花旗參茶對小鼠免疫功能的影響

李雅琦,陳斯琪,余孝云,尚 強(qiáng),3,伍 彪,聶 克,*

(1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院,廣東廣州 510006; 2.健康藥業(yè)(中國)有限公司,廣東珠海 519090; 3.國家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心,廣東珠海 519090)

西洋參又名花旗參,為五加科植物西洋參(PanaxquinquefoliumL.)的干燥根,具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、清熱生津等功效,臨床用于治療氣虛陰虧、虛熱煩倦、咳喘痰血、內(nèi)熱消渴、口燥咽干等癥[1-2]。西洋參作為藥食兩用的中藥材,其飲片常被用來泡水當(dāng)茶飲用,以達(dá)到養(yǎng)生保健等目的。

花旗參茶是用西洋參飲片經(jīng)現(xiàn)代工藝提取后制成的顆粒劑,與飲片泡水服用相比,具有有效成分利用率高、便于攜帶、即沖即飲等優(yōu)點(diǎn)。前期研究發(fā)現(xiàn)[3],花旗參茶具有較好的抗氧化活性,可保護(hù)乙醇誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷。為進(jìn)一步闡明花旗參茶營養(yǎng)與保健功能的作用機(jī)制,本文采用原國家食品藥品監(jiān)督管理總局《增強(qiáng)免疫力功能評價(jià)方法(征求意見稿)》中規(guī)定的正常小鼠實(shí)驗(yàn)方案[4],觀察了花旗參茶對小鼠免疫功能的影響,并與西洋參飲片泡水服用對免疫功能的影響進(jìn)行了比較。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一門新興學(xué)科,因其整體性和系統(tǒng)性的分析特點(diǎn)與中醫(yī)藥防治疾病的整體觀相吻合[5],近年來被廣泛應(yīng)用于闡明中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、配伍規(guī)律、作用機(jī)制等研究[6-7]。本文同時利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法進(jìn)一步探究了花旗參茶的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級BALB/c小鼠 300只,雄性,16～18 g,購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,實(shí)驗(yàn)動物許可證號SCXK(粵)2018-0002;花旗參茶、西洋參飲片 健康藥業(yè)(中國)有限公司;刀豆蛋白(Concanavalin A,ConA) 美國sigma公司;2-巰基乙醇 美國Gibco公司;新生牛血清 浙江天杭生物科技股份有限公司;2,4-二硝基氟苯(1-fluoro-2,4-dinitrobenzene,DNFB) 上海麥克林生物科技有限公司;印度墨汁 大連美侖生物;羧酸基修飾熒光微球 美國Invitrogen公司;無菌脫纖維綿羊血 北京索萊寶科技有限公司;都氏試劑 上海羽朵生物科技有限公司;SA緩沖液 北京雷根生物技術(shù)有限公司;乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測試劑盒和MTT 碧云天生物技術(shù)有限公司;YAC-1小鼠淋巴瘤細(xì)胞 中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

CLM-170B-8-NF型CO2培養(yǎng)箱 新加坡Esco公司;Eppendorf 5811型高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司;UV-2310 II型紫外可見分光光度計(jì) 上海天美科學(xué)儀器有限公司;CytoFlex流式細(xì)胞儀 澳大利亞Beckman Coulter公司;CKX41型倒置相差顯微鏡 日本奧林巴斯株式會社。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 西洋參飲片泡水樣品凍干粉的制備 參考文獻(xiàn)[3],取西洋參飲片200 g,加適量沸水浸泡3次,每次5 min,合并三次浸泡液,過濾濃縮,冷凍干燥,得凍干粉40 g。

1.2.2 動物分組與給藥 小鼠分5批飼養(yǎng),每批60只,分別用于:①遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng);②小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn);③小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球?qū)嶒?yàn);④ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和NK細(xì)胞活性測定實(shí)驗(yàn);⑤抗體生成細(xì)胞檢測和半數(shù)溶血值HC50測定實(shí)驗(yàn)。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,隨機(jī)分為5組:陰性對照組、花旗參茶低、中、高劑量組和西洋參飲片泡水組,每組12只,各組分別灌胃給以蒸餾水、花旗參茶1.5、3、6 g/kg和泡水凍干粉0.1 g/kg(給藥劑量換算方法同文獻(xiàn)[3],成人體重以60 kg計(jì),參茶成人每日推薦用量為9 g,則人的用量為0.15 g/kg體重,依據(jù)藥效研究中人與小鼠給藥劑量的換算方法[8],小鼠參茶給藥劑量分別相當(dāng)于人用藥量的10、20、40倍,每3 g花旗參茶顆粒相當(dāng)于原生藥0.55 g,則分別相當(dāng)于0.275、0.550、1.100 g生藥/kg體重;西洋參飲片成人每日用量為3 g[1],則人用量為0.5 g/kg體重,小鼠給藥劑量相當(dāng)于人用量的10倍,1 g凍干粉相當(dāng)于5 g原生藥,則相當(dāng)于0.500 g生藥/kg體重)。各組小鼠灌胃容積均為20 mL/kg,每天1次,連續(xù)灌胃4周。每周稱量動物體重,并根據(jù)體重調(diào)整灌胃劑量。

1.2.3 臟器系數(shù)測定 連續(xù)灌胃給藥28 d,稱量體重后脫頸椎處死小鼠,取胸腺和脾臟并稱重,計(jì)算臟器質(zhì)量與體重的比值分別作為胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)。

1.2.4 細(xì)胞免疫功能測定

1.2.4.1 ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) 灌胃至28 d,頸椎脫臼處死小鼠,無菌取脾,制備脾細(xì)胞懸液,用Hank’s液洗2次(1000 r/min,10 min),用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106cell/mL,分兩孔(1 mL/孔)加至24孔板中,試驗(yàn)孔加入75 μL ConA液(0.1 mg/mL),對照孔不作處理。置于CO2培養(yǎng)箱5% CO2、37 ℃培養(yǎng)68 h后,每孔吸去上清0.7 mL,加入RPMI 1640培養(yǎng)液0.7 mL和MTT(5 mg/mL)50 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入1 mL酸性異丙醇,吹打至紫色結(jié)晶完全溶解后分裝至96孔板中,570 nm處測定吸光度,以試驗(yàn)孔與對照孔的吸光度差值表示淋巴細(xì)胞的增殖能力。

1.2.4.2 DNFB誘導(dǎo)的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng) 灌胃至23 d,每鼠腹部皮膚用硫化鋇飽和水溶液脫毛,范圍約3 cm×3 cm,用50 μL DNFB溶液(10 mg/mL)均勻涂抹腹部皮膚致敏。5 d后,取10 μL DNFB溶液均勻涂抹于小鼠右耳兩面進(jìn)行攻擊。24 h后頸椎脫臼處死小鼠,用打孔器取下直徑8 mm的耳片,稱重后計(jì)算耳腫脹率。

1.2.5 體液免疫功能測定

1.2.5.1 抗體生成細(xì)胞檢測 灌胃至28 d,腹腔注射2%綿羊紅細(xì)胞(Sheep red blood cell,SRBC)免疫小鼠,0.2 mL/只。5 d后,無菌取脾制備脾細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106cell/mL。向六孔板中加入含0.5%瓊脂糖的生理鹽水制備底層培養(yǎng)基。將含0.5%瓊脂糖的Hank’s液以0.5 mL/管加至50 ℃的恒溫試管中備用。取50 μL 20% SRBC及200 μL脾細(xì)胞懸液先后加入恒溫試管中,立即混勻,倒入六孔板中,鋪平后放入CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h,每孔加入500 μL以完全培養(yǎng)基稀釋11倍的補(bǔ)體,繼續(xù)培養(yǎng)2 h,吸除上層液體,拍照,用Image J軟件統(tǒng)計(jì)每孔溶血空斑數(shù),結(jié)果以空斑數(shù)/106脾細(xì)胞表示[9]。

1.2.5.2 半數(shù)溶血值HC50的測定 灌胃至28 d,腹腔注射2% SRBC免疫小鼠,0.2 mL/只。4 d后,眼眶取血制備血清,取SA緩沖液稀釋200倍后的血清1 mL于試管內(nèi),依次加入0.5 mL 10%SRBC,1 mL SA液稀釋9倍的補(bǔ)體。對照管以SA液代替血清。37 ℃恒溫水浴20 min,冰浴終止反應(yīng)。2000 r/min離心10 min,取1 mL上清液,加3 mL都氏試劑,同時取0.25 mL 10%SRBC加3.75 mL都氏試劑作為半數(shù)溶血對照管,充分混勻,靜置10 min后,以對照管作空白,540 nm波長處,測定各管吸光度。

1.2.6 單核-巨噬細(xì)胞功能測定

表1 花旗參茶對小鼠體質(zhì)量的影響(g)Table 1 The effects of American Ginseng tea on the body weight of mice(g)

1.2.6.1 碳廓清實(shí)驗(yàn) 灌胃至30 d,從小鼠尾靜脈注入以生理鹽水稀釋4倍的印度墨汁,0.1 mL/10 g體質(zhì)量。墨汁注入后2 min(t1)、10 min(t2),先后從眼內(nèi)眥取血20 μL,立即加至2 mL 0.1% Na2CO3溶液中,混勻。以0.1% Na2CO3溶液作空白,用分光光度計(jì)在600 nm波長處分別測得光密度值(OD1、OD2)。頸椎脫臼處死小鼠,取肝臟和脾臟,稱重,以吞噬指數(shù)表示小鼠碳廓清能力[10]。

式中:t1、t2表示墨汁注入時間,min;OD1、OD2表示在t1、t2時間點(diǎn)取樣測得的光密度值

1.2.6.2 腹腔巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球?qū)嶒?yàn) 灌胃至24 d時,每只小鼠腹腔注射0.2 mL 2% SRBC以激活小鼠巨噬細(xì)胞,4 d后頸椎脫臼處死小鼠,剪開腹部皮膚暴露腹膜,腹腔注射含5%小牛血清的Hank’s液3 mL/只,輕揉腹部20次,將腹膜剪開一個小口,吸取2 mL腹腔液經(jīng)200目篩過濾至試管內(nèi),調(diào)整巨噬細(xì)胞數(shù)為4×105～6×105cell/mL。將稀釋好的細(xì)胞懸液以1 mL/孔加至6孔板中,加入1%BSA預(yù)調(diào)理過的熒光微球(1×107/板),置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育90 min,用預(yù)冷的PBS緩沖液輕輕洗滌2次(1000 r/min,5 min),加入PBS緩沖液0.3 mL,用細(xì)胞刮刮下貼壁細(xì)胞,吹打均勻,經(jīng)200目篩過濾后用流式細(xì)胞儀檢測,用CytExpert2.0軟件分析統(tǒng)計(jì)未吞噬熒光微球和吞噬不同數(shù)量熒光微球的巨噬細(xì)胞的比例,計(jì)算熒光微球吞噬百分率和吞噬指數(shù)[11]。

1.2.7 NK細(xì)胞活性測定 灌胃至28 d,脫頸椎處死小鼠,無菌取脾,制備單細(xì)胞懸液。經(jīng)200目篩過濾至10 mL離心管中,Hank’s液洗2次(1000 r/min,10 min),棄上清,裂解紅細(xì)胞后加入8 mL Hank’s液,1000 r/min離心10 min,棄上清,用完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107cell/mL。按50∶1的效靶比將靶細(xì)胞(YAC-1細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)前24 h傳代)和效應(yīng)細(xì)胞(脾細(xì)胞)各100 μL,加至U型96孔培養(yǎng)板中,靶細(xì)胞自然釋放孔和靶細(xì)胞最大釋放孔中均加入靶細(xì)胞和完全培養(yǎng)液各100 μL;背景空白孔中加入完全培養(yǎng)液200 μL。上述各項(xiàng)均設(shè)三個復(fù)孔,于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h后,向靶細(xì)胞最大釋放孔中加入20 μL LDH釋放試劑,吹打混勻,繼續(xù)培養(yǎng)1 h。將培養(yǎng)板靜置10 min,每孔吸取100 μL加至平底96孔板中,同時加入LDH檢測工作液50 μL,避光反應(yīng)30 min,在酶標(biāo)儀490 nm波長處測定吸光度(OD)[12]。按下式計(jì)算NK細(xì)胞活性:

NK細(xì)胞活性(%)=(反應(yīng)孔OD值-自然釋放孔OD值)/(最大釋放孔OD值-自然釋放孔OD值)×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 花旗參茶對小鼠體質(zhì)量的影響

在實(shí)驗(yàn)周期各時間點(diǎn),花旗參茶低、中、高劑量組及西洋參飲片泡水組小鼠體質(zhì)量與陰性對照組相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。說明花旗參茶和西洋參飲片泡水在實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)對體重均無顯著影響。具體數(shù)值見表1。

2.2 花旗參茶對小鼠臟器系數(shù)的影響

胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)反映了免疫器官的發(fā)育情況,間接體現(xiàn)了機(jī)體的免疫水平[13]。由表2可知,給予受試物4周,花旗參茶三個劑量及參片泡水組小鼠的胸腺系數(shù)在數(shù)值上均有升高趨勢,但與陰性對照組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)?；ㄆ靺⒉枞齻€劑量及參片泡水組小鼠脾臟系數(shù)在數(shù)值上均有升高,其中僅花旗參茶高劑量組與陰性對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。說明花旗參茶可以在一定程度上提高脾臟系數(shù)。

表2 花旗參茶對小鼠臟器系數(shù)的影響Table 2 Effects of American Ginseng tea on the organ coefficient of mice

2.3 花旗參茶對小鼠細(xì)胞免疫功能的影響

有絲分裂原ConA刺激T淋巴細(xì)胞增殖產(chǎn)生效應(yīng)T細(xì)胞,發(fā)揮細(xì)胞免疫功能[14]。遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)是由效應(yīng)T細(xì)胞介導(dǎo)的以單核細(xì)胞損傷為主的炎癥反應(yīng),炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度可間接體現(xiàn)細(xì)胞免疫能力[15]。

花旗參茶三個劑量組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力均高于陰性對照組,其中花旗參茶中、高劑量組與陰性對照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。西洋參飲片泡水組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力也高于陰性對照組,但與陰性對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

花旗參茶三個劑量組小鼠耳腫脹率均高于陰性對照組,且呈明顯的量效關(guān)系。其中花旗參茶中、高劑量、西洋參飲片泡水組與陰性對照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(分別為P<0.05,P<0.01,P<0.05)。具體數(shù)值見表3。

以上結(jié)果表明,花旗參茶可劑量依賴性地提高小鼠細(xì)胞免疫功能,其中參茶中劑量(0.500 g生藥/kg)的作用效果優(yōu)于西洋參飲片泡水(0.550 g生藥/kg)的作用效果,說明在同等劑量下,花旗參茶對細(xì)胞免疫的增強(qiáng)作用優(yōu)于西洋參飲片泡水服用。

表3 花旗參茶對小鼠細(xì)胞免疫功能的影響Table 3 Effects of American Ginseng tea on cellular immunity of mice

2.4 花旗參茶對小鼠體液免疫功能的影響

B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫是機(jī)體特異性免疫的重要組成部分,抗體生成細(xì)胞數(shù)及血清溶血素含量是反應(yīng)機(jī)體體液免疫能力的重要指標(biāo)[16]。由表4可知,所有給藥組的溶血空斑數(shù)均高于陰性對照組,但只有花旗參茶高劑量和低劑量組的溶血空斑數(shù)與陰性對照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(分別P<0.01,P<0.05)。與陰性對照組相比,僅花旗參茶高劑量組可極顯著提高血清溶血素水平(P<0.01)。說明只有高劑量的花旗參茶可以同時提高抗體生成細(xì)胞數(shù)及血清溶血素含量,具有增強(qiáng)體液免疫的能力。

表4 花旗參茶對小鼠體液免疫功能的影響Table 4 Effects of American Ginseng tea on the humoral immunity of mice

2.5 花旗參茶對小鼠單核-巨噬細(xì)胞功能的影響

單核-巨噬細(xì)胞是機(jī)體非特異性免疫防御的重要細(xì)胞,小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球?qū)嶒?yàn)是測定小鼠單核-巨噬吞噬功能經(jīng)典實(shí)驗(yàn),其結(jié)果反映了機(jī)體非特異性免疫應(yīng)答的能力[17]。

花旗參茶各劑量組小鼠的碳廓清能力均高于陰性對照組,其中花旗參茶中劑量組、高劑量組與陰性對照組比較具有極顯著差異和顯著性差異(分別為P<0.01,P<0.05)。泡水組小鼠的吞噬指數(shù)也高于陰性對照組,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

花旗參茶各劑量組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞熒光微球吞噬百分率均高于陰性對照組,且呈明顯的量效關(guān)系,其中花旗參茶中、高劑量組與陰性對照組比較差異極顯著(P<0.01)。西洋參飲片泡水組小鼠吞噬百分率也高于陰性對照組,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。計(jì)算各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞熒光微球吞噬指數(shù),與吞噬百分率結(jié)果相似,花旗參茶中、高劑量組與陰性對照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(分別為P<0.05,P<0.01)。具體數(shù)值見表5。

以上結(jié)果提示,花旗參茶可通過增強(qiáng)單核-巨噬細(xì)胞的吞噬功能,提高機(jī)體非特異性免疫力,且在同等劑量下的作用效果優(yōu)于西洋參飲片泡水服用。

2.6 花旗參茶對小鼠NK細(xì)胞活性的影響

NK細(xì)胞是介導(dǎo)非特異性免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞,具有抗原非特異性殺傷能力[14]。由表6可知,給予受試物4周,花旗參茶三個劑量組及西洋參飲片泡水組小鼠NK細(xì)胞活性在數(shù)值上均高于陰性對照組,其中僅高劑量組與陰性對照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),表明高劑量的花旗參茶可增強(qiáng)NK細(xì)胞活性。

表5 花旗參茶對小鼠單核-巨噬細(xì)胞功能的影響Table 5 Effects of American Ginseng tea on the monouclear macrophage function of mice

表6 花旗參茶對小鼠NK細(xì)胞活性的影響Table 6 Effects of American Ginseng tea on the NK cell activity of mice

2.7 作用機(jī)制分析

采用TCMSP數(shù)據(jù)庫[18](http://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索花旗參茶的原料藥西洋參中的活性成分及作用靶點(diǎn),以藥物口服利用度OB≥30%,類藥性DL≥0.18為篩選標(biāo)準(zhǔn),得到9種活性成分,含β-谷甾醇和人參皂苷Rh2等(見表7)。

表7 花旗參茶增強(qiáng)免疫功能的物質(zhì)基礎(chǔ)Table 7 The material basis of American Ginseng tea to enhance immune function

將化合物的作用靶點(diǎn)在Uniprot數(shù)據(jù)庫[19](https://www. uniprot. org)統(tǒng)一規(guī)范后得到56個藥物作用靶基因。以“Immunocompromised”和“hypoimmunity”為檢索詞,挖掘GeneCards數(shù)據(jù)庫[20](https://www. genecards. org)、OMIM數(shù)據(jù)庫(https://www. omim. org)和DRUGBANK 5.0數(shù)據(jù)庫[21](https://www. drugbank. ca)疾病相關(guān)靶點(diǎn),共得到免疫力低下相關(guān)靶點(diǎn)1188個,其中藥物-疾病共同靶點(diǎn)20個。將共有靶點(diǎn)提交至STRING 11.0數(shù)據(jù)庫[22](https://string-db. org)構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI),利用Cytoscape 3.7.2軟件[23]實(shí)現(xiàn)可視化(見圖1),刪去游離的節(jié)點(diǎn)后,PPI網(wǎng)絡(luò)中共有19個節(jié)點(diǎn),86條邊,平均節(jié)點(diǎn)連接度為8.6,平均局部聚類系數(shù)為0.74,其中對網(wǎng)絡(luò)影響最大的基因?yàn)镃ASP3(degree=16)、JUN(degree=16)和TNF(degree=14)。將藥物-疾病共同靶點(diǎn)輸入Metascape平臺[24](https://metascape.org),以P<0.01,最小計(jì)數(shù)為3,富集因子>1.5為條件,進(jìn)行GO和KEGG功能富集分析,富集顯著性最強(qiáng)的通路如表8所示。西洋參對機(jī)體免疫力的調(diào)節(jié)作用對半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與凋亡信號通路的分子功能影響最大,涉及了4個基因;對凋亡的生物過程影響最大,涉及13個基因;對細(xì)胞中膜筏相關(guān)組分影響最大,涉及5個基因;對IL-17、NOD樣受體信號通路和細(xì)胞凋亡等信號通路有顯著影響。通過Cytoscape 3.7.2構(gòu)建花旗參茶成分-免疫力低下靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò),并利用Network Analyzer分析西洋參調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力的核心成分及核心作用靶點(diǎn)。結(jié)果表明,β-谷甾醇(degree=14,Betweenness Centrality=0.3844,Closeness Centrality=0.5738)和人參皂苷Rh2(degree=8,Betweenness Centrality=0.0476,Closeness Centrality=0.4430)為西洋參調(diào)控免疫功能的關(guān)鍵活性成分;CASP3、TNF、CASP8、NFKBIA和JUN為西洋參增強(qiáng)免疫力的重要靶點(diǎn)(見圖2)。

表8 花旗參茶增強(qiáng)免疫功能的作用機(jī)制Table 8 Mechanism of American Ginseng tea to enhance immune function

圖1 花旗參茶-免疫力低下靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.1 PPI Network of American Ginseng tea-immunocompromised targets注:節(jié)點(diǎn)大小和顏色亮暗代表節(jié)點(diǎn)連通度, 面積越大、顏色越鮮艷說明該節(jié)點(diǎn)越重要。

圖2 花旗參茶成分-免疫力低下靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Network of Ginseng tea ingredients- immunocompromised targets-pathways注:圓形節(jié)點(diǎn)為花旗參茶的活性成分, 矩形為靶點(diǎn),倒三角為相關(guān)通路;節(jié)點(diǎn)大小 代表節(jié)點(diǎn)連通度,面積越大說明該節(jié)點(diǎn)越重要。

3 討論與結(jié)論

目前的研究主要是針對西洋參成分的藥理作用研究,對花旗參茶的藥理藥效作用機(jī)制研究較少。據(jù)報(bào)道,西洋參中的皂苷類成分可有效增強(qiáng)雷帕霉素誘導(dǎo)的免疫力低下模型斑馬魚的免疫力[25];西洋參花多糖可增強(qiáng)小鼠巨噬細(xì)胞RAW246.7的免疫活性[26]。本研究從細(xì)胞免疫、體液免疫、單核巨噬細(xì)胞功能及NK細(xì)胞活性等方面全面探究了花旗參茶對小鼠特異性免疫及非特異性免疫功能的影響,結(jié)果表明,花旗參茶中劑量和高劑量均可顯著增強(qiáng)機(jī)體的脾淋巴細(xì)胞增殖、遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)、碳廓清及腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力,高劑量可極顯著增加抗體生成細(xì)胞數(shù)(P<0.01),低劑量可顯著增加抗體生成細(xì)胞數(shù)(P<0.05),高劑量還可顯著提高脾臟系數(shù)(P<0.05),極顯著提高NK細(xì)胞活性和免疫小鼠體內(nèi)血清溶血素水平(P<0.01),說明花旗參茶具有較好的免疫功能增強(qiáng)作用。另外,觀察到西洋參飲片泡水組(與花旗參茶中劑量所含生藥量相近)對免疫力的增強(qiáng)效果只與花旗參茶低劑量作用效果相當(dāng),說明在同等劑量下,其免疫力增強(qiáng)作用優(yōu)于西洋參飲片泡水服用。

利用網(wǎng)路藥理學(xué)技術(shù),通過數(shù)據(jù)挖掘,對花旗參茶增強(qiáng)免疫力的作用機(jī)制進(jìn)行了探究。PPI結(jié)果顯示,Caspase家族蛋白相應(yīng)基因中CASP3、CASP8、CASP9和CASP1基因均為PPI網(wǎng)絡(luò)的重要節(jié)點(diǎn)。Caspase8和Caspase9參與細(xì)胞凋亡的起始,Caspase3參與細(xì)胞凋亡的執(zhí)行,炎性的Caspase1不直接參與凋亡信號的轉(zhuǎn)導(dǎo),但與自身免疫性疾病有關(guān)[27-28]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果表明,花旗參茶調(diào)節(jié)免疫功能的活性成分為β-谷甾醇和人參皂苷Rh2。研究表明,β-谷甾醇及其糖苷在體內(nèi)外均具有良好的免疫調(diào)節(jié)活性[29],它們可以靶向增殖輔助型T細(xì)胞(Th),促進(jìn)Th1增殖從而促進(jìn)白細(xì)胞介素(IL)-2和干擾素-γ的釋放,而對Th2的增殖及IL-4的釋放沒有明顯影響。此外,β-谷甾醇還可改善T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的活性[30-31],降低腫瘤壞死因子(TNF)-α和IL-1β水平發(fā)揮抗炎作用[32]。錢穎等[33]的研究表明人參皂苷Rh2通過促進(jìn)天然免疫細(xì)胞的分化及免疫效應(yīng)細(xì)胞的增殖,促進(jìn)IL-2和TNF-α等Th1型細(xì)胞因子的分泌,提高放療及甲氨蝶呤誘導(dǎo)免疫低下小鼠的免疫力。研究發(fā)現(xiàn),人參皂苷Rh2對阿爾茲海默癥和變態(tài)反應(yīng)等炎癥相關(guān)免疫性疾病具有療效[34]。水溶性基團(tuán)修飾人參皂苷Rh2后得到的衍生物Rh2-B2可通過抑制p38、c-Jun 氨基端激酶和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白酶的磷酸化及NF-κB通路的傳導(dǎo),抑制促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的過表達(dá),改善脂多糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7的炎癥反應(yīng)[35]。

綜上,花旗參茶對小鼠免疫力具有較好的增強(qiáng)作用,本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn),β-谷甾醇和人參皂苷Rh2等為花旗參茶調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ),其作用機(jī)制涉及IL-17信號通路和NOD樣受體信號通路等炎癥相關(guān)信號及細(xì)胞凋亡信號通路,為我們進(jìn)一步闡明花旗參茶的作用機(jī)制提供了新的思路。