改良網(wǎng)狀纖維、麗春紅組合染色用于杯狀細(xì)胞染色效果的觀察

丁桂齡，鄭建明，劉艷芳，蔣 慧

網(wǎng)狀纖維染色在病理診斷中的應(yīng)用非常廣泛，特別是在協(xié)助腫瘤診斷和鑒別診斷中有較大幫助。目前，文獻(xiàn)報(bào)道網(wǎng)狀纖維染色應(yīng)用于杯狀細(xì)胞染色少見。作者經(jīng)過摸索，采用改良Gomori網(wǎng)狀纖維-麗春紅組合染色法用于顯示杯狀細(xì)胞效果較好，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料收集2019年7月海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院病理科送檢的經(jīng)外科手術(shù)切除的十二指腸標(biāo)本9例，標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定后取材，行常規(guī)流程制成3 μm厚石蠟切片，75 ℃烤片20 min。

1.2 主要試劑及配制(1)0.5%高錳酸鉀硫酸液：高錳酸鉀0.5 g，蒸餾水95 mL，加入3%硫酸液5 mL。(2)2%草酸液：草酸2 g，蒸餾水100 mL。(3)2%硫酸鐵銨液：鐵明礬2 g，蒸餾水100 mL。(4)改良Gomori氨性銀染液：A液，硝酸銀20 g，蒸餾水200 mL；B液，氫氧化鈉6 g，蒸餾水200 mL。取1個(gè)干凈的燒杯置于未啟動(dòng)的磁力攪拌器上，先加入20 mL完全溶解的A液，再加入20 mL完全溶解的B液，此時(shí)的混合液呈棕黑色。將干凈的磁珠放入燒杯內(nèi)，啟動(dòng)磁力攪拌器的開關(guān)，再用滴管緩慢滴加氨水，直至混合溶液變清亮為止，關(guān)閉磁力攪拌器，用蒸餾水將燒杯內(nèi)液體補(bǔ)足至200 mL。配好的改良Gomori氨性銀染液裝入棕色試劑瓶中，也可分裝為多份保存，置于4 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?5)0.2%氯化金：氯化金0.2 g，蒸餾水100 mL。(6)麗春紅苦味酸染色液[1]: 0.5%麗春紅S水溶液10 mL，苦味酸飽和水溶液90 mL。

1.3 染色方法組織切片經(jīng)脫蠟至水，0.5%高錳酸鉀硫酸液氧化5 min，自來水洗。2%草酸液漂白1 min，自來水洗。2%硫酸鐵銨液染1 min，蒸餾水洗。改良Gomori氨性銀染液滴染2 min，蒸餾水洗。10%甲醛液2 min，自來水洗。0.2%氯化金染1 min，自來水洗。麗春紅苦味酸染色液滴染3 min。直接用無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

2 結(jié)果

組織染色后可見：十二指腸黏膜分布數(shù)量不等的杯狀細(xì)胞，呈黑褐色或深粉褐色；杯狀細(xì)胞頂部胞質(zhì)內(nèi)的黏蛋白呈淡粉褐色；膠原纖維呈暗紅色；三者與周圍組織對(duì)比明顯，組織結(jié)構(gòu)層次清晰，染色鮮明，鏡下易辨認(rèn)(圖1、2)。

圖1 十二指腸杯狀細(xì)胞(紅箭頭)呈輪廓清晰的黑褐色或深粉褐色；杯狀細(xì)胞頂部胞質(zhì)內(nèi)的黏蛋白呈淡粉褐色(藍(lán)箭頭)；膠原纖維(黃箭頭)呈暗紅色、不規(guī)則彎曲狀分布；十二指腸腺(黑箭頭)呈粉褐色、腺狀排列，四者與周圍組織對(duì)比明顯，組織結(jié)構(gòu)層次清晰，染色鮮明、易辨認(rèn)，改良網(wǎng)狀纖維-麗春紅組合染色 圖2 十二指腸杯狀細(xì)胞(紅箭頭)呈輪廓清晰、界限分明的黑褐色或深粉褐色；杯狀細(xì)胞分泌的黏液(綠箭頭)呈粉褐色、噴射狀；杯狀細(xì)胞頂部胞質(zhì)內(nèi)的黏蛋白呈淡粉褐色(藍(lán)箭頭)，三者染色鮮明、極易辨認(rèn)，改良網(wǎng)狀纖維-麗春紅組合染色

3 討論

杯狀細(xì)胞是分布于黏膜上皮中的黏液分泌細(xì)胞，其頂部膨大，底部狹細(xì)，位于基膜上，頂部胞質(zhì)內(nèi)充滿內(nèi)含黏蛋白的黏原顆粒[2]。杯狀細(xì)胞的形態(tài)及其分泌物成分的改變，常與疾病的發(fā)生、發(fā)展等相關(guān)。HE和PAS染色常用于顯示杯狀細(xì)胞。HE染色后的杯狀細(xì)胞多呈淡染、空泡狀，與其它呈空泡性變化的組織難以區(qū)分。PAS染色后的杯狀細(xì)胞雖呈紫紅色，但十二指腸腺也會(huì)整體著色，該染色方法著染的成分較多且不具有特異性，對(duì)比染色也不鮮明。

采用網(wǎng)狀纖維染色顯示杯狀細(xì)胞的文獻(xiàn)報(bào)道較少。本文采用改良Gomori網(wǎng)狀纖維染色法能較好地顯示杯狀細(xì)胞，與其自身結(jié)構(gòu)及其分泌物的成分有關(guān)。杯狀細(xì)胞是一種典型的分泌黏蛋白的黏液細(xì)胞，其黏蛋白屬于黏多糖類物質(zhì)，是一種特殊的糖蛋白。網(wǎng)狀纖維染色原理[3]：基于網(wǎng)狀纖維表層包有一層特殊的糖蛋白，即酸性蛋白多糖，其與氨銀絡(luò)合物相互作用，后者經(jīng)甲醛醛基還原為金屬銀，銀離子沉淀于網(wǎng)狀纖維內(nèi)及其表面呈黑色。網(wǎng)狀纖維的染色方法較多，目前最常用Gordon-Sweets和Gomori染色法，兩者的原理都是基于網(wǎng)狀纖維的嗜銀性和銀氨染液浸染的原理。然而經(jīng)典染色法對(duì)杯狀細(xì)胞的染色效果并不理想。本文采用改良Gomori網(wǎng)狀纖維染色，既優(yōu)化了Gomori氨性銀染液的配制方法，又省去了2%硫代硫酸鈉染色步驟，還組合了麗春紅苦味酸染色液對(duì)膠原纖維進(jìn)行著色。本組染色后的杯狀細(xì)胞鏡下觀察更加直觀，背景對(duì)比更加清晰。染色過程中，需特別注意以下細(xì)節(jié)：(1)高錳酸鉀氧化的時(shí)間要適度，時(shí)間過短氧化不充分，時(shí)間過長組織易掉片。(2)草酸漂白時(shí)間要把握好，一旦肉眼可見組織變白，即可終止染色，否則長時(shí)間漂白組織易掉片。(3)改良Gomori氨性銀染液的配制和此步驟的染色反應(yīng)是關(guān)鍵。染液配置過程中，玻璃器皿必須干凈，臨用前建議再次用蒸餾水清洗器皿。A液和B液混合成C液時(shí)，建議在磁力攪拌器或其它混勻器上進(jìn)行，可使后續(xù)滴加氨水使混合液變清亮的反應(yīng)更易進(jìn)行。滴加氨水的量要適度，否則組織著色不佳。配制好的改良Gomori氨性銀染液，盛放在棕色試劑瓶中或分裝成多份置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。滴染改良Gomori氨性銀進(jìn)行染色，雖然節(jié)約試劑且能較好地控制染色反應(yīng)，但缺點(diǎn)是易形成銀顆粒沉淀和一層表面銀膜，故滴染時(shí)建議吸取改良Gomori氨性銀染液的上清液。(4)改良Gomori氨性銀染色后的蒸餾水清洗至關(guān)重要，建議將切片稍傾斜，將蒸餾水從傾斜后的切片上緣注入，待銀膜浮起后再迅速用蒸餾水沖洗切片。(5)甲醛的還原時(shí)間也要嚴(yán)格控制，否則著色不佳。(6)省去了常規(guī)網(wǎng)狀纖維染色中2%硫代硫酸鈉染色步驟，整體染色時(shí)間縮短。(7)選用0.5%麗春紅苦味酸S水溶液滴染組織，可以增強(qiáng)染色對(duì)比度，較好地觀察杯狀細(xì)胞與其周邊組織形態(tài)的變化和相互關(guān)系。

綜上所述，改良Gomori網(wǎng)狀纖維染色法對(duì)于杯狀細(xì)胞顯示特異性強(qiáng)，敏感性高，定位準(zhǔn)確，結(jié)果易于判讀。