一種漿果草本飲料對視神經(jīng)擠壓傷小鼠視網(wǎng)膜細胞及其抗氧化能力的影響

徐文流,翁少全,徐海寧

(廣州王老吉大健康產(chǎn)業(yè)有限公司,廣東廣州 510623)

隨著手機、電腦、電視等視頻終端的廣泛普及和應(yīng)用,人們從事近距離精細用眼的工作越來越多,過度用眼的狀況也越來越嚴(yán)重,這使得眼睛出現(xiàn)了眼酸脹痛、干濕流淚等不適癥狀,這些癥狀嚴(yán)重影響了人們的身心健康及生活質(zhì)量。

傳統(tǒng)中藥中包含多種具有護眼功效的藥食同源類物質(zhì),近來許多研究進一步證實了其對眼睛的保護作用。枸杞子(LyciumBarbarum)味甘、性平,歸肝、腎經(jīng),具有滋補肝腎,益精明目的作用;Li等研究表明枸杞可提高大鼠視神經(jīng)部分橫斷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(Retinal Ganglion Cells,RGCs)存活率,并影響小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞的極化和自噬,延緩視神經(jīng)元軸突的二次變性[1-2];枸杞子所含的枸杞多糖被證明能夠極大促進色素性視網(wǎng)膜炎模型小鼠的光感受器存活情況,延緩光感受器退化期間RGCs的功能衰退,同時能有效緩解與許多眼科疾病密切相關(guān)的視網(wǎng)膜缺血所引起的視網(wǎng)膜功能障礙[3-4]。桑葚(MorusalbaL.)味甘性寒,入心、肝、腎經(jīng),有滋陰補血作用;桑葚具有很好的抗氧化、抗自由基的功效[5];Lee等發(fā)現(xiàn)長期攝入桑葚中提取的矢車菊素-3-葡萄糖苷可減輕N-甲基-N-亞硝基氧化誘導(dǎo)的大鼠視網(wǎng)膜退化[6];Jang等發(fā)現(xiàn)從桑葚中提取的花青素可以保護視網(wǎng)膜神經(jīng)元免受亞硝基甲脲誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)和功能損傷[7]。覆盤子(RubusidaeusL.),味甘、酸,性平,具有補肝腎,明目的作用;作為漿果類植物,其所富含的酚類物質(zhì),如酚酸、類黃酮-類黃酮醇、花青素、單寧酸和抗壞血酸等,具有很強的抗氧化性[8];一項雙盲安慰劑對照研究表明,口服花青素有助視紫紅質(zhì)的產(chǎn)生,而視紫紅質(zhì)有助于將光轉(zhuǎn)化為大腦的電信號[9];最近一些研究表明,覆盤子可改善高脂血癥[10],具有抗氧化應(yīng)激的作用[11]。菊花(ChrysanthemummorifoliumRamat)味甘、苦,微寒,歸肺、肝經(jīng),具有散風(fēng)清熱、平肝明目的作用;研究表明菊花熱水浸提液具有顯著的抗氧化、抗炎等功效[12];Shen等發(fā)現(xiàn)菊花中的香葉木素可通過減少DNA損傷和氧化應(yīng)激來保護視網(wǎng)膜免受損傷[13]。決明子(Cassiaesemen)味苦、甘、咸,性微寒,歸肝、大腸經(jīng),可清熱明目,潤腸通便;Jang等發(fā)現(xiàn)決明子中的某些蒽醌類物質(zhì)可以顯著的抑制大鼠晶狀體醛糖還原酶的活性及糖基化終末產(chǎn)物的形成[7];決明子中的決明蒽醌可以抑制氧化改性DNA和亞硝基酪氨酸在視網(wǎng)膜中積累,對糖尿病導(dǎo)致的視網(wǎng)膜病變發(fā)揮有益影響[14]。目前緩解視疲勞的功能性產(chǎn)品多是在基于傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)對視疲勞與肝關(guān)系密切的理論認(rèn)識基礎(chǔ)上,配方多從補肝明目入手選擇原料,通過疏瀉肝火而起到緩解視疲勞的作用。從肝論治視疲勞最具代表性的中藥枸杞子、菊花、決明子恰是使用頻次最高的3種藥食同源類中藥。

本研究擬對一款以漿果和草本為原料的護眼功能飲料進行功效評價,主要考察其對視網(wǎng)膜細胞及其抗氧化能力的影響。該護眼功能飲料由上述具有護眼功效的原料(枸杞子、菊花、桑葚、覆盤子和決明子)經(jīng)浸提后配制而成。本實驗采用可造成RGCs進行性死亡的小鼠視神經(jīng)擠壓傷模型,給予小鼠護眼功能飲料灌胃,通過檢測小鼠視網(wǎng)膜節(jié)細胞的存活數(shù)目、視網(wǎng)膜蛋白表達情況和視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激水平,對該飲料的護眼功效進行評價。

1 材料及方法

1.1 材料與儀器

5周齡的C57雄性小鼠(體重約為18～20 g) 廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心,生產(chǎn)許可證號:SCXK(粵)2018-0002;枸杞、桑葚、覆盆子、菊花、決明子 廣州當(dāng)?shù)厮幉氖袌?抗體goat anti mouse Brn3a、抗體donkey anti goat 594 Abcam公司;ROS熒光探針-二氫乙啶(Dihydroethidium,DHE) 賽默飛世爾公司;血紅素氧合酶-1(Heme Oxygenase 1,HO-1)抗體、核因子相關(guān)因子-2(Nuclear Factor Erythroid-2-related Factor 2,Nrf-2)抗體、鈣離子結(jié)合蛋白(Ionized Calcium-binding Adapter Molecule 1,Iba-1)抗體、錳超氧歧化酶2(Manganese Superoxide Dismutase,MnSOD)抗體S、精氨酸酶-1(Arginase-1,Arg-1)抗體、誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(Inducible Nitric Oxide Synthase,iNOS)抗體、白細胞介素(Interleukin-6,IL-6)抗體、分化群206蛋白(Cluster of Differentiation 206,CD206)抗體、微管蛋白(Tubulin)抗體、肌動蛋白(Actin)抗體 Sigma-Aldrich公司。

Avanti J-15R高速冷凍離心機 美國Beckman公司;Mini-PROTEAN Tetra電泳槽、PowerPac基礎(chǔ)電泳儀電源、Trans-Blot Turbo轉(zhuǎn)印系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司;Tanon3500凝膠圖像分析系統(tǒng) 中國天能公司;CM3050S冰凍切片機 德國Leica公司;正置熒光顯微鏡 德國Leica公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 漿果草本護眼功能飲料制備 按照中醫(yī)傳統(tǒng)理論,選擇三種最具代表性的具有護目功效的3味藥食同源類中藥枸杞、菊花、決明子,輔以富含花青素的桑葚、覆盤子組方浸提作為基質(zhì),調(diào)配草本漿果護眼功能飲料。在前期感官評定實驗的基礎(chǔ)上,確定五種漿果草本原料的質(zhì)量配比為枸杞60%、桑葚20%、菊花15%、覆盤子2.5%、決明子2.5%。將上述物料按比例混合,按照料液比1∶18加入RO純水,95 ℃保溫浸提90 min,隨后經(jīng)過濾、離心、濃縮得到護眼草本濃縮汁,其可溶固形物含量為11%,最終將4.5%護眼草本濃縮汁、8%白砂糖、0.2%檸檬酸、0.1%蘋果酸等輔料混合調(diào)配殺菌制得漿果草本護眼功能飲料,其成品中漿果草本可溶固形物含量為0.5%。

1.2.2 實驗?zāi)Ｐ椭谱?制作視神經(jīng)擠壓傷模型小鼠,小鼠異氟烷氣體吸入麻醉及眼表面麻醉后,剪開眼外側(cè)皮膚暴露出外側(cè)眼球,鈍性分離并暴露視神經(jīng),在距視盤0.5 mm處鉗夾視神經(jīng)10 s,注意避免損傷視神經(jīng)下眼部血管。眼底鏡檢查確認(rèn)視網(wǎng)膜血管的血流狀態(tài)。均選擇左眼為模型眼,右眼為對照。

1.2.3 實驗分組和流程 實驗組灌胃護眼功能飲料,劑量為0.1、1、10、100 mg/kg(以飲料所含草本干物質(zhì)計);對照組使用滅菌的0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS)灌胃。該實驗從術(shù)前的-7 d開始灌胃,直到術(shù)后取材前6 d,共14 d(圖1)。所有小鼠灌胃體積均為0.4 mL,其中測試飲料使用滅菌的0.01 mol/L PBS稀釋,每次灌胃前新鮮配制,現(xiàn)配現(xiàn)用。

圖1 實驗流程示意圖Fig.1 Schematic diagram of experiment flow

1.2.4 護眼功能飲料對小鼠RGCs存活率的影響 采用視網(wǎng)膜平鋪免疫熒光染色的方法測定。術(shù)后7 d處死小鼠,取出眼球于4%多聚甲醛中固定1 h,在0.01 mol/L PBS中剝離視網(wǎng)膜并剪成四葉草狀(即4個象限)。使用10% BSA封閉視網(wǎng)膜,goat anti mouse Brn3a 1∶1000作為一抗,donkey anti goat 594 1∶500作為二抗。最后使用熒光封片劑封片。在400倍顯微鏡下拍照,每個象限從視神經(jīng)開始,沿正中線每隔500 μm拍一張(200×200 μm2),一個視網(wǎng)膜16張(圖2),計數(shù)后平均為每平方毫米節(jié)細胞個數(shù)。

圖2 視網(wǎng)膜平鋪免疫熒光染色處理示意圖Fig.2 Diagram of Immunofluorescence staining of retinal stretching preparation

1.2.5 護眼功能飲料對小鼠視網(wǎng)膜蛋白的影響 采用蛋白免疫印跡檢測。術(shù)后7 d處死小鼠,冰凍剝離新鮮視網(wǎng)膜后,超聲破碎細胞并離心取上清,提取出視網(wǎng)膜內(nèi)蛋白。按照蛋白免疫印跡檢測(Western blot)步驟檢測視網(wǎng)膜內(nèi)相關(guān)蛋白質(zhì)分子含量。主要檢測蛋白:與小膠質(zhì)細胞相關(guān)的Iba-1(1∶1000)、iNOS(1∶500)、IL-6(1∶1000)、CD206(1∶1000)和Arg-1(1∶1000);與氧化應(yīng)激相關(guān)的HO-1(1∶2000)、Nrf-2(1∶1000)和MnSOD(1∶2000);內(nèi)參蛋白包括微管蛋白(Tubulin,1∶10000)和肌動蛋白(Actin,1∶4000)。

1.2.6 ROS熒光探針檢測 將小鼠過量麻醉處死,取出眼球PFA固定1 h,然后放入30%蔗糖在4 ℃冰箱里面沉糖2 d,于-80 ℃包埋。將眼球包埋塊冰凍切片,只取帶視神經(jīng)頭的切片,每個視網(wǎng)膜至少3張切片。按照試劑盒說明,用PBS將二氫乙啶(DHE)熒光探針稀釋到工作濃度,然后將冰凍切片在37 ℃用稀釋后的工作液孵育30 min;DHE會進入細胞內(nèi),被細胞內(nèi)的活性氧氧化形成氧化乙啶,產(chǎn)生紅色熒光。熒光越強代表細胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)越強。封片后,在200倍熒光顯微鏡視野下,選取距離視神經(jīng)頭1 mm處各拍一張照片(400×400 μm2),每個視網(wǎng)膜6張(圖3)。使用ImageJ軟件統(tǒng)計每張照片的陽性密度值,平均6張照片得出每個視網(wǎng)膜的陽性密度值。

圖3 ROS熒光探針-DHE檢測示意圖Fig.3 Diagram of ROS fluorescent probe-DHE detection

1.3 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計分析及作圖采用GraphPad Prism 8軟件。測定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。所有比較均在兩組之間進行(Student’s T-test),P<0.05說明差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 護眼功能飲料對小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(RGCs)存活率的影響

RGCs提供了將視網(wǎng)膜處理的所有視覺信息傳輸?shù)酱竽X的最后一個公共通道[15]。因此,RGCs變性具有重要的視覺影響,可導(dǎo)致多種疾病,包括青光眼、遺傳性視神經(jīng)病變、缺血性視神經(jīng)病變和脫髓鞘病,是世界范圍內(nèi)不可逆失明的主要原因。視神經(jīng)擠壓傷小鼠模型是國際上廣泛使用的RGCs死亡的動物模型,通過鉗夾視神經(jīng)一段時間造成部分RGCs的進行性死亡。實驗通過視網(wǎng)膜平鋪免疫熒光染色計數(shù)存活的RGCs(圖4),在視神經(jīng)擠壓損傷7 d后,0.1、1、10、100 mg/kg四個劑量組中,10 mg/kg劑量實驗組小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞存活量1024 Cell/mm2高于對照組946 cell/mm2(P<0.05),提高了約8.25%;而0.1、1和100 mg/kg劑量組與對照組相比無顯著差異(P>0.05)(圖5)。因此相較于空白對照組,4個劑量組中只有10 mg/kg 劑量組RGCs存活量顯著增加(P<0.05),而在較低或較高的攝入劑量下,護眼功能飲料對RGCs的存活量影響不顯著,這說明護眼功能飲料對RGCs存活量的影響是濃度依賴的。由于本次測定劑量選擇范圍較寬,依次10倍遞增,最大劑量是最小劑量的1000倍,因此0.1和1 mg/kg的低攝入劑量不足以明顯改善RGCs的存活情況,而過高的攝入量100 mg/kg可能超出小鼠的耐受程度,也不利于其功效的發(fā)揮。這表明在適度的劑量下該護眼飲料對RGCs發(fā)揮了一定保護作用。Li等采用視神經(jīng)橫斷模型小鼠,發(fā)現(xiàn)枸杞多糖可以延緩視神經(jīng)損傷后RGCs的繼發(fā)性退變[1],這與本文結(jié)論一致,特別考慮到測定飲料中枸杞占草本植物原料的比例達到60%。

圖4 不同灌胃劑量小鼠視網(wǎng)膜免疫熒光染色圖Fig.4 Immunofluorescence staining of retinal stretching preparation of mouse with different intragastrical administration dosage

圖5 不同灌胃劑量小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞存活量Fig.5 Survival of retinal ganglion cells(RGCs)of mouse with different intragastrical administration dosage注:*表示與對照組相比具有顯著性差異(P<0.05),各組樣本數(shù)N=7。

導(dǎo)致RGCs死亡的因素非常復(fù)雜,例如在不健康用眼導(dǎo)致的青光眼中,因素包括小膠質(zhì)細胞的激活、自噬作用、鈣調(diào)節(jié)紊亂、細胞凋亡、氧化應(yīng)激、促凋亡蛋白表達等。而已有的研究表明枸杞所含的枸杞多糖能夠調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞的激活和極化且具有良好的抗氧化應(yīng)激作用[4],漿果草本提取液中的酚酸、類黃酮、花青素、單寧等也都具有很強的抗氧化性。因此可推測該護眼功能飲料中所含的枸杞多糖、天然抗氧化物質(zhì)等多種功效成分,通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞生理功能和抗氧化應(yīng)激等途徑,對RGCs產(chǎn)生一定的保護作用。

2.2 護眼功能飲料對小鼠視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞的影響

視網(wǎng)膜是具有高度有序的多細胞層的復(fù)雜組織。它的精細復(fù)雜結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其對內(nèi)部和外部超出自穩(wěn)范圍的擾動極為敏感。這就需要對視網(wǎng)膜進行連續(xù)監(jiān)視,以發(fā)現(xiàn)有害的刺激。這一任務(wù)主要由小膠質(zhì)細胞執(zhí)行,它是視網(wǎng)膜組織的常駐巨噬細胞,提供神經(jīng)保護,以應(yīng)對瞬時的病理生理損傷[16]。

圖6 小膠質(zhì)細胞激活與極化相關(guān)蛋白免疫印跡檢測結(jié)果Fig.6 Western blot result of activation and polarization related protein of microglial注:樣本數(shù)Ncontrol=6,N10 mg/kg=5,NS表示差異不顯著。

在本研究中,利用免疫印跡分析,測定與小膠質(zhì)細胞的活化及分化密切相關(guān)的蛋白的表達情況,推測攝入該飲料對小膠質(zhì)細胞的影響。測定結(jié)果顯示10 mg/kg飲料劑量組Iba-1、iNOS、Arg-1和CD206四種蛋白的含量較對照組無顯著差異(P>0.05)(圖6)。其中Iba-1是小膠質(zhì)細胞激活后高度表達的一種蛋白,可表征小膠質(zhì)細胞的活化情況[17]。在小膠質(zhì)細胞激活后,可極化為M1型和M2型:M1型細胞表達包括iNOS與IL-6在內(nèi)的促炎細胞因子,以消滅致病性微生物,抑制細胞增殖,誘導(dǎo)組織損傷;另一方面,M2型小膠質(zhì)細胞表達Arg-1與CD206等抗炎因子,下調(diào)炎癥反應(yīng),促進血管生成,參與組織重塑和修復(fù)[18]。因此iNOS與IL-6可表征M1型極化情況,Arg-1與CD206可表征M2型極化情況。在長期炎癥刺激下,M1/M2型小膠質(zhì)細胞的平衡被打破,小膠質(zhì)細胞逐漸轉(zhuǎn)化為M1型,釋放大量的炎癥因子,參與視網(wǎng)膜疾病的發(fā)生發(fā)展[19]。研究表明,視網(wǎng)膜黃斑變性、遺傳性視網(wǎng)膜病變、青光眼、糖尿病視網(wǎng)膜病變等不同視網(wǎng)膜退化疾病都與小膠質(zhì)細胞的反應(yīng)活性和慢性炎癥反應(yīng)密切相關(guān),并且通過藥理靶向作用于過度反應(yīng)的小膠質(zhì)細胞可以改善上述疾病的發(fā)病機制[20]。因此雖然攝食該護眼飲料不會顯著影響小鼠視網(wǎng)膜中免疫炎癥細胞小膠質(zhì)細胞的激活和極化情況,但是Arg-1與CD206的表達均出現(xiàn)一定程度上升(圖6),表明在一定程度上促進了小膠質(zhì)細胞的M2型極化,促進了組織修復(fù),也即該護眼飲料在一定程度上促進了小膠質(zhì)細胞活化和促組織修復(fù)的M2型極化。與本文研究結(jié)論類似,Li等分別利用分化群68蛋白(CD68)與Arg-1表征小膠質(zhì)細胞的激活和M2極化情況,發(fā)現(xiàn)枸杞多糖可以顯著促進小膠質(zhì)細胞的激化和M2型極化[1]。

由于小膠質(zhì)細胞維持眼部正常生理時發(fā)揮的調(diào)節(jié)作用比較復(fù)雜,既可以因自噬水平的提高促進RGCs的死亡,又可以通過自噬對RGCs產(chǎn)生保護作用。在持續(xù)的病理刺激下,小膠質(zhì)細胞的炎癥應(yīng)答反應(yīng)變得失調(diào),經(jīng)常惡化疾病。小膠質(zhì)細胞的雙刃劍作用導(dǎo)致其激活在不同的病理階段發(fā)揮完全不同甚至相反的作用,因此后續(xù)的研究將測定術(shù)后不同病理期內(nèi)的小膠質(zhì)細胞活性情況,可以更好的了解所測護眼飲料的護眼作用機理。

2.3 護眼功能飲料對小鼠視網(wǎng)膜抗氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白的影響

視網(wǎng)膜因其高耗氧量和高比例的多不飽和脂肪酸含量而特別容易受到氧化應(yīng)激的影響。細胞內(nèi)ROS平衡被打破時,ROS在細胞內(nèi)積累并最終導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng),進一步引起炎癥反應(yīng),炎癥反應(yīng)又能夠促進活性氧的產(chǎn)生[21]。特別是視網(wǎng)膜色素上皮細胞(RPE)細胞長期暴露在光刺激、接受豐富灌注和吞噬脂類物質(zhì)環(huán)境中,日積月累的氧化損傷最終導(dǎo)致 RPE 細胞功能障礙甚至是凋亡[22-23]。因此,抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的發(fā)生是預(yù)防視網(wǎng)膜退化等相關(guān)眼部疾病發(fā)生的一個有效方法。為了測定攝入該護眼飲料對小鼠視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激水平的影響,我們利用免疫印跡分析,測定與氧化應(yīng)激密切相關(guān)的蛋白酶及因子MnSOD、HO-1與Nrf-2的表達情況。實驗結(jié)果表明,10 mg/kg劑量組MnSOD、HO-1和Nrf-2的表達有顯著提升(P<0.05),分別增加約33.73%、45.78%和200.00%(圖7)。

圖7 視網(wǎng)膜內(nèi)抗氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白免疫印跡分析Fig.7 Western blot analysis of oxidative stress related protein in retina注:*表示差異顯著(P<0.05), **表示差異極顯著(P<0.01);圖8同。

MnSOD能夠清除超氧化物保護細胞免受氧化損傷,HO-1具有維持細胞穩(wěn)態(tài)和抗氧化作用,Nrf-2是內(nèi)源性防御體系關(guān)鍵蛋白,調(diào)節(jié)抗氧化蛋白的表達,保護機體免受損傷和炎癥引起的氧化損傷[24]。研究表明,MnSOD和Nrf-2在糖尿病視網(wǎng)膜病變中發(fā)揮保護作用,通過降低視網(wǎng)膜內(nèi)的ROS水平,從而維持血液-視網(wǎng)膜屏障及視神經(jīng)的正常功能[11]。HO-1被證明在保護視網(wǎng)膜免受光損傷方面發(fā)揮重要的作用[24]。由此推測該護眼飲料可能通過提升視網(wǎng)膜中氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白酶與因子MnSOD、HO-1與Nrf-2的表達水平,對視網(wǎng)膜產(chǎn)生一定保護作用。

2.4 護眼功能飲料對小鼠視網(wǎng)膜氧化反應(yīng)水平的影響

眾所周知,天然產(chǎn)物中存在大量安全且有效的抗氧化劑,通過攝食可以改善機體的氧化還原水平[25]。雖然近來許多研究為ROS在正常細胞功能中的重要生理作用提供了一些證據(jù),但ROS普遍存在而引起的氧化應(yīng)激以及濃度超過人體對它們的天然防御所導(dǎo)致的細胞穩(wěn)態(tài)失衡一直被認(rèn)為是各種眼病的發(fā)病機制之一[26]。因此考察了攝食該護眼飲料對小鼠視網(wǎng)膜總體的氧化還原水平的影響,利用ROS熒光探針-DHE測定了視網(wǎng)膜內(nèi)總體ROS水平。DHE可自由透過細胞膜,主要被超氧陰離子型ROS氧化為氧化乙啶,摻入染色體DNA中產(chǎn)生紅色熒光。實驗結(jié)果表明,對于10 mg/kg飲料劑量組,不管是鉗夾視神經(jīng)損傷左眼還是對照側(cè)右眼,其視網(wǎng)膜的外核層(ONL)、內(nèi)核層(INL)及節(jié)細胞層(RGCL)的紅色熒光強度均肉眼可見低于相應(yīng)對照組,方差分析表明其平均DHE陽性密度值均顯著低于相應(yīng)對照組(P<0.05)(圖8),表明實驗組ROS水平顯著低于對照組。經(jīng)計算,左眼與自身對照右眼的ROS水平分別降低了約25.62%與16.95%。這表明該護眼飲料可以降低視網(wǎng)膜中總體ROS水平,從而對視網(wǎng)膜起到一定的保護作用。

圖8 視網(wǎng)膜冰凍切片DHE免疫熒光染色Fig.8 DHE immunofluorescence staining of retinal frozen sections注:各組樣本數(shù)N=5。

研究顯示該護眼飲料所用的五種原料枸杞、桑葚、菊花、覆盤子和決明子均具有良好的體內(nèi)和體外抗氧化能力。臨床研究表明枸杞可以提高人體血清中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶水平,降低脂質(zhì)過氧化的水平來發(fā)揮其抗氧化效能[27]。Wang等研究發(fā)現(xiàn)菊花水提物可以通過與上述枸杞相似方式抑制高脂血癥大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激積聚[28]。Raman等發(fā)現(xiàn)桑葚的類黃酮提取物能夠抑制小鼠肝臟、線粒體和微粒體中的脂質(zhì)過氧化[29]。Liu等研究發(fā)現(xiàn)決明子多糖提取物的羥基和超氧化物自由基的體外清除能力優(yōu)于抗壞血酸[30]。大量的研究表明覆盤子所含的花青素可以通過清除自由基保護細胞和機體免受氧化損傷[31]。因此該護眼功能飲料對視網(wǎng)膜氧化還原穩(wěn)態(tài)的促進作用可能源于其高效的體內(nèi)外抗氧化能力。有研究表明漿果植物越橘所含的15種花青素中的大部分可以完整的轉(zhuǎn)運至活體動物的眼部或視網(wǎng)膜部位[32],因此可以合理推測本護眼飲料所含桑葚、覆盆子漿果浸提得到的花青素可部分直接在視網(wǎng)膜中發(fā)揮清除氧自由基、猝滅活性氧的作用,進而促進視網(wǎng)膜氧化還原穩(wěn)態(tài)的維持,達到護目的功效。

3 結(jié)論

綜上,為測定一款漿果草本飲料的護眼功效,采用視神經(jīng)擠壓傷模型小鼠,測定對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞存活情況、小膠質(zhì)細胞激活與分化極化情況、氧化應(yīng)激密切相關(guān)蛋白酶及活性因子的表達水平以及視網(wǎng)膜的總體活性氧化產(chǎn)物水平的影響,發(fā)現(xiàn)10 mg/kg護眼功能飲料劑量下,視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞存活率提高了8.25%,抗氧化蛋白酶及因子MnSOD、HO-1和Nrf-2的表達分別增加約33.73%、45.78%和200.00%,擠壓損傷左眼與自身對照右眼的ROS水平分別降低了約25.62%與16.95%。因此該款以漿果草本為原料的護眼功能飲料可以通過提高視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的存活率,提高抗氧化蛋白酶及因子的表達增強視網(wǎng)膜的抗氧化能力,降低視網(wǎng)膜的活性氧化產(chǎn)物水平,達到對視網(wǎng)膜及視力的保護作用。