液相色譜質(zhì)譜法測定貝類水產(chǎn)品中氯霉素的不確定度評定

王 婷,王 儒,趙曉野,梁 瓊,張 樂

(海南省食品藥品檢驗(yàn)所海口分所,海南?？?570311)

氯霉素(chloramphenicol)屬抑菌性廣譜抗生素,由委內(nèi)瑞拉鏈絲菌產(chǎn)生,主要用于治療動(dòng)物由傷寒桿菌、流感桿菌、痢疾桿菌、大腸桿菌等引起的感染,是近幾年《國家食品安全監(jiān)督抽檢實(shí)施細(xì)則》中規(guī)定可食性動(dòng)物肌肉、肝臟、水產(chǎn)品、禽蛋中需要檢測的獸藥殘留[1]。氯霉素對眼睛有刺激性和腐蝕性,容易引起呼吸道和皮膚過敏,接觸后易出現(xiàn)頭痛、惡心、嘔吐等癥狀[2]。2019年12月27日,中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布第250號(hào)公告,將氯霉素列入食品動(dòng)物中禁止使用的藥品及其他化合物清單[3]。氯霉素的檢測方法主要分為微生物法、色譜法、酶聯(lián)免疫法[4-10]。其中液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法精確度和靈敏度較高、重現(xiàn)性好、方法檢出限可低至0.1 μg/kg,所以最為常用,為得到更加真實(shí)客觀的檢測結(jié)果,避免因檢測標(biāo)準(zhǔn)的完善性及實(shí)驗(yàn)人員操作的準(zhǔn)確性不足對檢測結(jié)果造成影響,提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度,需要對檢測過程中可能存在的不確定度進(jìn)行評估。

本文根據(jù)不確定度的不同來源,依據(jù)JJG 646-2009《移液器檢定規(guī)程》、JJG 196-2006《常用玻璃器具檢定規(guī)程》、JJG 10-2005《常用玻璃器具檢定規(guī)程》以及《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》[11-16]運(yùn)用數(shù)學(xué)模型,評估分析不同來源的不確定度分量對測量結(jié)果的影響,通過對不確定度分量的量化結(jié)果,計(jì)算出各個(gè)分量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度,再得到合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度及擴(kuò)展不確定度。評估各個(gè)不確定度分量,找出對測量不確定度影響較大的來源,并在實(shí)驗(yàn)過程中加以控制和避免,提高檢側(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

貝類 主要為海南島近岸海域,包含海南島東線和西線及南海海域和北部灣海域的方斑東風(fēng)螺、牡蠣、血螺、櫛孔扇貝、螺魁蚶等,樣品由海口、文昌、澄邁等海鮮市場采購獲得;乙酸乙酯、正己烷 色譜純,德國Meker公司;氫氧化銨、無水硫酸鈉 分析純,廣州化工公司;氯霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 貨號(hào)為IST9248-100M,濃度為100 μg/mL,擴(kuò)展不確定度為±5%(K=2),阿爾塔科技有限公司;氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 貨號(hào)為21033XB,濃度為100 μg/mL(±3%),曼哈格生物科技有限公司。

LC-MS-8040液質(zhì)聯(lián)用儀 島津公司;QUINTX224-1CN電子分析天平 賽多利斯貿(mào)易有限公司;Multi Reax(EU)渦旋振蕩器 德國Heidolph;3-18K離心機(jī) Sigma公司;TTL-DCII氮吹儀 北京同泰;milli-Q IQ7000超純水機(jī) 密理博中國有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度控制在20±5 ℃范圍內(nèi),稱取5 g經(jīng)過攪碎處理的貝類可食用組織,精確至0.01 g。置于50 mL聚丙烯離心管中,加入500 μL內(nèi)標(biāo)使用液,濃度為100 ng/mL,加入5 g無水硫酸鈉,0.45 mL氫氧化銨和15 mL 乙酸乙酯,渦旋振蕩10 min,離心5 min(4000 r/min),將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中。在殘?jiān)性偌尤?5 mL乙酸乙酯,重復(fù)上述操作,合并全部上清液至50 mL容量瓶中,用乙酸乙酯定容至刻度。搖勻后用刻度吸管吸取10 mL至另一離心管中,氮吹至干。用2 mL水復(fù)溶,加入5 mL正己烷渦旋混合30 s,離心5 min(10000 r/min),取下層溶液,過0.22 μm濾膜后,上機(jī)檢測。

1.2.2 氯霉素測定 依據(jù)GB/T 20756-2016《可食動(dòng)物肌肉、肝臟和水產(chǎn)品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考?xì)埩袅康臏y定液相色譜質(zhì)譜法》測定樣品中的氯霉素殘留量。

液相色譜條件:色譜柱:Waters C18,1.7 μm,2.1 mm×100 mm;柱溫:40 ℃;流動(dòng)相:甲醇+水(40+60);流速:0.3 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL。

質(zhì)譜條件:離子源:ESI;掃描方式:負(fù)離子掃描;檢測方式:MRM;離子源溫度:300 ℃。

1.2.3 不確定度來源分析 根據(jù)實(shí)驗(yàn)過程分析可知,不確定度來源可以分為以下幾個(gè)部分:天平稱取試樣質(zhì)量m0引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(m0);試料溶液中被測物氯霉素的濃度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(cc),主要包括氯霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相對不確定度urel(ucs)、氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制時(shí)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1(cc)、用內(nèi)標(biāo)校正的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度u2(cc);測定用樣液體積V1引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(V1);試樣處理液吸取體積V2引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(V2);試樣處理液定容體積V引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(V);內(nèi)標(biāo)加入體積引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(V3);測量結(jié)果重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(rep);回收率引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(Rec)。根據(jù)以上不確定度的來源,對各個(gè)分量進(jìn)行量化。根據(jù)GB/T 27418-2017測量不確定度評定和表示[27]的規(guī)定與公式,按照不確定度引入的來源不同,分別計(jì)算各個(gè)不確定度分量。

1.2.4 建立數(shù)學(xué)模型 氯霉素含量計(jì)算公式如下:

式中,X-試樣中被測物殘留量,μg/kg;Cs-基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中被測物的濃度,ng/mL;A-試樣溶液中被測物的色譜峰面積;As-基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中被測物的色譜峰面積;Ci-試樣溶液中內(nèi)標(biāo)物的濃度,ng/mL;Csi-基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中內(nèi)標(biāo)物的濃度,ng/mL;Asi-基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中內(nèi)標(biāo)物的色譜峰面積;Ai-試樣溶液中內(nèi)標(biāo)物的色譜峰面積;V-樣液最終定容體積,mL;m-試樣溶液所代表試樣的質(zhì)量,g。

為分析不確定度的來源,減少變量,將uf1表示為As/Asi的比值;將uf2表示為A/Ai的比值;因前處理存在分取過程,所以將試樣溶液所代表試樣的質(zhì)量m,按照測定用樣液體積V1與試樣處理液吸取體積V2的稀釋比例轉(zhuǎn)化為實(shí)際樣品的稱樣量為m0單位為克(g)。則上述公式可改寫成:

2 結(jié)果與分析

2.1 天平稱取試樣質(zhì)量m0引入的不確定度u(m0)

2.2 試料溶液中被測物的氯霉素濃度引入的不確定度u(cc)

表1 第一次稀釋過程中容量器具引入的不確定度Table 1 Uncertainty introduced by the volumetric apparatus during the first dilution

表2 第二次稀釋過程中容量器具引入的不確定度Table 2 Uncertainty introduced by the volumetric apparatus during the second dilution

2.2.1 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相對標(biāo)準(zhǔn)值的不確定度u(ucs) 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度為100 μg/mL,證書上標(biāo)注擴(kuò)展不確定度為±5%(K=2),氯霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為[18-22]:

2.2.2 稀釋過程引入的不確定度u1(cc)

2.2.2.1 第一次稀釋 移取1.00 mL濃度為100 μg/mL的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液,用甲醇定容至10.00 mL,得到濃度為10 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。采用1000 μL移液槍和10.00 mL容量瓶進(jìn)行稀釋。

表3 第三次稀釋過程中容量器具引入的不確定度Table 3 Uncertainty introduced by the volumetric apparatus during the third dilution

標(biāo)準(zhǔn)溶液第一次稀釋時(shí)引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

2.2.2.2 第二次稀釋 移取100 μL濃度為10 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用甲醇定容至10.00 mL,得到濃度為100 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)使用液。采用100 μL移液槍和10.00 mL容量瓶進(jìn)行稀釋。

標(biāo)準(zhǔn)溶液第二次稀釋時(shí)引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

2.2.2.3 第三次稀釋 移取1.00 mL濃度為100 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)使用液定容至10.00 mL,得到濃度為10 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)使用液。采用1000 μL移液槍和10.00 mL容量瓶進(jìn)行稀釋。

標(biāo)準(zhǔn)溶液第三次稀釋時(shí)引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

2.2.2.4 第四次稀釋 分別吸取10、50、100 μL濃度為10 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液,定容到1 mL,再分別吸取20、50、100 μL濃度為100 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)使用液定容到1 mL。得到系列為0.1、0.5、1、2、5、10 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用100 μL移液槍和1.00 mL容量瓶進(jìn)行稀釋。

表4 第四次稀釋過程中容量器具引入的不確定度Table 4 Uncertainty introduced by the volumetric apparatus during the fourth dilution

表5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的的建立Table 5 Establishment of standard curve

標(biāo)準(zhǔn)溶液第四次稀釋時(shí)引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

綜合四次稀釋,得到標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2.3 用內(nèi)標(biāo)校正的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度u2(c) 在系列為0.1、0.5、1、2、5、10 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線中加入50 μL濃度為100 ng/mL的內(nèi)標(biāo)使用液,得到內(nèi)標(biāo)上機(jī)濃度為5 ng/mL。因使用內(nèi)標(biāo)校正,則以待測物峰面積和內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值為縱坐標(biāo),以待測物濃度和內(nèi)標(biāo)物濃度比值為為橫坐標(biāo),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

進(jìn)行工作曲線校準(zhǔn)擬合,得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=aρ+b,斜率為a=1.01767,截距為b=0.00454660,相關(guān)系數(shù)r=0.9974327。

根據(jù)以上數(shù)據(jù)求得,s=0.041;所以,工作曲線擬合時(shí)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(ρ)=0.25,相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:urel(ρ)=0.25/1.3552=3.7%。

由于ρ為待測物濃度(Cs)/內(nèi)標(biāo)濃度的比值,本實(shí)驗(yàn)中內(nèi)標(biāo)濃度保持常數(shù)為5 ng·mL-1,則用內(nèi)標(biāo)校正的標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的待測物濃度的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:u2(cc)=urel(ρ)=3.7%

因此,最終得到試料中氯霉素質(zhì)量濃度的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

2.3 測定用樣液體積V1引入的不確定度u(V1)

樣品前處理中,加入乙酸乙酯進(jìn)行提取,用50 mL容量瓶定容至刻度。此過程引入的相對不確定度計(jì)算如表6所示。

表6 相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V1)Table 6 Relative standard uncertainty u(V1)

表7 相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(V2)Table 7 Relative standard uncertainty urel(V2)

表8 相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V)Table 8 Relative standard uncertainty u(V)

表9 相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度u1(V3)Table 9 Relative standard uncertainty u1(V3)

2.4 試樣處理液吸取體積V2引入的不確定度u(V2)

樣品前處理中,用刻度吸管吸取10 mL提取液進(jìn)行氮吹,此過程引入的相對不確定度計(jì)算如表7所示。

2.5 試樣處理液定容體積V引入的不確定度u(V)

由定容體和V引起的不確定度urel(V)。

2.6 內(nèi)標(biāo)加入體積引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(V3)

表10 相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2(V3)Table 10 Relative standard uncertainty u2(V3)

表11 重復(fù)性測定結(jié)果Table 11 Repeatability test results

內(nèi)標(biāo)使用液濃度為100 ng/mL,標(biāo)準(zhǔn)曲線定容體積均為1 mL,標(biāo)曲中內(nèi)標(biāo)加入量為50 μL,樣品溶液中內(nèi)標(biāo)加入量為500 μL,樣品經(jīng)分取定容處理后,標(biāo)曲和樣品上機(jī)濃度均為5 ng/mL。當(dāng)內(nèi)標(biāo)維持在同一濃度水平時(shí),母液配置這一步因稀釋過程產(chǎn)生的不確定度帶來的影響可以忽略不計(jì),只考慮標(biāo)準(zhǔn)曲線中內(nèi)標(biāo)加入帶來的不確定度u1(V3)和樣品中內(nèi)標(biāo)加入帶來的不確定度u2(V3)。

所以,內(nèi)標(biāo)加入體積引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

2.7 測量結(jié)果重復(fù)性引入的不確定度u(rep)

本實(shí)驗(yàn)室樣品測試通常為2個(gè)平行樣品,因此由測量結(jié)果重復(fù)性引入的相對不確定度為:

2.8 回收率不確定度u(Rec)

表12 回收率結(jié)果Table 12 Results of recovery

根據(jù)GB/T 20756可食動(dòng)物肌肉、肝臟和水產(chǎn)品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考?xì)埩袅康臏y定液相色譜質(zhì)譜法所示,分別做0.10、0.50、1.00 μg/kg三個(gè)水平的加標(biāo)回收,每個(gè)水平做6個(gè)重復(fù),回收率計(jì)算結(jié)果如表12所示。

2.9 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度及擴(kuò)展不確定度

如表12所示,各個(gè)分量的不確定度相對獨(dú)立,將表中的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量合成,即得:

表13 不確定度分量明細(xì)Table 13 Uncertainty component details

urel=(0.0000822+0.0492+0.00402+0.00422+0.00582+0.0182+0.00242+0.00122)-1=0.053

不確定度為:u(X)=13.51×0.053=0.716 μg/kg。

擴(kuò)展不確定度為:U=K×u(X)=2×0.716=1.43 μg/kg(95%置信概率下,取包含因子K=2)

所以,用液相色譜質(zhì)譜法測定貝類水產(chǎn)品中氯霉素的含量時(shí),擴(kuò)展不確定度為1.43 μg/kg,K=2,則樣品中氯霉素含量表示為[24-26]:(13.5±1.5) μg/kg,K=2。

3 結(jié)論

綜上所述,依據(jù)各個(gè)分量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度,不同來源對不確定度影響從大到小為試料溶液中被測物的氯霉素濃度、內(nèi)標(biāo)加入體積、試樣處理液定容積V、試樣處理液吸取V2、測定用樣液體積V1、測量結(jié)果重復(fù)性、天平稱取試樣質(zhì)量。為完善該方法檢測貝類水產(chǎn)品中氯霉素含量的質(zhì)量控制體系,實(shí)驗(yàn)人員在進(jìn)行檢測的過程中應(yīng)規(guī)范操作,尤其注意標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制,標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍的選擇;實(shí)驗(yàn)過程中溶液的定量加入應(yīng)盡可能準(zhǔn)確,降低其不確定度的影響,提高結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。