PAK5與乳腺癌分子分型及臨床病理特征的相關(guān)性分析

鞏嬋嬋，李艷青，錢振華，展 瑞，湯 穎，陸夏良

2018年全球癌癥統(tǒng)計報告顯示乳腺癌發(fā)病人數(shù)約為210萬，占癌癥總發(fā)病率的11.6%[1]。乳腺癌是一種高度異質(zhì)性的腫瘤?！?011年早期乳腺癌基本治療國際專家共識》將乳腺癌分為四種分子亞型，即Luminal A、Luminal B、HER2過表達(dá)型及三陰型[2-3]。不同分子分型的乳腺癌在臨床特征、治療、預(yù)后等方面具有明顯差異[4-5]。PAK5是p21激活激酶(p21 activated kinase, PAK)家族中的一個成員，是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[6-7]。研究表明，PAK5可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，并通過影響NF-κB的磷酸化和核轉(zhuǎn)移來促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和調(diào)控其細(xì)胞周期[8]。GATA1可以通過PAK5信號通路誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的發(fā)生[9]。目前，PAK5在乳腺癌分子亞型中的表達(dá)差異及其與臨床病理特征的關(guān)系尚不明確。本實(shí)驗通過分析乳腺癌中PAK5表達(dá)與分子分型、TNM分期等之間的關(guān)系，探討PAK5在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用及其意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2012年5月～2015年4月蘇州市第九人民醫(yī)院存檔的手術(shù)切除的浸潤性乳腺癌標(biāo)本242例。所選病例納入標(biāo)準(zhǔn)：女性患者；病例資料、病理結(jié)果及隨訪資料均完整；術(shù)前未接受任何治療(包括化療、內(nèi)分泌治療及放療等)，患者為門診隨訪或電話隨訪，均自手術(shù)當(dāng)日起計算生存時間，無瘤生存期定義為自手術(shù)當(dāng)日至第一次發(fā)生局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的時間。排除標(biāo)準(zhǔn)：臨床、病理資料不完整；合并其他部位腫瘤。242例乳腺癌患者中，<50歲者91例，≥50歲者151例；腫塊最大徑≤2 cm者110例，>2 cm者132例；無腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者130例，有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者112例；組織學(xué)分級：Ⅰ級62例，Ⅱ級137例，Ⅲ級43例；TNM分期：Ⅰ期92例，Ⅱ期124例，Ⅲ+Ⅳ期26例。以50例乳腺癌癌旁組織作為對照，挑選乳腺癌標(biāo)本中具有代表性的石蠟組織進(jìn)行檢測。根據(jù)免疫組化替代分型(2013年St.Gallen乳腺癌會議國際共識)對收集的乳腺癌標(biāo)本進(jìn)行分子分型。

1.2 試劑EliVision免疫組化試劑盒購自福州邁新公司。一抗試劑如下：兔抗人PAK5多克隆抗體購自美國ABM公司，兔抗人HER2單克隆抗體(EP3)和鼠抗人Ki-67(7B11)、ER(6F11)、PR(16)單克隆抗體購自北京中杉金橋公司。

1.3 方法

1.3.1免疫組化 (1)病理切片在65 ℃恒溫箱中烤片2 h，依次在二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中浸泡20～30 min，無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ和80%乙醇內(nèi)各浸泡5 min，最后將切片浸入水中PBS沖洗；(2)切片上滴加檸檬酸緩沖液，置于微波爐進(jìn)行高溫修復(fù)后PBS沖洗，在切片上滴加50～100 μL 3%過氧化氫，37 ℃孵育20～30 min；0.05%胎牛血清室溫封閉30 min后甩干；(3)滴加50 μL稀釋后的一抗，4 ℃過夜；次日取出，復(fù)溫60 min，滴加二抗，37 ℃孵育30 min；(4)DAB顯色、蘇木精復(fù)染，封片后置于普通光鏡下觀察；(5)免疫組化結(jié)果判定：以胞膜、胞質(zhì)或胞核染為淡黃色至棕黃色為陽性細(xì)胞標(biāo)志。PAK5以胞質(zhì)、胞核呈棕黃色顆粒著色為陽性。(1)按染色強(qiáng)度評分：未著色為0分，弱陽性為1分，中等陽性為2分，強(qiáng)陽性為3分；(2)按染色細(xì)胞的百分比評分：1%～24%為1分，25%～49%為2分，50%～74%為3分，75%～100%為4分。將兩項得分結(jié)果相乘：0分為陰性，1～4為弱陽性，6～8為中等陽性，9～12為強(qiáng)陽性。將評分<6分定義為PAK5低表達(dá)組，評分≥6分定義為PAK5高表達(dá)組。ER和PR表達(dá)結(jié)果的判讀根據(jù)2010年ASCO/CAP發(fā)布的乳腺癌ER、PR免疫組化檢測指南。Ki-67結(jié)果判讀參照2011年國際乳腺癌Ki-67工作組共識。HER2免疫組化結(jié)果判讀根據(jù)2018年ASCO/CAP發(fā)布的檢測指南。

1.3.2熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH) 對于HER2免疫組化結(jié)果為(2+)的病例進(jìn)一步行FISH檢測，實(shí)驗采用DNA雙色熒光探針試劑盒，購自廣州安必平醫(yī)藥公司，根據(jù)HER2基因有無擴(kuò)增分別納入HER2陽性組和陰性組。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用配對χ2檢驗比較PAK5表達(dá)在乳腺癌與癌旁組織中的差異。采用χ2檢驗比較PAK5表達(dá)與乳腺癌各臨床病理參數(shù)及分子分型的關(guān)系。采用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗進(jìn)行生存分析，評估乳腺癌組織中PAK5表達(dá)與乳腺癌患者生存期之間的關(guān)系。采用Spearman等級相關(guān)分析乳腺癌組織中PAK5表達(dá)與ER、PR、HER2、Ki-67表達(dá)的相關(guān)性。以α=0.05作為檢驗水準(zhǔn)，雙側(cè)檢驗P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫表型242例乳腺癌中PAK5陽性者221例，陰性者21例(圖1)；50例癌旁組織中PAK5陽性者21例，陰性者29例。根據(jù)2013年St.Gallen國際共識的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行乳腺癌的分子分型：Luminal A型乳腺癌29例，Luminal B型乳腺癌133例，HER2過表達(dá)型乳腺癌50例，三陰型乳腺癌30例。

ABCD

2.2 乳腺癌及癌旁組織中PAK5的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示，PAK5在乳腺癌及癌旁組織中的陽性率分別為91.3%和42%；與癌旁組織相比，PAK5在乳腺癌組織中的表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 乳腺癌中PAK5表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系免疫組化結(jié)果顯示，乳腺癌組織中，PAK5高表達(dá)與乳腺癌腫塊大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及組織學(xué)分級具有相關(guān)性(P<0.05，表1)；與患者年齡無相關(guān)性(P>0.05，表1)。Kaplan-Meier生存分析顯示，與PAK5低表達(dá)組相比，PAK5高表達(dá)組的乳腺癌患者5年生存率較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

圖2 PAK5的表達(dá)與乳腺癌患者術(shù)后生存時間的關(guān)系

表1 乳腺癌中PAK5表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.4 PAK5表達(dá)與乳腺癌分子分型之間的關(guān)系Luminal A型乳腺癌中PAK5高表達(dá)者13例，高表達(dá)率為44.8%(13/29)，Luminal B型乳腺癌中PAK5高表達(dá)者87例，高表達(dá)率為65.4%(87/133)，HER2過表達(dá)型乳腺癌中PAK5高表達(dá)者33例，高表達(dá)率為66.0%(33/50)，三陰型乳腺癌中PAK5過表達(dá)者26例，高表達(dá)率為86.7%(26/30)。不同乳腺癌分子分型中PAK5的表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.009，表2)。進(jìn)一步的統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析表明：三陰型乳腺癌中PAK5高表達(dá)率高于Luminal A型、Luminal B型和HER2過表達(dá)型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.010，P=0.023，P=0.042)；Luminal B型中PAK5高表達(dá)率高于Luminal A型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.039)；PAK5在Luminal B型和HER2過表達(dá)型及Luminal A型和HER2過表達(dá)型中的表達(dá)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.941，P=0.066)。同時，與非三陰型乳腺癌相比，PAK5在三陰型乳腺癌中的表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表2 PAK5表達(dá)與乳腺癌分子分型的關(guān)系[n(%)]

2.5 PAK5表達(dá)與ER、PR、HER2、Ki-67表達(dá)的關(guān)系免疫表型顯示，ER、PR在乳腺癌組織中為胞核陽性。10%以上乳腺癌細(xì)胞呈強(qiáng)且完整的細(xì)胞膜著色為HER2陽性(3+)。免疫組化檢測HER2為(2+)的病例進(jìn)行FISH檢測，有HER2擴(kuò)增者判為HER2陽性。Ki-67表達(dá)<20%者歸為低表達(dá)組，≥20%者歸為高表達(dá)組。統(tǒng)計結(jié)果顯示，在乳腺癌組織中，PAK5表達(dá)與ER表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(Rho=-0.151，P<0.05，表3)；與PR表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(Rho=-0.163，P<0.05，表3)；與Ki-67的表達(dá)呈正相關(guān)(Rho=0.317，P<0.05,表3)；與HER2表達(dá)無明顯相關(guān)性(Rho=0.027，P>0.05，表3)。

表3 乳腺癌組織中PAK5與ER、PR、HER2及Ki-67表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

PAK5在子宮頸癌、卵巢癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，其高表達(dá)與腫瘤的進(jìn)展乃至耐藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)[10-11]。本組實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，PAK5表達(dá)與乳腺癌TNM分期等具有相關(guān)性，并與患者5年生存率呈負(fù)相關(guān)，對乳腺癌患者的預(yù)后有一定的指導(dǎo)意義。PAK5表達(dá)與乳腺癌分子分型具有相關(guān)性，與非三陰型乳腺癌相比，PAK5在三陰型乳腺癌中的表達(dá)增加。此外，Ki-67增殖指數(shù)在惡性腫瘤中的表達(dá)明顯增加，是患者預(yù)后的重要指標(biāo)。本實(shí)驗發(fā)現(xiàn)PAK5表達(dá)與Ki-67呈正相關(guān)。有研究表明，PAK5可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲，并影響乳腺癌細(xì)胞EMT的發(fā)生[8]。因此，PAK5在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的重要作用及分子機(jī)制值得進(jìn)一步的研究與探討。

關(guān)于PAK6的研究報道顯示，在正常及惡性前列腺細(xì)胞中，PAK6通過與AR通路相互作用調(diào)控AR的功能[12]。此外，PAK6可以與ERα結(jié)合并抑制其轉(zhuǎn)錄活性，并且在乳腺癌組織，這種結(jié)合可以在4-羥基他莫昔芬的作用下增強(qiáng)。PAK6與PAK5同屬PAKⅡ組成員，在結(jié)構(gòu)上有80%以上的同源性。在本組實(shí)驗中，PAK5表達(dá)與ER、PR表達(dá)具有相關(guān)性，PAK5與ER、PR具體的作用機(jī)制和PAK6與ERα及AR之間是否存在某種雷同的信號通路值得進(jìn)一步探索。PAKⅡ組與類固醇激素受體之間的聯(lián)系也將被更多的揭示。

綜上所述，雖然PAK5在乳腺癌中的研究被陸續(xù)報道，但仍比較缺乏，在本實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)PAK5與乳腺癌臨床病理特征、患者預(yù)后及分子分型等之間存在相關(guān)性，因此探究PAK5在乳腺癌中的分子機(jī)制將為乳腺癌的診斷及治療提供新靶點(diǎn)。