO(每周2次)，單次注射劑量為50ug/kg；EPO組在冠脈結(jié)扎后即刻耳緣靜脈注射EPO，注射劑量為0.3mg/kg。各組大鼠均完成1個(gè)月干預(yù)。

1.4 觀察指標(biāo)

(1)血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)：各組完成1個(gè)月干預(yù)后經(jīng)頸動(dòng)脈插管從BL-410生物技能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的血流動(dòng)力學(xué)模式下測(cè)大鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，包括：左心室收縮壓(LVSP)、心室收縮期室內(nèi)壓上升的最大速率(+dp/dtmax)、左心室舒張壓(LVDP)、心室舒張期室內(nèi)壓下降的最大速率(-dp/dtmax)水平[6～7]；(2)梗死面積：4組大鼠完成1個(gè)月干預(yù)后以斷頸方式處死大鼠，并取大鼠心臟，將左心室給予生理鹽水漂洗后儲(chǔ)存、備用。常規(guī)放置-20℃病學(xué)中凍融10min，沿著與心臟長(zhǎng)軸垂直方向從心尖向心底做2～3mm切片，并將其放置在37℃溫箱中完成20min染色；取出組織可見梗死心肌為白色，存活心肌為磚紅色，利用剪刀分離梗死區(qū)與非梗死區(qū)，常規(guī)稱重后完成梗死面積計(jì)算(梗死面積=左室梗死心肌質(zhì)量/左室結(jié)扎線下心肌質(zhì)量)[8]；(3)血管新生：采用免疫組織化學(xué)法測(cè)定各組血管新生情況，取上述制備的切片，常規(guī)水化后完成組織的修復(fù)，經(jīng)3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶的生物學(xué)活性，加入單克隆抗體CD34，常溫下15min孵育；向每張切片中加入DAB溶液100uL，沖洗后蘇木素復(fù)染；對(duì)于染成棕黃色血管內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)為一個(gè)血管計(jì)數(shù)，每張切片隨機(jī)取視野5個(gè)，計(jì)數(shù)梗死邊緣區(qū)新生血管數(shù)(MVD)，取平均值[9～10]。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 4組血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較

CEPO組干預(yù)后1個(gè)月LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax水平均高于模型對(duì)照組和EPO組(P<0.05)，LVDP水平低于模型對(duì)照組和EPO組(P<0.05)；EPO組干預(yù)后1個(gè)月LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax水平均高于模型對(duì)照組(P<0.05)，LVDP水平低于模型對(duì)照組(P<0.05)，見表2。

表2 4組血流動(dòng)力學(xué)比較

2.2 4組梗死面積比較

CEPO組干預(yù)后1個(gè)月梗死面積均小于模型對(duì)照組和EPO組(P<0.05)；EPO組干預(yù)后1個(gè)月梗死面積小于模型對(duì)照組(P<0.05)，見表3。

表3 4組梗死面積比較

2.3 4組血管新生比較

免疫組化結(jié)果表明：EPO組干預(yù)后1個(gè)月血管新生數(shù)多于模型對(duì)照組，但少于CEPO組(P<0.05)，免疫組化下染色顏色相對(duì)較淡；CEPO組干預(yù)后1個(gè)月血管新生數(shù)量多于其余各組(P<0.05)，見圖1。

圖1 4組免疫組化結(jié)果(×200)

3 討論

心力衰竭是由于各種心血管疾病發(fā)展的終末階段，且臨床已經(jīng)認(rèn)識(shí)到慢性心力衰竭發(fā)生、發(fā)展的病理基礎(chǔ)為心室重構(gòu)。心肌梗死患者發(fā)病后心室重構(gòu)能影響慢性心力衰竭發(fā)病率、死亡率[11]，因此積極采取措施阻斷心室重構(gòu)對(duì)預(yù)防心力衰竭的發(fā)生具有重要的意義。本研究以大鼠作為對(duì)象，建立心肌梗死動(dòng)物模型，并給予不同的措施干預(yù)，結(jié)果表明：CEPO組干預(yù)后1個(gè)月LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax水平均高于模型對(duì)照組和EPO組(P<0.05)，LVDP水平低于模型對(duì)照組和EPO組(P<0.05)，說明CEPO干預(yù)后能改善大鼠血流動(dòng)力學(xué)水平，利于大鼠恢復(fù)。CEPO在心肌細(xì)胞的凋亡、炎性反應(yīng)及心肌重構(gòu)等方面能發(fā)揮良好的抑制作用，有助于改善機(jī)體的心臟功能[12]。既往研究表明[13]：EPO除了能促進(jìn)紅細(xì)胞生成外，亦可發(fā)揮抗凋亡、促進(jìn)血管新生、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)等作用，對(duì)于腦組織、肝臟、腎臟等多個(gè)器官具有良好的保護(hù)作用。國外學(xué)者[14]進(jìn)行了一項(xiàng)離體心臟模型，結(jié)果表明：CEPO的使用能減輕心肌缺血再灌注損傷，能減輕心肌梗死面積；同時(shí)，CEPO亦可持續(xù)刺激血管新生，能維持心肌所需的營養(yǎng)與血供。本研究中，CEPO組干預(yù)后1個(gè)月梗死面積均小于模型對(duì)照組和EPO(P<0.05)；EPO組干預(yù)后1個(gè)月梗死面積小于模型對(duì)照組(P<0.05)，提示CEPO和EPO均縮小心肌梗死大鼠梗死面積。此外，國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)CEPO能抑制心室重構(gòu)，而改善心功能，亦可降低血漿內(nèi)皮素水平，抑制左心室重構(gòu)，且藥物安全性較高[15]。本研究中，免疫組化結(jié)果表明：CEPO組干預(yù)后1個(gè)月血管新生數(shù)量多于模型對(duì)照組和EPO組(P<0.05)，說明CEPO通過增加梗死部位血管新生數(shù)量，能保護(hù)心肌功能。

綜上所述，EPO和CEPO均能減少心肌梗死大鼠面積，但是后者效果更佳，能改善病灶部位血流動(dòng)力學(xué)水平，可能與血管新生有關(guān)，能為臨床治療提供參考依據(jù)。