人源磷脂酶PLA2異源可溶表達(dá)純化及酶學(xué)分析

馬文君,滕 琳,田順利,郭校燕,王培培,鄭春陽(yáng),衛(wèi)宏遠(yuǎn)

(1.天津大學(xué),天津 300350; 2.天津強(qiáng)微特生物科技有限公司,天津 300384; 3.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院保健醫(yī)療部,天津 300052)

磷脂是自然界最主要的表面活性劑,因其良好的乳化、分散能力,使其在生物醫(yī)藥、食品、護(hù)膚品領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用[1-2]。目前,市場(chǎng)對(duì)高純度磷脂、單一磷脂和稀有磷脂的要求越發(fā)迫切。常用改性磷脂是實(shí)現(xiàn)上述需求的有效途徑。常用改性磷脂的原理是將單個(gè)或多個(gè)組分從基質(zhì)中分離出來(lái),在其基礎(chǔ)上對(duì)天然磷脂的極性頭部進(jìn)行修飾[3]。磷脂的酶法改性具有明顯優(yōu)于物理化學(xué)改性的優(yōu)勢(shì),如環(huán)境友好,專一性強(qiáng)、效率高等特點(diǎn)[4];磷脂的水解、酯化反應(yīng)也因多種磷脂酶的選擇,使磷脂產(chǎn)物更加豐富多樣。

磷脂酶A2(PLA2)是一種水溶性的小分子蛋白質(zhì),具有sn-2-?；饷富钚?可把磷脂水解生成游離脂肪酸和溶血磷脂。PLA2一般分為三大類,分泌型、胞質(zhì)型、鈣離子非依賴型[5]。磷脂酶A2與脂肪酶的序列具有同源性,具有一些脂肪酶活性[6],陳瓊等將PLA2用于部分水解甘油三酯(TAG)制備富甘油二酯(DAG)[7]。PLA2還可用于植物油脫膠,但因其來(lái)源少,價(jià)格高,大規(guī)模應(yīng)用受到限制[8-9]。此外,PLA2還能放入飼料中增加磷脂利用率,其本身和產(chǎn)物溶血磷脂都可以作為乳化劑應(yīng)用,作為化妝品成分還具有保濕、促滲透作用,其應(yīng)用非常廣泛。

目前,市場(chǎng)上有部分植物和微生物來(lái)源的PLA2具有較高的酶活力[10],但其昂貴的價(jià)格限制其在磷脂行業(yè)的應(yīng)用。為了有效地利用PLA2對(duì)磷脂進(jìn)行改性,生產(chǎn)高附加值的磷脂類產(chǎn)品,除了從自然界中篩選和誘變育種等傳統(tǒng)方法,可通過(guò)分子克隆與基因重組技術(shù)將基因進(jìn)行克隆表達(dá)[11],以期實(shí)現(xiàn)研究其酶學(xué)性質(zhì)和大規(guī)模生產(chǎn)的目標(biāo)。

人磷脂酶A2不僅可以水解甘油磷脂以產(chǎn)生游離脂肪酸和溶血磷脂[12],還可以催化花生四烯酸從細(xì)胞膜磷脂釋放,使得人磷脂酶A2在治療皮膚病(如紅斑狼瘡、濕疹、牛皮蘚等)有顯著療效[13-14]。人磷脂酶A2的原核生物表達(dá),大多呈包涵體表達(dá),本研究通過(guò)基因重組技術(shù),可溶表達(dá)人源PLA2,并對(duì)其進(jìn)行純化,旨在以較低成本制備高質(zhì)量的重組 PLA2,為后期對(duì)磷脂進(jìn)行酶解改性提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

大腸桿菌EscherichiacoliDH5α、EscherichiacoliBL21(DE3) 均由本實(shí)驗(yàn)室保存;pET28a-MBP質(zhì)粒 由本實(shí)驗(yàn)保存、pET28a-MBP-PLA2由本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建;磷脂酶A2Sigma公司;限制性內(nèi)切酶 NEB公司;膠回收試劑盒 Promega 公司;質(zhì)粒小提試劑盒 天根生物公司;SDS-PAGE 電泳凝膠試劑盒 強(qiáng)微特生物;高保真PCR聚合酶 強(qiáng)微特生物;實(shí)驗(yàn)所用純化填料 美國(guó)GE公司;其他試劑 國(guó)產(chǎn)分析純。

AKTApurifierTM100純化系統(tǒng) 美國(guó)GE公司;SCIE10TI-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 中國(guó)寧波新芝;垂直電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司;凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)UVP公司;GL-21M高速冷凍離心機(jī) 中國(guó)湘儀公司;UV3100紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人源PLA2基因的克隆及載體構(gòu)建 根據(jù)NCBI上人源PLA2(PLA2G10)基因編碼的氨基酸序列信息及催化反應(yīng)的信息,確定為本實(shí)驗(yàn)的目的克隆序列。通過(guò)信號(hào)肽分析程序?qū)Υ诵蛄羞M(jìn)行信號(hào)肽分析,確定目的基因序列。將序列信息提交給通用生物公司,通過(guò)密碼子優(yōu)化后,將目的基因片段合成后插入到pET28a+上,得到pET28a-PLA2質(zhì)粒。通過(guò)Snapgene設(shè)計(jì)麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)上下游引物,將MBP作為標(biāo)簽與人PLA2基因融合表達(dá),上游引物P1:GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCatgaa aatcgaagaaggtaaactg;下游引物P2:GGACCCGGCAGC AGCAGCAGCATATTGGATTGGAAGTACAGGTTTTCC TCGATCCCagtctgcgcgtctttcagggc;設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增pET28a-PLA2骨架的引物,上游引物P3:ATGCTGC TGCTGCTGCCGGGTCC;下游引物P4:CCCGGCAGC AGCAGCAGCATATTGGATTGGAAGTACAGGTTTTCCT CGATCCCTTTTGGAGGATGGTCGCCAC。

首先以P1、P2為引物對(duì),PCR擴(kuò)增MBP基因片段,再以P3、P4為引物對(duì),PCR擴(kuò)增pET28a-PLA2骨架,PCR的擴(kuò)增條件為:98 ℃,3 min;(98 ℃,10 s;65 ℃,30 s;72 ℃,3:30 min)×30 cycles;72 ℃,7 min。將得到的兩個(gè)片段采用膠回收試劑盒進(jìn)行片段回收,回收的片段以摩爾比1∶1～1∶10(MBP片段的摩爾數(shù)>pET28a-PLA2骨架的摩爾數(shù))于室溫采用同源重組的方法進(jìn)行連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài),篩選陽(yáng)性克隆,并進(jìn)行測(cè)序鑒定[15]。經(jīng)鑒定的重組表達(dá)載體為pET28a-MBP-PLA2,轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,用Kan抗性平板進(jìn)行轉(zhuǎn)化子篩選,正確的克隆于-80 ℃進(jìn)行保存。

1.2.2 PLA2的誘導(dǎo)表達(dá)及條件優(yōu)化 將-80 ℃保藏的重組表達(dá)菌株pET28a-MBP-PLA2-BL21(DE3)復(fù)蘇后,接種于5 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中,37 ℃,100 r/min振蕩過(guò)夜活化。將活化的pET28a-MBP-PLA2-BL21(DE3)繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)接種于100 mL含有卡那抗生素的LB液體培養(yǎng)基中,當(dāng)菌液A600達(dá)0.5～0.7時(shí),加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0.1～1 mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)條件優(yōu)化確定誘導(dǎo)劑IPTG的加入量及誘導(dǎo)溫度為0.5 mmol/L IPTG,16 ℃誘導(dǎo)過(guò)夜。6000×g離心10 min收集菌體,超聲破菌后(超聲功率300 W,超聲2 s暫停2 s,超聲時(shí)間5 min),離心得到菌液上清和沉淀,再用0.5 mmol/L Tris-HCl將沉淀復(fù)溶,進(jìn)行 SDS-PAGE分析,配置10%分離膠和5%濃縮膠,恒定功率10 W電泳45 min[16]。

由于橡膠草懸浮細(xì)胞的pH值變化與細(xì)胞增殖相關(guān)，在緩慢生長(zhǎng)期（0～4 d）pH值由6.5迅速下降到5.7左右，懸浮細(xì)胞鮮重與干重緩慢增長(zhǎng)，此時(shí)懸浮細(xì)胞的增殖十分緩慢。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（4～12 d）保持穩(wěn)定，基本維持在pH值5.7左右，懸浮細(xì)胞鮮重與干重明顯呈上升趨勢(shì)，懸浮細(xì)胞迅速增殖。在12 d之后，pH值由5.7上升到6.8，同時(shí)，懸浮細(xì)胞的鮮重呈緩慢增長(zhǎng)，然而懸浮細(xì)胞的干重出現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)，可能環(huán)境不利于懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)。在懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)期間，第12天具有最大干重（圖5）。結(jié)果表明，懸浮細(xì)胞處于不同生理狀態(tài)時(shí)，會(huì)使培養(yǎng)液的pH值發(fā)生改變，這也是細(xì)胞對(duì)外界環(huán)境所做出的響應(yīng)。

1.2.3 PLA2的酶活測(cè)定 為了初步驗(yàn)證重組蛋白是否正確表達(dá),是否具有水解卵磷脂的活性,本實(shí)驗(yàn)采用硼砂卵黃平板對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)后的粗酶液進(jìn)行初步的酶活定性分析。取50～200 μL濃縮10倍的細(xì)胞破碎上清加入硼砂卵黃平板上的牛津杯中,37 ℃溫育12～24 h,觀察透明水解圈的產(chǎn)生情況來(lái)驗(yàn)證重組蛋白有無(wú)活性,并根據(jù)水解圈的大小初步確定重組酶酶活的大小[17]。

1.2.4 PLA2的純化 將誘導(dǎo)后收集的pET28a-MBP-PLA2-BL21(DE3),均勻懸浮于50 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)溶液中,經(jīng)超聲破菌后,20000×g離心,收集上清,經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后,首先采用Q柱純化,經(jīng)Q-A buffer(20 mmol/L Tris-HCl pH8.0,1 mmol/L EDTA,5%甘油)洗滌后,采用Q-B buffer(20 mmol/L Tris-HCl(pH8.0),1 mmol/L EDTA,5%甘油,1 mol/L NaCl)進(jìn)行洗脫,收集洗脫組分。洗脫組分經(jīng)硫酸銨沉淀、離心后,采用疏水柱Phenyl進(jìn)行純化。采用Phenyl-A buffer(20 mmol/L Tris-HCl pH7.5,1.5 mol/L硫酸銨)進(jìn)行洗滌、平衡,采用Phenyl-B buffer(20 mmol/L Tris-HCl pH7.5)進(jìn)行洗脫。收集洗脫組分,采用Amylose親和柱進(jìn)行純化。采用Amylose-A(20 mmol/L Tris-HCl pH7.4,1 mmol/L EDTA,0.2 mol/L NaCl)進(jìn)行洗滌、平衡,采用Amylose-B(20 mmol/L Tris-HCl pH7.4,1 mmol/L EDTA,0.2 mol/L NaCl,10 mmol/L 麥芽糖)進(jìn)行洗脫,收集洗脫組分,進(jìn)行10% SDS-PAGE分析,具體方法參照1.2.2。

1.2.5 酶活分析 磷脂酶A2的酶活分析采用酸堿滴定法[18]:稱取一定量的卵磷脂,用50 mmol/L Tris-HCl pH8. 0進(jìn)行溶解,再加入10 g/L的Triton X-100 制成反應(yīng)底物,4 ℃冰箱避光保存?zhèn)溆?。分別加入9 mL的底物,20 μL 50 mmol/L的CaCl2溶液,另一組加入15 mL的乙醇作為對(duì)照,最后加入1 mL粗酶液,40 ℃反應(yīng)15 min,用一定濃度的NaOH滴定,通過(guò)計(jì)算消耗NaOH的量來(lái)得到磷脂酶A2的酶活。1 min解磷脂生成1 μmoL脂肪酸所需的磷脂酶A2的量定義為1 U,總蛋白含量測(cè)定方法參照牛血清白蛋白(BSA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū),結(jié)合總蛋白和總活力計(jì)算相應(yīng)比活力,得率和純化倍數(shù),計(jì)算公式如下:

1.2.5.1 pH對(duì)重組酶活性和穩(wěn)定性的影響 將純化得到的磷脂酶A2(10 μL)在50 ℃下預(yù)孵育30 min,以含有卵磷脂的反應(yīng)混合物為底物,以40 μL不同pH緩沖液(100 mmol/L乙酸鹽(pH4.0、5.0和6.0)、50 mmol/L三氯化甘油(pH7.0、8.0和9.0)、50 mmol/L甘氨酸pH10.0和11.0)和8 mmol/L CaCl2作為緩沖液進(jìn)行反應(yīng)[19]。

1.2.5.3 金屬離子對(duì)重組酶活性影響 將20 mmol/L 50 μL的重組酶添加到含有底物(卵磷脂)和30 mmol/L 100 μL不同金屬離子(Ca2+、Cu2+、Co2+、Zn2+、Na+、K+和Mn2+)的溶液中后測(cè)量活性。另外,以Triton X-100溶液為緩沖液進(jìn)行對(duì)照。通過(guò)將不同因素的酶活性除以對(duì)照組的100%,計(jì)算出重組酶的相對(duì)活性(%)[20]。

1.2.5.4 重組酶的底物特異性和動(dòng)力學(xué)特性分析 為研究重組磷脂酶A2對(duì)于不同甘油磷脂的底物特異性,將不同的底物磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)和二磷脂酰甘油(DPG)加入含有20 mL 50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH8.0)中作為底物[21]。用純化的重組磷脂酶A2(10 μL)于40 ℃下進(jìn)行反應(yīng),并將底物濃度從0.5 mg/mL增加到5.0 mg/mL。分別以1/[S]和1/V0為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo),通過(guò)使用Lineweaver-Burk圖測(cè)定選定底物的Vmax和Km值,研究重組酶A2對(duì)不同甘油磷脂的特異性和親和力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中每個(gè)處理重復(fù)3次,采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析,應(yīng)用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 人源PLA2基因的克隆與載體構(gòu)建和表達(dá)

根據(jù)信號(hào)肽分析顯示,人PLA2(PLA2G10)前31個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列,因此本實(shí)驗(yàn)化學(xué)合成了PLA2自32位氨基酸之后的序列作為本實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象。通過(guò)同源重組將MBP促溶標(biāo)簽片段與PLA2基因片段共同構(gòu)建于pET28a載體上,構(gòu)建載體pET28a-MBP-PLA2,構(gòu)建載體如圖1所示,使目的蛋白與MBP融合表達(dá)。通過(guò)采用T7/T7t引物對(duì),對(duì)構(gòu)建的載體進(jìn)行PCR驗(yàn)證表明,如圖2,獲得1500 bp左右的目的條帶與1101 bp的MBP基因和438 bp的PLA2基因相加之和相吻合。并通過(guò)進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證,證實(shí)目的載體構(gòu)建成功。經(jīng)IPTG(最佳添加量為0.5 mmol/L)在低溫誘導(dǎo)過(guò)夜后,重組融合蛋白(～60 kDa)在上清中大量表達(dá)(如圖3)。同時(shí),觀察硼砂卵黃平板上透明圈(如圖4),陰性對(duì)照即沒(méi)有添加磷脂酶的緩沖溶液并沒(méi)有形成明顯的水解透明圈,樣品組與陽(yáng)性對(duì)照sigma的磷脂酶PLA2均形成明顯透明圈,說(shuō)明目的蛋白得到正確表達(dá)。

圖1 表達(dá)載體pET28a-MBP-PLA2構(gòu)建Fig.1 Construction of expression vector pET28a-MBP-PLA2

圖2 pET28a+-MBP-PLA2重組載體的PCR驗(yàn)證結(jié)果Fig.2 Identification of PCR product注:1,2都為PCR產(chǎn)物。

圖3 表達(dá)產(chǎn)物的 10% SDS-PAGE 鑒定Fig.3 SDS-PAGE(10%)profile of expressed recombinant protein注:1:誘導(dǎo)前全菌;2:誘導(dǎo)后全菌; 3:誘導(dǎo)后上清;4:誘導(dǎo)后沉淀。

圖4 卵黃平板法檢測(cè)粗酶活性Fig.4 Activity determination of phospholipase activity of PLA2注:0號(hào)陰性對(duì)照為加入200 μL 50 mmol/L Tris-HCl(pH8. 0)溶液,1號(hào)陽(yáng)性對(duì)照為加入200 μL Sigma 磷脂酶A2,2～5號(hào)樣品組分別為加入 200、150、100和50 μL濃縮10倍的細(xì)胞破碎上清。

本實(shí)驗(yàn)中重組磷脂酶A2單獨(dú)表達(dá)呈包涵體狀,嘗試了其余多種促溶標(biāo)簽融合表達(dá),包括Sumo、GST、MBP等,但經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后,Sumo、GST促溶標(biāo)簽蛋白并不能使重組蛋白PLA2可溶表達(dá),而僅以MBP為促溶標(biāo)簽的融合蛋白是可溶性表達(dá)的。MBP是一種大腸桿菌的內(nèi)源性的蛋白質(zhì),由大腸桿菌K12的malE基因編碼,分子量為42 kDa,在大腸桿茵中具有極高的表達(dá)量。在目的蛋白的氨基端添加該標(biāo)簽蛋白時(shí),可大幅度地提高目的蛋白的可溶性表達(dá)量,并且可幫助目的蛋白在大腸桿菌中正確折疊并保持原有的活性[22]。

表1 Recombinant-PLA2酶活和純化回收率分析Table 1 Analysis of enzyme activity and recovery rate for rhMBP-PLA2 purification

2.2 重組磷脂酶A2的分離純化

為了獲得純度較高的重組磷脂酶A2,本實(shí)驗(yàn)建立了如1.2.4方法所描述的純化步驟,經(jīng)超聲破碎的細(xì)胞上清液,依次經(jīng)過(guò)Q柱、疏水Phenyl柱、Amylose親和層析柱,最終獲得一條介于45.0～66.2 kDa之間的條帶(如圖5C),與預(yù)期的重組蛋白56.5 kDa大小相符,其純度達(dá)到90%以上,并測(cè)得純化后的融合磷脂酶A2比活力為127.04 U/mg(表1),純化倍數(shù)10.3,最終回收率約為48.8%。1 L重組菌培養(yǎng)后,經(jīng)本實(shí)驗(yàn)的表達(dá)、純化步驟,可得到約3.07 mg高純度的重組融合磷脂酶A2。

微生物來(lái)源的PLA2國(guó)內(nèi)外研究都比較少,導(dǎo)致PLA2酶價(jià)格昂貴,無(wú)法實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。盧冬梅等[23]對(duì) Aeropyrum pernix K1 的磷脂酶 A2基因在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá),蛋白純化后,以對(duì)硝基苯酚丙酸酯為底物測(cè)得的酶活為115 U/mg。劉愛(ài)霞等[24]利用紅色鏈霉菌PLA2基因構(gòu)建重組菌,以本實(shí)驗(yàn)定義酶活單位計(jì)算酶活為133 U/mg左右。本實(shí)驗(yàn)獲得的重組酶比活力為127.04 U/mg,與之前報(bào)道的結(jié)果具有一致性。本實(shí)驗(yàn)建立了穩(wěn)定的重組融合蛋白的純化條件:在Q柱純化過(guò)程中,經(jīng)測(cè)試20 mmol/L Tris-HCl(pH8.0),1 mmol/L EDTA,5%甘油,1 mol/L NaCl的緩沖液體系更適合維持融合蛋白的溶解度和穩(wěn)定性;硫酸銨達(dá)到50%～60%飽和度后,沉淀蛋白回收效率最高;此外,實(shí)驗(yàn)還通過(guò)TEV蛋白酶將重組融合PLA2蛋白的MBP標(biāo)簽切割下來(lái),進(jìn)行了酶活性分析,結(jié)果表明重組融合蛋白的活性與PLA2蛋白活性相似,鑒于采用TEV酶切割,再經(jīng)過(guò)去TEV酶的純化過(guò)程造成的損失,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行酶活反應(yīng)采用重組融合蛋白進(jìn)行(下同)。

圖5 重組融合磷脂酶A2蛋白的純化曲線Fig.5 Purification curves of recombinant PLA2注:(A-1,A-2)Q-瓊脂糖凝膠離子交換層析,(B-1,B-2)疏水層析結(jié)合Q離子交換層析(C-1,C-2)MBP融合蛋白的Amylose親和層析結(jié)合Q離子交換層析和疏水層析紅色虛框?yàn)槟繕?biāo)蛋白。

圖6 重組磷脂酶A2最適pH(A)最適溫度(B)及不同金屬離子(C)對(duì)酶活的影響Fig.6 Effects of pH,temperature and metal ions on the catalytic activity of rhMBP-PLA2注:a,b,c,d,e代表不同pH和離子間差異顯著性。

2.3 重組磷脂酶A2的酶學(xué)性質(zhì)分析

pH、溫度、金屬離子對(duì)純化后的重組磷脂酶A2酶活的影響,結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6A可知,在40 ℃下,重組磷脂酶A2的酶活隨著反應(yīng)pH呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),在7.0～8.0時(shí),相對(duì)活性維持在90%～95%,因此確定該酶最適反應(yīng)pH為8.0左右。

從圖6B可知,重組磷脂酶A2在pH為8.0時(shí),酶的最適溫度為40 ℃。溫度達(dá)到60 ℃仍保留50%的酶活力,在已報(bào)道的微生物來(lái)源的PLA2中,反應(yīng)最適溫度相對(duì)較高,一般為50 ℃甚至更高。

機(jī)體內(nèi)大約30%的酶發(fā)揮其生物活性均需要各種各樣金屬離子的參與,特別地,有一部分金屬如Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+等是人體正常新陳代謝所必需。重組磷脂酶A2依賴于金屬離子發(fā)揮功能。金屬離子不僅作為酶的激活劑,有些離子對(duì)酶還會(huì)起到抑制作用,由圖6C可知,不同金屬離子顯著影響重組酶的活性,尤其是加入30 mmol/L鈣離子,重組酶活性最高,這與重組酶有Ca2+的結(jié)合位點(diǎn)有關(guān),與相關(guān)文獻(xiàn)的研究結(jié)果一致[25]。而Co2+與Cu2+則對(duì)重組磷脂酶A2起到顯著抑制作用,主要是由于重金屬使得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,磷脂酶活性下降[26]。

通過(guò)研究酶與底物的親和力,本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了重組酶對(duì)不同酯基的酶解動(dòng)力學(xué)參數(shù),由表2可知重組磷脂酶A2對(duì)PC(卵磷脂)的親和力最高,Km值最小。此外,這一結(jié)果還說(shuō)明重組磷脂酶A2對(duì)不同的甘油磷脂具有不同的特異性和水解活性,這一研究結(jié)果與Liu等[27]研究吻合,從而進(jìn)一步證實(shí)了本實(shí)驗(yàn)結(jié)論的可靠性。

表2 重組磷脂酶A2的底物親和性質(zhì)Table 2 Substrate selectivity of rhMBP-PLA2

3 結(jié)論

本研究所構(gòu)建的重組菌可實(shí)現(xiàn)人源磷脂酶A2的異源可溶表達(dá),通過(guò)建立穩(wěn)定的純化工藝,最終重組磷脂酶A2得到了高質(zhì)量的純化,最終得到的重組酶純度大于90%,酶活為127.04 U/mg,純化倍數(shù)為10.3,活性回收率為48.8%。測(cè)得重組磷脂酶A2的最適溫度為40 ℃,最適pH為8.0。本試驗(yàn)建立的磷脂酶A2的異源表達(dá)、純化體系,為其進(jìn)一步的理論和工業(yè)研究奠定了基礎(chǔ)。