七味活絡(luò)酊的制備及臨床應(yīng)用

艾東方 魏德紅 吳 韻 鄧 婷 杜 平

貴州省畢節(jié)市中醫(yī)院藥劑科，貴州 畢節(jié) 551700

肩關(guān)節(jié)周圍炎又稱肩周炎、凍結(jié)肩、五十肩等，是一種以肩臂疼痛和活動受限為主要特征的常見病。目前常用的治療方法有口服消炎鎮(zhèn)痛藥、中藥，阻滯、手術(shù)、熏洗、推拿、針灸、小針刀及功能鍛煉等[1-3]，但上述方法各有利弊，往往使用范圍局限，取效不佳。中藥酊劑是治療肩關(guān)節(jié)周圍炎最好的藥物[2,4]。因此，研究開發(fā)質(zhì)量可控、安全有效的相應(yīng)制劑已成為臨床的迫切需求。

七味活絡(luò)方是黔西北地區(qū)治療肩關(guān)節(jié)周圍炎的苗族秘方，由生扯攏、桃枝、山烏龜、細(xì)辛、草烏、豨薟草、冰片七味藥組成。傳統(tǒng)用藥方法是將方中藥味粉碎后，加上自釀糯米酒適量調(diào)敷患處，由于藥物制備使用簡單隨意，患者用藥后療效差異較大。本課題組在原組方的基礎(chǔ)上，加用適量氮酮與乙醇為輔料，采用浸漬法及溶解法制備成七味活絡(luò)酊；對該制劑的性狀、乙醇量、總固體等進(jìn)行測定，采用薄層色譜法對方中草烏和冰片進(jìn)行定性鑒別，并考察其穩(wěn)定性及皮膚刺激性，以控制七味活絡(luò)酊的內(nèi)在質(zhì)量；經(jīng)用七味活絡(luò)酊治療肩關(guān)節(jié)周圍炎患者，具有安全簡便、起效快、療效確切等特點?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器 FA1004電子天平(上海方瑞儀器有限公司)； AKD-310G液體相對密度、濃度測試儀(揚州艾科瑞德儀器儀表有限公司)；GC2010型氣相色譜儀(日本島津公司)。

1.2 藥品與試劑 生扯攏、桃枝、山烏龜藥材采自貴州省納雍縣，細(xì)辛、草烏、豨薟草、冰片飲片購自四川蜀善藥業(yè)有限公司，經(jīng)貴州省畢節(jié)市中醫(yī)院魏德紅副主任中藥師鑒定均為正品。氮酮(批號：20180712，上海市瑞新化學(xué)品有限公司)；75%乙醇(批號：20190201，中科圣陽生物科技股份有限公司)；硅膠G板(批號：20170801，青島海洋化工有限公司)；化學(xué)試劑均為分析純。

1.3 實驗動物 豚鼠5只，其中雌性3只，雄性2只，體重200～250 g，由南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場提供。試驗前2周飼養(yǎng)在清潔、噪聲低，燈光、溫度、濕度可控的房間，配備全價飼料及新鮮蔬菜，自行采食、飲水。

2 七味活絡(luò)酊的檢查及穩(wěn)定性

2.1 七味活絡(luò)酊的制備 取生扯攏40 g、桃枝30 g、山烏龜30 g、細(xì)辛40 g、草烏30 g、豨薟草30 g粉碎成粗粉，用粗粉重量4～5倍的75%乙醇作溶劑，浸漬48 h后，以2～3 mL/min速度緩緩滲漉，收集滲漉液備用；取冰片20 g及氮酮2 mL加入上述滲漉液中，攪勻使溶解，加75%乙醇調(diào)整至1000 mL，混勻，靜置，濾過，即得。

2.2 七味活絡(luò)酊的檢查 取3批(批號：20190606、20190611、20190613)七味活絡(luò)酊，檢查其性狀，并根據(jù)《中華人民共和國藥典》[5]方法進(jìn)行乙醇量、總固體、甲醇量、裝量、微生物限度檢查。

2.2.1 性狀 將3批適量的七味活絡(luò)酊分別置于無色透明玻璃容器內(nèi)，進(jìn)行觀察、嗅聞及品嘗。結(jié)果均為棕紅色澄清液體，氣芳香，味辛辣而清涼。

2.2.2 乙醇量 依照中國藥典2015年版四部通則0711乙醇量測定法項下蒸餾法的第二法進(jìn)行測定。對上述3批七味活絡(luò)酊進(jìn)行乙醇量測定，結(jié)果分別為64.3%、62.1%、59.7%。根據(jù)測定結(jié)果，暫定七味活絡(luò)酊含乙醇量的控制標(biāo)準(zhǔn)為55%～65%。

2.2.3 總固體 依照中國藥典2015年版四部通則0185酒劑項下總固體測定第二法進(jìn)行測定。對上述3批七味活絡(luò)酊進(jìn)行總固體測定，結(jié)果分別為10.67 mg/mL、10.87 mg/mL、10.63 mg/mL。根據(jù)測定結(jié)果，暫定七味活絡(luò)酊總固體的控制標(biāo)準(zhǔn)為每1 mL遺留殘渣不得少于10 mg。

2.2.4 甲醇量 依照中國藥典2015年版四部通則0871甲醇量檢查法項下第一法進(jìn)行測定。對上述3批七味活絡(luò)酊進(jìn)行甲醇量測定，結(jié)果分別為0.042%、0.037%、0.045%，均符合相關(guān)要求。

2.2.5 裝量 依照中國藥典2015年版四部通則0942最低裝量檢查法項下容量法進(jìn)行測定。七味活絡(luò)酊的標(biāo)示裝量為60 mL/瓶，抽取上述3批制劑進(jìn)行測定，裝量均未低于標(biāo)示裝量的97%，平均裝量分別為62.1 mL、61.9 mL、62.4 mL，結(jié)果符合相關(guān)要求。

2.2.6 微生物限度 依照中國藥典2015年版四部通則1105非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法和1106控制菌檢查法及1107非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)檢查，上述3批七味活絡(luò)酊需氧菌總數(shù)分別為87 cfu/mL、62 cfu/mL、93 cfu/mL，霉菌和酵母菌總數(shù)分別為79 cfu/mL、56 cfu/mL、83 cfu/mL，且均未檢出金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌(mL)，結(jié)果符合相關(guān)要求。

2.3 七味活絡(luò)酊的定性鑒別

2.3.1 草烏的薄層色譜鑒別[6]取3批七味活絡(luò)酊(批號：20190606、20190611、20190613)各60 mL，分別水浴蒸至30 mL，放冷，加氨試液調(diào)pH至9～10，用乙醚提取3次，每次10 mL，合并乙醚液，蒸干，殘渣加二氯甲烷1 mL使溶解，作為不同批次供試品溶液。另按處方稱取除草烏外的藥材，按制備工藝制成陰性樣品，同法制成陰性供試品溶液。取草烏藥材粉末2 g，加氨試液2 mL潤濕，加乙醚20 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液揮干，殘渣加二氯甲烷1 mL使溶解，作為對照品溶液。按中國藥典2015年版四部通則0502薄層色譜法，吸取上述5種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G板上，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇(6.4∶3.6∶1)為展開劑，置氨蒸氣飽和20分鐘的展開缸內(nèi)，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液。薄層色譜中，在與對照藥材相對應(yīng)的位置，不同批次供試品均顯兩個相同棕黃色的主斑點，陰性供試品無此斑點，說明陰性樣品無干擾。如圖1所示。

2.3.2 冰片的薄層色譜鑒別[7]取3批七味活絡(luò)酊(批號：20190606、20190611、20190613)各10 mL，分別加乙醚7 mL，取上層溶液，50 ℃濃縮至3 mL，作為不同批次供試品溶液。另按處方稱取除冰片外的藥材，按制備工藝制成陰性樣品，同法制成陰性供試品溶液。取冰片飲片0.2 g，加乙醇2 mL使溶解，作為對照品溶液。按中國藥典2015年版四部通則0502薄層色譜法，吸取上述5種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯(8.5∶1.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，105 ℃烘至斑點顯色清晰。薄層色譜中，在與對照藥材相應(yīng)的位置，不同批次供試品均顯相同顏色的斑點，陰性供試品無此斑點，說明陰性樣品無干擾。如圖2所示。

2.4 七味活絡(luò)酊的穩(wěn)定性試驗 參照中藥新藥質(zhì)量穩(wěn)定性研究的技術(shù)要求[8]，將3批(批號：20190606、20190611、20190613)七味活絡(luò)酊各取適量，分別置于無色透明的玻璃容器內(nèi)，密封，并標(biāo)識為1、2、3不同編號的供試品，室溫放置，于0、1、2、3個月進(jìn)行取樣，按“2.2七味活絡(luò)酊的檢查”項下方法，觀測其相關(guān)項目。結(jié)果3批供試品的性狀在不同觀測時間均未見變化，乙醇量、總固體也無明顯改變，說明七味活絡(luò)酊具有良好的初步穩(wěn)定性。見表1。

表1 穩(wěn)定性試驗結(jié)果 (n=3)

2.5 七味活絡(luò)酊的皮膚刺激性試驗 參照外用藥皮膚刺激性試驗的研究[8]，取健康豚鼠5只，給藥前24小時將其背脊左右各去毛約3 cm×3 cm(去毛后無紅斑、水腫、皮損等異常)，在各豚鼠去毛皮膚左側(cè)涂抹七味活絡(luò)酊1 mL，右側(cè)涂抹用2 mL氮酮加入75%乙醇1000 mL中制成的空白七味活絡(luò)酊1 mL，二層紗布覆蓋，繃帶固定，24 h后除去紗布，以溫水洗去左右側(cè)殘留物，觀察1、24、48、72 h后皮膚刺激反應(yīng)及恢復(fù)情況，與右側(cè)比較，并按皮膚刺激反應(yīng)及皮膚刺激強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分與評價。結(jié)果5只豚鼠中有2只在用藥后24 h觀察，可見輕微紅斑，1只可見輕微水腫，其他時間觀察均未見異常，說明七味活絡(luò)酊對豚鼠皮膚無明顯刺激性。

3 七味活絡(luò)酊的臨床試驗

3.1 診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[9]及《肩周炎》[2]相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制訂。①患者50歲左右，常有風(fēng)濕寒邪侵襲史或外傷史。②肩部疼痛及活動痛，夜間加重，可放射到手，但無感覺異常。③肩關(guān)節(jié)活動受限，以上舉、前伸、外展為甚。④肩周肌肉痙攣或萎縮，肩周有廣泛壓痛。⑤ⅹ線及化驗檢查常無異常發(fā)現(xiàn)。

3.2 納入標(biāo)準(zhǔn) 符合診斷標(biāo)準(zhǔn)的住院和門診病例均入選，并對門診病例嚴(yán)控可變因素；患者簽署知情同意書。

3.3 排出標(biāo)準(zhǔn)[10]嚴(yán)重心腦疾患或臟器衰竭者；出血傾向者；頸椎病致上肢放射性疼痛者；局部軟組織有炎癥破損者；精神病患者。

3.4 試驗設(shè)計 采用隨機(jī)、雙盲、安慰劑平行對照臨床試驗方法。按患者就診順序，依次交叉分別納入治療組和安慰劑組，由臨床試驗負(fù)責(zé)人保存盲底及揭盲。

3.5 樣本含量 樣本含量為65例，分為治療組(七味活絡(luò)酊組)33例，其中男7例，女26例；安慰劑組32例，其中男8例，女24例。兩組年齡均為40～65歲。

3.6 干預(yù)措施 兩組分別用七味活絡(luò)酊或安慰劑涂擦患處，2～5 mL/次，3～5次/d，療程均為7 d，期間不使用其他治療肩關(guān)節(jié)周圍炎的藥物或方法。安慰劑為七味活絡(luò)酊輔料加色素制成，外觀與七味活絡(luò)酊基本一致。

3.7 療效評分 將涵蓋各評分項目且隱去分?jǐn)?shù)的肩關(guān)節(jié)周圍炎療效評定量表[11]給患者，由患者根據(jù)自己狀況在相應(yīng)的方框中打“?”后，交給研究者對各項目添加分?jǐn)?shù)，分別對患者的日常生活能力、肩關(guān)節(jié)活動能力、肩關(guān)節(jié)疼痛程度進(jìn)行評分，并計算各項目之總分。

3.8 療效評價標(biāo)準(zhǔn) 以各項目總分作為療效評價標(biāo)準(zhǔn)：治愈：80～100分；好轉(zhuǎn)：50～80分；未愈：50分以下。

3.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料采用χ2檢驗，計量資料采用Wilcoxon秩和檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3.10 兩組治療情況比較

3.10.1 總有效率比較 治療組的總有效率明顯高于安慰劑組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明七味活絡(luò)酊治療肩關(guān)節(jié)周圍炎為有效的康復(fù)治療方法。見表2。

表2 治療組與安慰劑組臨床療效比較 (例)

3.10.2 日常生活能力評分比較 治療組優(yōu)于安慰劑組(P<0.05)，說明治療組更能改善患者的日常生活能力。見表3

表3 治療組與安慰劑組日常生活能力評分 (分，

3.10.3 肩關(guān)節(jié)活動功能評分比較 治療組高于安慰劑組(P<0.05)，說明治療組患者的肩關(guān)節(jié)活動功能得到了改善。見表4。

表4 治療組與安慰劑組肩關(guān)節(jié)活動功能評分 (分，

3.10.4 肩關(guān)節(jié)疼痛評分比較 治療組與安慰劑組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明治療組減輕肩關(guān)節(jié)疼痛程度優(yōu)于安慰劑組。見表5。

表5 治療組與安慰劑組肩關(guān)節(jié)疼痛評分 (分，

3.10.5 不良反應(yīng)比較 治療組與安慰劑組均未見不良反應(yīng)。

4 討論

肩關(guān)節(jié)周圍炎多發(fā)生于50歲左右的中老年人，常與外傷或受涼、肩關(guān)節(jié)慢性勞損等有關(guān)。本病屬祖國醫(yī)學(xué)的“痹證”范疇，年老體弱，氣血虛損，風(fēng)、寒、濕邪侵入關(guān)節(jié)，致局部經(jīng)脈閉塞、氣滯血瘀，故“不通則痛”。根據(jù)其癥狀演變可分為疼痛期、僵硬期及緩解期。肩關(guān)節(jié)周圍炎治療的主要目的是緩解疼痛、恢復(fù)關(guān)節(jié)活動度及緩解臨床癥狀，以提高患者的生活質(zhì)量和滿意度[12]。

七味活絡(luò)酊處方中生扯攏祛風(fēng)除濕，桃枝活血通絡(luò)，山烏龜清熱解毒、散瘀止痛，細(xì)辛解表散寒、祛風(fēng)止痛、通竅，草烏祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)止痛，豨薟草祛風(fēng)濕、利關(guān)節(jié)，冰片開竅、止痛消腫。諸藥合用，可以起到祛風(fēng)除濕、活血通絡(luò)、散瘀止痛的作用。同時，方中冰片及所用輔料氮酮和乙醇均有一定的促滲作用，能促使中藥活性成分透過角質(zhì)層屏障，作用于局部病灶及毛細(xì)血管，增強(qiáng)七味活絡(luò)酊的靶向作用[4]。

本研究對七味活絡(luò)酊作性狀、乙醇量、總固體等檢查，并采用薄層色譜法定性鑒別其中草烏和冰片，能保證制劑質(zhì)量符合2015年版《中國藥典》(四部)的相關(guān)要求。選用現(xiàn)有多種肩關(guān)節(jié)周圍炎療效評定標(biāo)準(zhǔn)中的“肩關(guān)節(jié)周圍炎療效評定量表”作為療效評定工具，具有較為科學(xué)、客觀、規(guī)范、簡便等優(yōu)勢，能對患者的治療效果進(jìn)行較為全面的評價[11]。試驗結(jié)果表明，經(jīng)優(yōu)化工藝制備的七味活絡(luò)酊有良好的初步穩(wěn)定性，對豚鼠皮膚無明顯刺激，草烏、冰片鑒別薄層色譜分離效果較好、斑點顯色清晰；七味活絡(luò)酊用于臨床，在改善患者的日常生活能力、肩關(guān)節(jié)活動功能，緩解患者的肩關(guān)節(jié)疼痛及有效率幾方面，均明顯優(yōu)于安慰劑(P<0.05)，且未見不良反應(yīng)。研究還發(fā)現(xiàn)，七味活絡(luò)酊組33例患者首次用藥后，大多即刻減輕疼痛并恢復(fù)部分肩關(guān)節(jié)活動功能，說明該制劑具有吸收快、作用迅速等特點。

綜上所述，本研究對七味活絡(luò)酊的制備及臨床應(yīng)用提供了一定的方法和證據(jù)支持，為該制劑的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。本課題組將從七味活絡(luò)酊的制備工藝、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)、療效評定標(biāo)準(zhǔn)、大樣本患者的治療效果等方面進(jìn)行更深入的研究，以完善尚存不足，提高其應(yīng)用性。