樟樹精油及其單體抗白色念珠菌活性及安全性研究

孫偉杰,雷 博,何 園,馬淑梅,劉 楠,梅其炳,劉 莉,*

(1.西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,四川瀘州 646000; 2.中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院藥理評價研究中心,上海 200040)

近年來,食品安全事件頻發(fā),物理性、化學(xué)性、生物性危害層出不窮,其中病原微生物污染逐漸增多,它能引起多種食源性疾病,對人類可能會造成嚴(yán)重甚至是致命的影響[1-4]。因此,迫切需要尋找新型、有效、安全的抗菌藥物。植物精油能以接觸或熏蒸的方式在食物周圍形成抑菌氛圍而達(dá)到防腐保鮮的作用,此類精油是人類開發(fā)綠色抗氧化劑和抗菌防腐劑的重要原料[5-8]。樟樹(Cinnamomumcamphora),又名香樟、烏樟、樟木、芳樟等,其盛產(chǎn)于我國沿海一帶,廣西、江西、福建、臺灣、湖南、湖北、四川、云南等地均有,以臺灣產(chǎn)量最大[9-12]。從樟樹提取的樟樹精油具有芳香氣味和良好的防腐、消炎、抗病毒、殺菌、殺蟲等活性,目前被應(yīng)用于香料、醫(yī)藥和食品工業(yè)等生活領(lǐng)域[13-14]。白色念珠菌(Candidaalbicans)或稱白色假絲酵母,其廣泛存在于各種野生動物和家禽、家畜的腸道中,如牛、豬、雞等,它可以通過動物攜帶者或患者糞便污染外環(huán)境,從而污染食物尤其是肉類食品引起傳播,導(dǎo)致一些疾病[15-18]。

周海旭等[19]通過抑菌試驗表明了樟葉精油對革蘭氏陰性菌(大腸桿菌、綠膿桿菌)和革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌、枯草桿菌)均具有不同程度的抑制作用,且后者比前者對樟葉精油耐抗性強(qiáng)。Wu等[20]發(fā)現(xiàn)樟樹精油具有明顯的氣相抗菌活性,它誘導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞膜破裂,增加細(xì)菌細(xì)胞的通透性,增加細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的滲漏,改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),從而影響細(xì)胞的正常生長和生理代謝。Chen等[21]發(fā)現(xiàn)樟樹精油對MRSA、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、枯草芽孢桿菌、雞沙門氏菌和大腸埃希菌具有良好的抗菌活性,且表明樟樹精油通過破壞細(xì)胞膜和干擾氨基代謝,表現(xiàn)出抗MRSA活性。目前對樟樹精油抗細(xì)菌的研究逐漸增多,但是對真菌的研究還較少,而且白色念珠菌的感染率近年來明顯增高,且其安全性尚未可知,這決定了樟樹精油能否得到進(jìn)一步應(yīng)用。

本文通過研究樟樹精油及其單體抗白色念珠菌的活性及其安全性,為樟樹精油抗真菌的開發(fā)利用和開發(fā)綠色安全、無污染的食品防腐劑提供理論參考,促進(jìn)食品工業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豚鼠 平均體重為(250±10) g左右的42只白色清潔級雌性豚鼠,小鼠 平均體重為(20.0±0.5) g左右的75只ICR雄性小鼠，購買于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司;飼料 南通特洛菲飼料科技有限公司;樟樹精油、1,8-桉葉油素、檜烯、α-松油醇、3-蒈烯、松油烯-4-醇、α-松油烯、異松油烯、檸烯 四川宸煜林業(yè)開發(fā)有限責(zé)任公司;葡萄柚、檸檬、熏衣草精油 菓凱化妝品有限公司;MH瓊脂培養(yǎng)基、MH肉湯 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;白色念珠菌(ATCC 98001) 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所真菌室;脫毛膏 利潔時家化有限公司。

370 Series CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 Thermo Fisher Scientific公司;SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司;全波長多功能酶標(biāo)儀 Thermo Fisher Scientific公司;7890B氣相色譜儀、5977B質(zhì)譜檢測器 安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液的制備 取白色念珠菌菌種于MH肉湯活化24 h,然后再轉(zhuǎn)移至MH瓊脂培養(yǎng)基分離單個菌落,在超凈臺上,用移液槍吸取MH肉湯培養(yǎng)基3 mL,加入已經(jīng)滅菌的試管中,然后再用接種環(huán)在MH瓊脂培養(yǎng)基中挑取單個菌落,加到MH肉湯中,放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),培養(yǎng)時間24 h,培養(yǎng)溫度37 ℃。

1.2.2 抗菌活性的測定

1.2.2.1 紙片法 將菌懸液稀釋到1×106CFU/mL,再將無菌棉簽浸入該菌懸液中。在試管內(nèi)壁液面上方旋轉(zhuǎn)數(shù)次并緊壓棉簽,擠出多余的菌液。用棉簽快速均勻地涂布在瓊脂培養(yǎng)基表面,然后繞平板邊緣涂抹一周,重復(fù)三次。將滅好菌的濾紙片放在待測液中浸泡1 min,充分吸收后,用無菌鑷子取出紙片輕輕貼放于平板表面。將平皿置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后,觀察并測量抑菌圈的直徑。實驗重復(fù)3次,取平均值。

1.2.2.2 微量肉湯稀釋法 將菌懸液稀釋到1×106CFU/mL,采用二倍稀釋法用無菌生理鹽水將待測物配制成不同的濃度(DMSO含量為0.05%),在96孔板上將不同濃度的待測物與等量MH肉湯混合,使?fàn)I養(yǎng)肉湯含精油濃度為8～64 μL/L,同時設(shè)置空白對照組和只加菌液的模型組。每組設(shè)置3個平行實驗孔。37 ℃培養(yǎng)48 h。觀測結(jié)果:澄清透明的孔說明能夠抑制可見菌生長的最低抑菌濃度即MIC。

1.2.3 樟樹精油成分分析 利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,對樟樹精油進(jìn)行揮發(fā)性成分檢測。吸取10 μL精油,溶解在1 mL丙酮溶液,0.45 μm微孔過濾膜過濾,上機(jī)測定。GC-MS條件:色譜柱:HP-5毛細(xì)管色譜柱(30 m×250 μm×0.25 μm),進(jìn)樣口溫度250 ℃,載氣為高純He,載氣流量為1.0 mL/min;柱溫:程序升溫60～200 ℃,初始溫度60 ℃保持1 min,再以14 ℃/min升至200 ℃,容積延遲3 min;進(jìn)樣量為1 μL,分流比1∶20。質(zhì)譜接口溫度250 ℃;電離方式為EI;電子能量70 eV;離子源溫度:230 ℃;掃描范圍20～550 m/z。各組分分別與標(biāo)準(zhǔn)譜庫進(jìn)行檢索匹配,并結(jié)合文獻(xiàn)報道進(jìn)行定性分析。定量分析按峰面積歸一化法計算各峰面積的相對含量。

1.2.4 樟樹精油各組分的抑菌活性 參照1.2.2.1紙片法測定各組分對白色念珠菌的抑菌圈直徑。

1.2.5 豚鼠皮膚刺激性實驗 動物飼養(yǎng)于上海醫(yī)藥工業(yè)研究院實驗動物房適應(yīng)性喂養(yǎng)一周,實驗期間動物自由飲水,攝食,溫度:20～26 ℃,相對濕度30%～70%,人工照明12 h明暗交替,通風(fēng)良好。參考杜建紅等[22]將42只豚鼠分成14個組,每組3只,用脫毛膏給豚鼠背部兩側(cè)的用藥區(qū)進(jìn)行脫毛處理,分別吸取2%、4%的樟樹精油及其單體200 μL,滴于豚鼠背部,每天涂抹一次,對照組滴水,連續(xù)7 d,每天觀測豚鼠背部有無紅斑。評分規(guī)則為無紅斑可見為0分,紅斑勉強(qiáng)可見為1分,中度紅斑為2分,紫紅色紅斑并有焦痂形成為3分。

1.2.6 對小鼠皮膚毛細(xì)血管通透性的實驗 動物飼養(yǎng)于上海醫(yī)藥工業(yè)研究院實驗動物房適應(yīng)性喂養(yǎng)一周,實驗期間動物自由飲水,攝食,溫度:20～26 ℃,相對濕度30%～70%,人工照明12 h明暗交替,通風(fēng)良好。將ICR小鼠隨機(jī)分為15組,每組5只。小鼠在給藥前1 d,用脫毛膏將小鼠背部脫毛(2.5 cm×3 cm)。實驗當(dāng)天分別于脫毛處涂上2%、4%的樟樹精油及其單體,每天1次,對照組涂水,連續(xù)7 d。末次給藥1 h后每只小鼠在給藥處皮內(nèi)注射磷酸組胺0. 1 mL(0.1 μg),注射后立即由尾靜脈注射0.25%伊文思藍(lán)溶液(4 mL/kg),15 min 后脫臼處死。用角膜環(huán)鉆取下藍(lán)染部分的皮膚,剪碎后浸泡于丙酮-生理鹽水(7∶3)溶液2 mL中,48 h后離心,取上清液,用 UV 260紫外分光光度計在波長610 nm處,以丙酮-生理鹽水溶液空白校零,測定所取樣本的吸光度(A)值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 樟樹精油抗白色念珠菌的活性分析

采用紙片法和微量肉湯稀釋法測定的樟樹精油抗白色念珠菌活性與其他植物精油的比較結(jié)果見表1。紙片法結(jié)果顯示樟樹精油的抑菌圈為(10.78±1.48) mm,比葡萄柚、薰衣草、檸檬都要強(qiáng),同紙片法結(jié)果一樣,微量肉湯稀釋法結(jié)果顯示樟樹精油的MIC最小,為(10.67±4.62) μL/L。以上結(jié)果表明樟樹精油抗白色念珠菌活性高于葡萄柚、薰衣草、檸檬精油。

表1 樟樹精油抗白色念珠菌活性與 其他植物精油比較Table 1 Comparision of the Cinnamomum camphora essential oil anti-Candida albicans activity with other plant essential

2.2 樟樹精油化學(xué)成分分析

采用GC-MS對樟樹精油的化學(xué)成分分析結(jié)果如圖1和表2。圖1是樟樹精油的總離子流色譜圖,從圖中可以看出共顯示出16個峰,各組分分別與標(biāo)準(zhǔn)譜庫進(jìn)行檢索匹配,鑒定出其中14個化學(xué)成分,按峰面積歸一化法計算各峰面積的相對含量,14個化學(xué)成分占樟樹精油總相對含量的97.22%。其中1,8-桉葉油素含量最高,為48.02%,其次是檜烯、α-松油醇、3-蒈烯、松油烯-4-醇、α-松油烯、異松油烯、檸烯等。樟樹精油根據(jù)主成分劃分為五種化學(xué)類型,即芳樟型、腦樟型、桉樟型、龍樟型和異樟型[23]。芳樟型,主含77.4%的芳樟醇;腦樟型,主含75%的樟腦;桉樟型,主含41.53%的桉葉油素;龍樟型,主含74.42%的龍腦;異樟型,主含29.41%的異橙花叔醇。以上結(jié)果表明本試驗所用的樟樹精油屬于桉樟型樟樹精油,且化學(xué)含量大于2%的有8種,分別為1,8-桉葉油素、檜烯、α-松油醇、3-蒈烯、松油烯-4-醇、α-松油烯、異松油烯、檸烯。

圖1 樟樹精油的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of Cinnamomum camphora essential oil注:化合物編號與表2相對應(yīng)。

表2 樟樹精油的化學(xué)成分及其含量Table 2 Composition and content of Cinnamomum camphora

2.3 樟樹精油單體抗白色念珠菌活性分析

通過紙片法測定的樟樹精油單體(含量2%以上)抗白色念珠菌活性的結(jié)果見表3。其中活性最強(qiáng)的是α-松油醇,抑菌圈為(26.70±1.03) mm,其次是異松油烯、α-松油烯、松油烯-4-醇、檜烯、1,8-桉葉油素。而3-蒈烯、檸烯對白色念珠菌沒有抑菌活性。1,8-桉葉油素具有解熱鎮(zhèn)痛、祛痰止咳、抗病毒、抗腫瘤、抗菌等多方面的藥理活性[24]。胡文杰等[25]發(fā)現(xiàn)1,8-桉葉油素能夠使尖孢鐮刀菌菌絲的生長、孢子的萌發(fā)發(fā)生較明顯的變化。凌天冀等[26]研究了桉葉油對5種細(xì)菌的最低殺菌濃度,并對桉葉油與丹參、青霉素、鏈霉素、卡那霉素與金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌等的聯(lián)合抗菌作用做了初步實驗研究,證實桉葉油除有廣泛的抗菌作用外,還是一種有效的抗菌增強(qiáng)劑。根據(jù)GC-MS所呈現(xiàn)出的化學(xué)成分含量,1,8-桉葉油素含量最高,但抗菌活性相對較弱,這可能是因為白色念珠菌是真菌,它的細(xì)胞壁不同于細(xì)菌細(xì)胞壁的組成成分[27],因此它的抑菌活性沒有α-松油醇、異松油烯等強(qiáng)。檜烯含量為11.43%,α-松油醇含量為10.15%,但α-松油醇所產(chǎn)生的抑菌圈卻是檜烯的2倍左右。異松油烯抑菌活性比α-松油烯、松油烯-4-醇、檜烯、1,8-桉葉油素活性要強(qiáng),但含量卻很低。以上結(jié)果表明樟樹精油抗白色念珠菌的活性來源是α-松油醇、異松油烯、α-松油烯、松油烯-4-醇、檜烯、1,8-桉葉油素。

表3 樟樹精油單體抗白色念珠菌活性Table 3 Anti-Candida albicans activity of Cinnamomum camphora essential oil

表4 樟樹精油及其單體對豚鼠皮膚刺激性影響Table 4 Effects of Cinnamomum camphora essential oil and its composition on skin irritation of guinea

2.4 樟樹精油及其單體對豚鼠皮膚刺激性影響

樟樹精油及有抗白色念珠菌活性的單體(以上6種)進(jìn)行豚鼠皮膚刺激性實驗結(jié)果見表4。精油可以通過三種方式進(jìn)入人體:皮膚系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)。大多數(shù)純精油不可直接和皮膚接觸,須混合于基礎(chǔ)油中使用,基礎(chǔ)油一般采用冷壓萃取的高質(zhì)量植物油,常見的如荷荷巴油、甜杏仁油、玫瑰籽油。結(jié)果顯示4%樟樹精油在連續(xù)涂抹5 d后會出現(xiàn)輕微的紅斑,4%松油烯-4-醇在涂抹2 d后會出現(xiàn)輕微的紅斑。α-松油醇、異松油烯、α-松油烯、檜烯、1,8-桉葉油素對豚鼠皮膚皆沒有刺激性。以上結(jié)果表明樟樹和松油烯-4-醇可能會對皮膚產(chǎn)生損傷作用。

2.5 樟樹精油及其單體對毛細(xì)血管通透性的影響

樟樹精油及有抗白色念珠菌活性的單體(以上6種)對毛細(xì)血管通透性的影響結(jié)果見表5。與對照組比較,2%松油烯-4-醇組毛細(xì)血管通透性增加,但沒有顯著性差異,4%松油烯-4-醇組毛細(xì)血管通透性極顯著增加(P<0.01)。2%和4%檜烯有增加毛細(xì)血管通透性的趨勢,但沒有明顯差異,而α-松油醇、異松油烯、α-松油烯、1,8-桉葉油素對毛細(xì)血管通透性都沒有影響。以上結(jié)果表明4%松油烯-4-醇會使皮膚毛細(xì)血管通透性增加。

表5 樟樹精油及其單體 對毛細(xì)血管通透性影響Table 5 Effects of Cinnamomum camphora essential oil and its composition on vascular

3 結(jié)論

本研究對樟樹精油及其單體抗白念菌的效果進(jìn)行了測定,同時也比較了樟樹精油和其他幾種植物精油的抗菌效果,結(jié)果表明樟樹精油的抗菌效果強(qiáng)于葡萄柚、檸檬、薰衣草精油。同時又通過質(zhì)譜儀對樟樹精油的成分進(jìn)行了分析,根據(jù)分析結(jié)果,選擇了含量較高的單體進(jìn)行抗白念的抗菌實驗,實驗結(jié)果表明,多種單體對白念菌具備較好的抗菌效果,但其活性的主要來源還需進(jìn)一步研究。最后也對樟樹精油及其單體的安全性進(jìn)行了動物實驗?zāi)Ｐ偷脑u價,結(jié)果表明樟樹精油及其單體具有較好的生物安全性。結(jié)果對食品安全以及醫(yī)藥領(lǐng)域具有一定的指導(dǎo)意義。