熊果酸對H22荷瘤小鼠抗腫瘤及腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的影響

田 力,萬端靜,邱丹纓,溫?fù)P敏,*

(1.泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部,福建泉州 362000; 2.泉州市中醫(yī)院,福建泉州 362000)

細(xì)菌不僅分布于人體皮膚表面以及口鼻腔、腸道、泌尿生殖道等與外界相通的各種腔道,少量細(xì)菌還能穿過胃腸黏膜而暴露于腸肝循環(huán),甚至進入血液循環(huán)[1]。細(xì)菌可通過直接作用、分泌代謝物和調(diào)節(jié)免疫等途徑影響各種腫瘤的發(fā)生發(fā)展,據(jù)估計,約13%的腫瘤與細(xì)菌感染有關(guān)[2]。肝癌是最常見腫瘤之一,腸道細(xì)菌失調(diào)能影響宿主膽汁酸代謝,引發(fā)肝臟炎癥,促進肝癌發(fā)生[3]。研究表明,通過干預(yù)腸道菌群能改善腫瘤療效[4]。

熊果酸是藤梨根、車前草及女貞子等抗腫瘤中藥的有效活性成分,在臨床實踐中獲得廣泛應(yīng)用[5]。熊果酸能通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移、逆轉(zhuǎn)放化療藥物的耐藥性、抑制腫瘤血管生成和調(diào)節(jié)免疫等機制發(fā)揮抗腫瘤作用,對肺癌、乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌以及肝癌等多種癌癥具有抑制作用[6]。但關(guān)于熊果酸對腫瘤患者腸道菌的研究鮮有報道,本文以皮下接種H22肝癌細(xì)胞構(gòu)建移植瘤小鼠模型為對象,基于16S rDNA技術(shù)研究熊果酸對H22肝癌小鼠抗腫瘤及腸道細(xì)菌的影響,以期為熊果酸抗腫瘤機制研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

熊果酸 上海麥克林生化科技公司,純度98%,枇杷(Eriobotryajaponica)葉提取物,用于醫(yī)藥、化妝品;小鼠糞便DNA提取試劑盒 promega公司。小鼠T淋巴細(xì)胞亞群(CD3、CD4、CD8)試劑盒 上海仁捷公司;小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α))、白細(xì)胞介素-2(IL-2)試劑盒 北京四正柏公司。

JY300C電泳儀 北京六一儀器廠;Multiskan FC酶標(biāo)儀 賽默飛(北京)公司;WD-9413C型光凝膠成像分析系統(tǒng) 北京六一生物公司;Veriti 96 PCR儀 美國ABI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠分組及飼養(yǎng) SPF級昆明小鼠(北京華阜康公司,許可證號:SCXK(京)2019-0008),24～26 ℃,12 h晝夜交替適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后,根據(jù)文獻方法制備H22肝癌實體瘤模型[7],正常對照組小鼠腹腔注射等體積生理鹽水。根據(jù)文獻和預(yù)實驗確定小鼠用藥劑量。小鼠隨機分6組,每組8只。分別為正常組(N):正常小鼠灌胃生理鹽水;模型組(M):腫瘤小鼠灌胃生理鹽水;陽性對照組(C):腫瘤小鼠灌胃50 mg/kg環(huán)磷酰胺;熊果酸低劑量組(UL):腫瘤小鼠灌胃50 mg/kg熊果酸;熊果酸中劑量組(UM):腫瘤小鼠灌胃100 mg/kg熊果酸;熊果酸高劑量組(UH):腫瘤小鼠灌胃200 mg/kg熊果酸;實驗始末記錄體重,每天給藥1次,連續(xù)3周。

1.2.2 指標(biāo)檢測 末次給藥24 h后,首先收集單只小鼠糞便,然后稱體重。接著摘眼球取血,分別根據(jù)小鼠T淋巴細(xì)胞亞群(CD3、CD4、CD8)試劑盒、小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-2(IL-2)試劑盒說明書檢測血清T淋巴細(xì)胞亞群(CD3、CD4、CD8)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-2(IL-2)濃度。最后頸椎脫臼處死小鼠。取小鼠肝臟和脾臟、剝?nèi)×鼋M織稱重,計算肝脾指數(shù)和抑瘤率。

肝脾指數(shù)(%)=肝脾重(mg)/體重(g)×100

抑瘤率(%)=[(對照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/對照組平均瘤重]×100

1.3 腸道菌分析

1.3.1 DNA的提取、PCR擴增及高通量測序 每組小鼠糞便隨機選4個樣品,按試劑盒說明書提取DNA,進行腸道菌群分析。以小鼠糞便DNA為模板,采用文獻中的引物[8]擴增16S rDNA的V3-V4 區(qū)。擴增體系為:12.5 μL Phusion Hot start flex 2X Master Mix,上下游引物各2.5 μL,模板DNA50 ng,加水至25 μL。擴增條件為:95 ℃預(yù)變性2 min,隨后98 ℃變性10 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,共35個循環(huán),最后72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)過純化后使用Qubit對文庫進行定量。將合格的文庫(濃度應(yīng)在2 nmol/L以上)進行上機測序(由杭州聯(lián)川生物公司完成)。

1.3.2 生物信息學(xué)分析 首先對測序原始讀數(shù)據(jù)進行質(zhì)控、過濾等處理以獲得高質(zhì)量的clean data。接著使用ASVs(Amplicon Sequence Variants)的概念構(gòu)建類OUTs(Operational Taxonomic Units)。基于OUTs結(jié)果,用QIIME2[9]計算Chao1、Observed species、Goods coverage、shannon、Simpson等α多樣性指數(shù),并進行主成分分析(PCA,Principal Component Analysis)。使用SILVA(Release 132,https://www. arb-silva. de/documentation/release-132/)以及NT-16S數(shù)據(jù)庫做物種分類及后續(xù)分析(數(shù)據(jù)分析由聯(lián)川生物公司協(xié)助完成),作圖使用聯(lián)川公司提供R包云工具實現(xiàn)的。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 熊果酸對肝癌移植瘤的影響

表1 熊果酸對臟器指數(shù)和抑瘤率的影響Table 1 Effect of ursolic acid on organ index and tumor inhibition

陽性對照藥物環(huán)磷酰胺(CTX)是一種廣譜抗腫瘤藥物,但具有明顯毒副作用,能引起食欲不振、惡心、體重下降等不良反應(yīng)[10]。從表1可以看出,雖然陽性對照組(CTX)能顯著抑制腫瘤生長,抑瘤率達68.71%,但小鼠體重、肝脾指數(shù)均比模型組顯著降低(P<0.05),顯示明顯毒副作用。而熊果酸各劑量組小鼠體重、肝脾指數(shù)與模型組差異不顯著(P>0.05),表明熊果酸對腫瘤小鼠無明顯毒副作用。熊果酸各劑量組腫瘤質(zhì)量均比模型組顯著降低(P<0.05),其中高劑量組和中劑量組腫瘤質(zhì)量與模型組差異極顯著(P<0.01),高劑量組抑瘤率最高達37.81%。顯示熊果酸對H22肝癌具有良好抑制效果,與姚宏斌等[7]結(jié)論一致。

圖1 稀釋曲線(A)和Alpha多樣性指數(shù)(B)Fig.1 Rarefaction curve(A)and Alpha diversity index of OTUs

2.2 熊果酸對小鼠血清細(xì)胞因子的影響

T細(xì)胞參與免疫應(yīng)答的負(fù)調(diào)節(jié)及在自身免疫耐受中發(fā)揮作用。IL-2具有活化T細(xì)胞,促進細(xì)胞因子產(chǎn)生、刺激自然殺傷細(xì)胞(NK)細(xì)胞增殖、促進B細(xì)胞增殖和分泌抗體等活性[11]。環(huán)磷酰胺在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時對機體正常細(xì)胞產(chǎn)生損害,降低巨噬細(xì)胞的吞噬能力,NK和T淋巴細(xì)胞增殖能力等,能顯著抑制機體免疫活性[10]。與以上結(jié)論相似,本研究結(jié)果顯示環(huán)磷酰胺(陽性對照組)T細(xì)胞亞群和IL-2含量均比正常組顯著降低(P<0.05)。

李艷紅等研究發(fā)現(xiàn),熊果酸能增強淋巴細(xì)胞增殖能力,促進血清IL-2、TNF-α表達,熊果酸的抗腫瘤作用與提高機體的免疫能力有關(guān)[12]。從表2看出,與正常組比較,模型組小鼠T細(xì)胞亞群和IL-2含量極顯著降低(P<0.01)。熊果酸各劑量組小鼠T細(xì)胞亞群和IL-2含量均比模型組高,其中中劑量組和高劑量組與模型組差異顯著(P<0.05),顯示熊果酸能提高腫瘤小鼠免疫活性。TNF-α對腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性,而且是介導(dǎo)細(xì)菌感染免疫應(yīng)答的一個重要因素[13]。從表2可以看出,模型組小鼠血清TNF-α含量比陽性對照組顯著減小(P<0.05),熊果酸各劑量組TNF-α含量比模型組顯著增加(P<0.05),其結(jié)果與方學(xué)輝等[14]研究結(jié)果一致。

表2 熊果酸對小鼠血清細(xì)胞因子的影響Table 2 Effect of ursolic acid on the level of cytokine in

2.3 熊果酸對肝癌移植瘤小鼠腸道菌影響

2.3.1 熊果酸對肝癌移植瘤小鼠腸道菌群多樣性分析 24個樣本共獲得4938個OTUs,所有樣品稀釋曲線均趨于平穩(wěn)(圖1A),顯示測序量已經(jīng)達到飽和。Alpha多樣性指數(shù)是反映一個特定區(qū)域或生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)物種豐富度和均勻度的綜合指標(biāo)[15]。與正常小鼠比較,模型組小鼠腸道細(xì)菌chao1指數(shù)、shannon值和simpson指數(shù)減小(圖1B),其中chao1指數(shù)和shannon值差異顯著(P<0.05),顯示腫瘤造模使小鼠腸道細(xì)菌的豐度和多樣性減小,其結(jié)果與甄宏德等關(guān)于原發(fā)性肝癌小數(shù)腸道菌α多樣性指數(shù)減小一致[16]。熊果酸各劑量組腸道菌α多樣性指數(shù)與模型組比較差異不顯著(P>0.05),表明熊果酸對腫瘤小鼠腸道菌群的豐富度和均勻度無顯著影響。

Beta多樣性是不同生態(tài)系統(tǒng)之間多樣性的比較,反映樣品間是否具有顯著的微生物群落差異,可通過主成分分析(Principal component analysis,PCA)等方法反應(yīng)樣本之間的差異。PCA圖中樣本之間距離越接近,物種組成越相似。從圖2可以看出,6組小鼠細(xì)菌相似性差異顯著(P<0.05)。PCA顯示,與正常組比較,模型組和熊果酸低劑量組小鼠腸道細(xì)菌群落差異顯著(P<0.05),而熊果酸中劑量組和高劑量組小鼠細(xì)菌群落與對照組差異不顯著(P>0.05。表明正常組與模型組之間小鼠腸道細(xì)菌相似性差異較大,熊果酸能影響小鼠腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu),其中熊果酸中、高劑量組對腫瘤引起的腸道細(xì)菌菌群紊亂具有改善和恢復(fù)作用。

圖2 主成分分析Fig.2 Principal component analysis

2.3.2 熊果酸對肝癌移植瘤小鼠腸道菌門水平影響 腸道細(xì)菌構(gòu)成一個復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng),可通過與腫瘤直接接觸,調(diào)節(jié)機體免疫和調(diào)節(jié)機體代謝等途徑影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療[17]。研究表明,小鼠腸道菌群的兩大主導(dǎo)菌群為擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes),與未消化食物代謝有關(guān)[18]。與以上結(jié)論相似,本實驗6組樣本共包括10個門,擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)為優(yōu)勢菌門(圖3),各組實驗小鼠擬桿菌門和厚壁菌門相對豐度均超過85%。

圖3 門水平微生物種類分布圖Fig.3 The microbial composition at phylum level

疣微菌門一些細(xì)菌在宿主的免疫刺激和代謝信號傳導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用[19]。研究表明,腫瘤引起人和動物腸道菌群結(jié)構(gòu)顯著改變,如早期肝癌患者疣微菌門(Verrucomicrobia)細(xì)菌比健康人群明顯減少[20]。與正常組比較,模型組小鼠腸道細(xì)菌擬桿菌門、厚壁菌門和疣微菌門豐度均差異顯著(P<0.05),其中模型組擬桿菌門豐度比正常組增加41.03%,厚壁菌門和疣微菌門豐度分別比對照組減少43.24%和60.77%(P<0.05)。與模型組比較,熊果酸各劑量組擬桿菌門相對豐度均有所減少,其中熊果酸中高劑量組差異顯著(P<0.05)。熊果酸中高劑量組小鼠厚壁菌門和疣微菌門豐度比模型組增加,其中疣微菌門豐度差異顯著(P<0.05)。顯示熊果酸各劑量組菌群在門水平的比例和分布更接近正常組,表明熊果酸對腫瘤小鼠腸道細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)具有正向的調(diào)節(jié)作用。

2.3.3 熊果酸對肝癌移植瘤小鼠腸道菌科水平影響 24個樣品共包括56個科。Muribaculaceae菌群與復(fù)雜碳水化合物的降解有關(guān),約占小鼠腸道菌群的一半[21],與以上結(jié)論一致,各組小鼠中Muribaculaceae豐度最高(約45%～60%)。在急性肝衰竭小鼠中豐度顯著增加,提示Muribaculaceae與肝衰竭及其并發(fā)癥的發(fā)病機制有關(guān)[22]。從圖4可以看出,模型組小鼠Muribaculaceae豐度比對照組顯著增加(P<0.05),而熊果酸各劑量組Muribaculaceae豐度均比模型組減少,其中熊果酸中、高劑量組差異顯著(P<0.05)。毛螺菌科(Lachnospiraceae)能發(fā)酵膳食纖維產(chǎn)生的短鏈脂肪酸(SCFA),具有降低腸道炎癥反應(yīng)、提高粘膜屏障等功能[23]。與對照組比較,模型組小鼠毛螺菌科豐度比對照組顯著減少(P<0.05),熊果酸各劑量組毛螺菌科豐度與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。Giorgia等[24]研究發(fā)現(xiàn),瘤胃菌科(Ruminococcaceae)豐度較高癌癥患者的生存時間顯著高于瘤胃菌科豐度較低的患者,腸道瘤胃菌科細(xì)菌可能通過激活免疫系統(tǒng)來增強抗腫瘤反應(yīng)。模型組小鼠瘤胃菌科豐度比對照組顯著減少(P<0.05),而熊果酸各劑量組瘤胃菌科豐度均比模型組顯著增加(P<0.05)。表明腫瘤造模后小鼠腸道菌在科水平發(fā)現(xiàn)顯著改變。與模型組比較,熊果酸能減少Muribaculaceae等豐度,而提高毛螺菌科和瘤胃菌科等豐度,使小鼠腸道菌群在科水平比例和分布更加接近于正常組,表明熊果酸對模型小鼠腸道細(xì)菌菌群紊亂具有一定恢復(fù)作用。

圖4 科水平微生物種類分布圖Fig.4 The microbial composition at family level

圖5 屬水平微生物種類分布(A)及菌群差異分析(B)Fig.5 The composition at genus level(A)and difference analysis of intestinal flora(B)

2.3.4 差異菌分析 從24個樣品中共鑒定出167個屬。從圖5A可知,正常組小鼠腸道細(xì)菌優(yōu)勢屬Akkermansia、Bacteroides、Lactobacillus、Ruminococcaceae_UCG-014、Muribaculum,而模型組小鼠腸道細(xì)菌優(yōu)勢屬為Muribaculum、Bacteroides、Akkermansia、Alistipes、Paramuribaculum,表明腫瘤能引起小鼠腸道細(xì)菌屬水平發(fā)生變化。與模型組比較,熊果酸低、中、高劑量組小鼠腸道細(xì)菌水平相對豐度分布更接近正常組,顯示熊果酸能影響腫瘤小鼠腸道細(xì)菌屬水平分布。

為分析熊果酸對腫瘤小鼠腸道菌影響,對不同實驗組之間差異菌群進行兩兩比較(圖5B)。Akkermansia屬能維持消化道健康,降低肥胖、糖尿病、炎癥等疾病的風(fēng)險。Akkermansia屬中的Akkermansiamuciniphila被稱為新抗癌明星細(xì)菌,能增加癌癥免疫治療效果上,減緩小鼠衰老速率,延長生存壽命[25]。本研究顯示,模型組小鼠腸道菌Akkermansia屬豐度比正常組極顯著減小(P<0.01),而熊果酸中高劑量組小鼠腸道菌Akkermansia屬比模型組極顯著增大(P<0.01)。關(guān)于熊果酸對小鼠腸道菌Akkermansiamuciniphila的影響,以及熊果酸增加Akkermansiamuciniphila豐度與抗腫瘤關(guān)系有待進一步研究。

乳酸菌(Lactobacillus)是一種常見益生菌。研究表明,乳酸菌可通過抑制腸道中的致癌物質(zhì)、調(diào)節(jié)機體免疫和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等途徑發(fā)揮抗腫瘤作用[26]。Intestinimonas可能與多種疾病相關(guān),糖尿病和肥胖患者,重金屬鎳中毒者腸道菌Intestinimonas豐度顯著減少[27]。圖5所示,模型組小鼠Lactobacillus和Intestinimonas豐度比對照組極顯著下降(P<0.01),熊果酸各劑量組小鼠腸道Lactobacillus和Intestinimonas豐度比模型組極顯著增加(P<0.01),表明熊果酸能提高腫瘤小鼠腸道有益菌的比例。Muribaculum與冠心病、糖尿病和應(yīng)急焦慮等疾病相關(guān)。劉程鵬等研究表明,糖尿病小鼠Muribaculum豐度增大,給小鼠灌胃功能食品后Muribaculum豐度減少[28]。與以上結(jié)論相似,本研究結(jié)果顯示腫瘤小鼠腸道菌Muribaculum比對照組極顯著增大(P<0.01),熊果中高劑量組能極顯著降低腫瘤小鼠Muribaculum豐度(P<0.01)。

環(huán)磷酰胺(CTX)是常見的免疫抑制劑,能引起腸道菌群乳酸桿菌、雙歧桿菌等益生菌豐度,導(dǎo)致腸道菌群紊亂[29]。與以上結(jié)論一致,本研究結(jié)果顯示環(huán)磷酰胺陽性對照組Lactobacillus豐度比對照組和模型組均極顯著減少(P<0.01)。Daillère等[30]研究發(fā)現(xiàn),CTX可以驅(qū)使腸道菌群中的Enterococcushirae和Barnesiellaintestinihominis激活脾臟中T細(xì)胞的抗癌免疫應(yīng)答,顯著提高CTX的抗腫瘤效果。本研究結(jié)果顯示,陽性對照組Barnesiella豐度比模型組極顯著增加(P<0.01),關(guān)于環(huán)磷酰胺抗腫瘤與腸道菌關(guān)系有待進一步研究。

3 結(jié)論

熊果酸廣泛分布于熊果、梔子、山楂、濕生蕾、女貞子、車前草、毛子草等植物中,具有抗腫瘤、降血糖、抗瘧疾、消炎抗菌、肝損傷的保護等多種生物學(xué)效應(yīng),其中以抗腫瘤作用為主。熊果酸還具有毒副作用小、自然界資源豐富等優(yōu)勢,具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景,有望成為一種高效低毒的抗腫瘤新藥[31]。本研究通過分析熊果酸對H22肝癌小鼠腸道菌群的影響,顯示熊果酸各劑量組腫瘤質(zhì)量均比模型組顯著降低(P<0.05),熊果酸各劑量組小鼠T細(xì)胞亞群和IL-2含量均比模型組高,其中中劑量組和高劑量組與模型組差異顯著(P<0.05),顯示熊果酸能增強腫瘤小鼠免疫活性,抑制腫瘤生長。

熊果酸能改變了小鼠腸道細(xì)菌組成,在門水平上,與正常組比較,模型組小鼠擬桿菌門豐度顯著增加,而厚壁菌門顯著減少(P<0.05)。在科水平,模型組小鼠Muribaculaceae豐度比正常組顯著增加(P<0.05),而毛螺菌科和瘤胃菌科等豐度比對照組顯著減少(P<0.05)。熊果酸各劑量組腸道細(xì)菌在門水平和科水平的比例和分布均比模型組更接近正常組。熊果酸還能增加Akkermansia和Lactobacillus等有益菌豐度,表明熊果酸能改善腫瘤小鼠腸道細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu),對腫瘤模型小鼠腸道細(xì)菌菌群紊亂具有一定恢復(fù)作用。熊果酸的抗腫瘤作用可能與改善腸道菌群有關(guān),其相關(guān)機制有待進一步研究。