雙水相分離火龍果皮中色素和果膠

胡金梅,吳巧婷,謝晶晶,周 林

(1.廣東環(huán)境保護(hù)工程職業(yè)學(xué)院,廣東佛山 528216; 2.廣東藥科大學(xué),廣東廣州 510006)

火龍果(HylocereusundulatusBritt)又名紅龍果、青龍果、仙蜜果等,屬仙人掌科量天尺屬和蛇鞭柱屬植物?；瘕埞a(chǎn)于美洲地區(qū),在我國(guó)的貴州、云南、福建、兩廣地區(qū)均有種植[1]。目前栽培品種主要有紅皮白肉、紅皮紅肉、黃皮白肉三種。

火龍果皮是火龍果加工的主要副產(chǎn)品,通常被直接丟棄。果皮占整個(gè)火龍果質(zhì)量的25%左右,火龍果果皮含有一般植物少有的甜菜紅素(betalanins),其色澤鮮艷,是一種具有抗氧化[2]、降血脂[3]等生物活性的天然水溶性色素。雖然甜菜紅素可以從紅甜菜中提取,但紅甜菜中提取的甜菜紅素帶有土腥味、還含有吡嗪等有害物質(zhì);而火龍果中的甜菜紅素更具優(yōu)越性[4]。除了色素成分,火龍果皮中還含有豐富的果膠多糖。近年來,針對(duì)火龍果皮中色素、果膠成分提取的研究日益增多。如采用水和乙醇溶劑浸提、微波輔助提取甜菜紅色素[5-7]。采用酸提醇沉法、離子交換法、鹽沉淀法提取果膠[8-9]。

上述提取方法可以為火龍果資源開發(fā)所借鑒,但是傳統(tǒng)的水提法不易將果皮色素完全提取,且后續(xù)需要采用濃縮等方式[10],而乙醇溶劑容易破壞色素的性質(zhì)結(jié)構(gòu)[11],微波輔助等會(huì)產(chǎn)生熱量,均不利于色素結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。此外,這些方法主要針對(duì)單一色素或果膠成分的提取,原料利用尚不充分,影響到火龍果資源開發(fā)的經(jīng)濟(jì)性。與上述分離技術(shù)相比,雙水相萃取技術(shù)具有生物相容性好,目標(biāo)產(chǎn)物活性損失少,操作條件溫和,無有機(jī)溶劑殘留,設(shè)備簡(jiǎn)單,易于放大和連續(xù)操作等優(yōu)點(diǎn),特別適用于生物物質(zhì)的分離和提純[12]。因而探討雙水相體系同時(shí)萃取分離火龍果皮中甜菜紅素和果膠的工藝對(duì)于火龍果皮的開發(fā)具有積極意義。已有研究報(bào)道,采用聚乙二醇(PEG)/硫酸銨雙水相體系,可同時(shí)萃取甜菜根中的紅色素和多糖,70%～75%紅色素被富集到聚合物上相,鹽下相可富集80%～90%的多糖[13]。本研究采用雙水相體系中常見的PEG/硫酸銨體系,考察成相聚合物PEG的相對(duì)分子質(zhì)量和質(zhì)量分?jǐn)?shù)、鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、體系pH對(duì)色素和果膠提取的影響,為火龍果果皮的綜合利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

廣西金都一號(hào)紅心火龍果 佛山南海農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)采購(gòu);聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)1000、2000、4000、6000 化學(xué)純,中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司;硫酸銨、氫氧化鈉、濃鹽酸、無水乙醇 分析純,廣州化學(xué)試劑有限公司。

Bruker Tensor II傅里葉紅外光譜 布魯克儀器有限公司;UV-1800分光光度計(jì) 島津儀器有限公司;KQ-300V型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;GZX.9140MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;RE.52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、小型電動(dòng)粉碎機(jī) 上海亞榮生化儀器廠;雷磁PHS-3C酸度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器廠;AnkiTDL離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器;DZ-2BC II型真空干燥箱 天津泰斯特儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原材料的處理 選用新鮮火龍果果皮,除去雜質(zhì),避光風(fēng)干,粉碎機(jī)粉碎,過10目篩,得到果皮干粉置于玻璃干燥器內(nèi)室溫、避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PEG/鹽雙水相體系建立 稱取適量PEG,加入一定量水?dāng)嚢枞芙?加入適量硫酸銨,磁力攪拌器混合,再加入適量火龍果皮干粉,繼續(xù)攪拌30 min,靜置待兩相分層。分別收集上相、下相溶液,記錄體積V上和V下,計(jì)算相比R。

計(jì)算公式:

1.2.3 雙水相分離條件研究 采用單因素法分別考察PEG相對(duì)分子量和濃度、體系pH、硫酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)等因素對(duì)火龍果皮中色素含量和果膠萃取得率的影響,確定最佳雙水相萃取條件。

1.2.3.1 PEG相對(duì)分子量的影響 分別稱取30 g不同相對(duì)分子量PEG(1000、2000、4000、6000),加100 mL水溶解后,加入30 g硫酸銨,再加入1 g火龍果皮干粉攪拌均勻,溶液體系pH約5.0,計(jì)算雙水相的相比,色素與果膠的得率。

1.2.3.2 雙水相體系pH的影響 分別將30 g PEG2000、PEG4000用80 mL水溶解后,加入30 g硫酸銨攪拌,用鹽酸將pH分別調(diào)至2、3、4、5,加水至100 mL,再加入1 g火龍果皮干粉,攪拌均勻,按照1.2.2方法進(jìn)行操作,取適量上相紅色素提取液,室溫靜置48 h后,在400～650 nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描?？疾祗w系pH對(duì)萃取紅色素的穩(wěn)定性影響。

1.2.3.3 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 稱取30 g PEG4000,加100 mL水溶解后,分別加入不同質(zhì)量(5、10、15、20、25、30) g的硫酸銨,對(duì)應(yīng)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4%、7%、10%、13%、16%、19%,用鹽酸調(diào)至pH4,再加入1 g火龍果皮干粉攪拌均勻,按照1.2.2方法進(jìn)行操作,計(jì)算雙水相的相比,色素與果膠的得率。

1.2.3.4 PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 分別稱取不同質(zhì)量(5、10、15、20、25、30) g的 PEG4000、PEG6000,對(duì)應(yīng)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為7%、10%、13%、16%、19%,加100 mL水溶解后,加入30 g硫酸銨攪拌溶解,用鹽酸調(diào)至pH4,再加入1 g火龍果皮干粉攪拌均勻,按照1.2.2方法進(jìn)行操作,計(jì)算雙水相的相比,色素與果膠的得率。

1.2.4 色素提取液的測(cè)定

1.2.4.1 可見分光光譜掃描測(cè)試 火龍果皮經(jīng)PEG/硫酸銨雙水相萃取,上、下相分離后,取適量上相紅色素提取液,用去離子水稀釋后,在400～650 nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描。

1.2.4.2 紅色素含量和得率的測(cè)定 參考文獻(xiàn)方法[14],采用摩爾消光系數(shù)法計(jì)算紅色素粗取液中的甜菜紅素含量。

甜菜紅素含量(g/L)=(OD538×550.11)/61600

式中:OD538為吸光值;550.11為標(biāo)準(zhǔn)甜菜紅素摩爾分子量;61600為標(biāo)準(zhǔn)甜菜紅素摩爾消光系數(shù)。

甜菜紅素得率按照下式計(jì)算:

甜菜紅素得率(%)=[(C×N×V)/M]×100

式中:C為提取液中甜菜紅素含量,g/L;N為稀釋倍數(shù);V為提取液體積,L;M為火龍果皮干重,g。

1.2.5 果膠的測(cè)定

1.2.5.1 果膠的純化 火龍果皮經(jīng)PEG/鹽雙水相萃取,上、下相分離后,將下相提取物過濾,得到濾渣用20 mL水清洗3次去鹽,再用80 ℃熱水浸提30 min,然后過濾除渣。參考文獻(xiàn)[15]方法,濾液加入1.5倍體積的95%乙醇后靜置40 min,離心分離,收集離心沉淀,得到的凝膠狀液體即果膠,于55 ℃條件下干燥至恒重,稱量,并采用紅外光譜進(jìn)行表征分析。

1.2.5.2 紅外光譜定性分析 采用紅外光譜儀,壓片法測(cè)定。將干燥的果膠樣品與KBr壓制成片,在4000～400 cm-1波數(shù)范圍掃描測(cè)定光譜吸收值。

1.2.5.3 果膠得率計(jì)算公式

1.3 數(shù)據(jù)處理

色素和果膠的得率重復(fù)測(cè)定三次取平均值,采用Sigmaplot 14.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEG相對(duì)分子量對(duì)萃取的影響

考察PEG相對(duì)分子量對(duì)色素和果膠的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,當(dāng)雙水相體系鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定時(shí),隨著PEG相對(duì)分子量(1000、2000、4000、6000)增加,可以觀察到上相中紅色素的顏色逐漸加深;同時(shí)上相體積也逐漸增大,當(dāng)PEG相對(duì)分子量達(dá)到4000以上,相比開始趨于平穩(wěn)(圖1a)。上相中紅色素和下相中果膠的得率隨著PEG相對(duì)分子量的增加也呈上升趨勢(shì)(圖1b)。因此,PEG相對(duì)分子量增加有利于紅色素和果膠的分離。但是隨著PEG相對(duì)分子量增大,溶液的粘度也逐漸增大。因此,考慮到對(duì)于后續(xù)分離操作的影響,PEG的相對(duì)分子量選擇4000和6000較為合適。

圖1 PEG相對(duì)分子量對(duì)PEG/(NH4)2SO4 雙水相系統(tǒng)相比、色素和果膠得率的影響Fig.1 Effect of PEG relative molecular weight on phase volume ratio,yield of pigment and pectin under PEG/(NH4)2SO4 aqueous two-phase system

2.2 雙水相體系pH對(duì)萃取的影響

火龍果紅色素在堿性條件下不穩(wěn)定,文獻(xiàn)中已有相關(guān)分析[16],因此實(shí)驗(yàn)主要考慮pH<6的酸性條件下雙水相體系pH對(duì)紅色素和果膠的影響。另外,實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)PEG分子量低時(shí),提取的紅色素在室溫放置時(shí)褪色較為明顯。因此,為了更好的分析雙水相體系pH對(duì)色素的影響,選取了PEG2000和PEG4000與硫酸銨形成雙水相體系,分別調(diào)節(jié)pH至2、3、4、5,考察體系pH對(duì)萃取紅色素的穩(wěn)定性影響。

通過肉眼觀察結(jié)合圖2分析表明:采用PEG4000,pH3～5時(shí),紅色素的吸收光譜曲線較為穩(wěn)定,但是當(dāng)pH2時(shí),紅色提取液放置48 h后,褪色嚴(yán)重,大部分降解為橙黃色。采用PEG2000時(shí),紅色素提取液的顏色均較相應(yīng)的PEG4000色素提取液淺,室溫放置48 h后,紅色素褪色顯著。且pH越低,紅色素褪色越明顯,雙水相體系pH2時(shí),紅色素完全退色,降解為橙黃色。因而,火龍果中紅色素的穩(wěn)定性受pH影響較大。在 pH4～5范圍內(nèi),火龍果果皮紅色素保持鮮紅色,其最大吸收波長(zhǎng)在538 nm附近;pH2～3時(shí)色素溶液呈紫紅色,且很快會(huì)褪色。這可能與酸性條件下,甜菜苷C15發(fā)生異構(gòu)化或脫氫反應(yīng)有關(guān)[17]。另外,有研究報(bào)道,采用酸提醇沉提取火龍果皮果膠的最佳pH為4[15,18]。結(jié)合上述認(rèn)為采用雙水相體系同時(shí)提取火龍果紅色素和果膠的pH為4。

圖2 PEG/(NH4)2SO4 雙水相體系的 pH對(duì)紅色素可見光譜的影響Fig.2 Effect of pH of PEG/(NH4)2SO4 aqueous two-phase system on visible spectrum of red pigment

2.3 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)萃取的影響

由圖3可知,硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)在4%～19%的范圍內(nèi),隨著硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,相比逐漸減少,上相中紅色素和下相中果膠的得率逐漸增加。當(dāng)硫酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于7%時(shí),雙水相體系分相不明顯,色素和果膠的得率低。因此硫酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)提取的影響較大。但是隨著硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加,會(huì)導(dǎo)致溶液粘度增加,造成下相溶液中果膠后續(xù)分離的問題,因而后續(xù)實(shí)驗(yàn)中硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)設(shè)定為19%。

圖3 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)PEG/(NH4)2SO4 雙水相相比、色素和果膠得率的影響Fig.3 Effect of ammonium sulfate weight fraction on phase volume ratio,yield of pigment and pectin under PEG/(NH4)2SO4 aqueous two-phase system

2.4 PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)萃取的影響

如圖4a所示,PEG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較少時(shí),上相體積小,色素不能完全富集到上相,隨著PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,雙水相體系的相比呈上升趨勢(shì),即上相體積隨PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增大。當(dāng)PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到13%,可觀察到紅色素全部富集在上相,且上、下相體積接近。隨著PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加(圖4b與圖4c),上相中的紅色素和下相中的果膠的得率隨之增大。但是隨著PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,溶液體系的粘度也增大,會(huì)導(dǎo)致相間分子轉(zhuǎn)移的阻力增加。當(dāng)PEG6000質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到13%時(shí),色素和果膠的得率分別為1.64%±0.04%、3.74%±0.15%,當(dāng)PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)一步增加至16%時(shí),色素的得率增加至1.80%±0.04%,果膠的得率減少至3.68%±0.13%;PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)一步增加至19%時(shí),色素得率(1.82%±0.04%)略有增加,但是果膠得率有所減少。因而實(shí)驗(yàn)條件下,采用PEG6000分離色素的最大提取率(1.82%±0.04%)略高于PEG4000(1.74%±0.04%)。

綜上,隨著雙水相體系PEG和(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加,火龍果皮中色素和果膠的得率都會(huì)增加,當(dāng)相比接近0.5時(shí),上相紅色素和下相果膠得到較好的分離,色素和果膠的得率均達(dá)到最大。而當(dāng)PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)持續(xù)增加,由于上相粘度和溶液疏水等性質(zhì)的改變,分離時(shí)會(huì)有少量果膠進(jìn)入上相,導(dǎo)致下相中果膠減少。如果優(yōu)先考慮應(yīng)用價(jià)值較大的火龍果皮色素得率最大化,確定雙水相分離火龍果皮色素和果膠的優(yōu)化條件為:采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)16%的PEG6000,硫酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)19%,雙水相體系pH4.0,上相中紅色素和下相中果膠的得率分別為1.82%±0.04%、3.68%±0.13%,所提取的紅色素得率略高于乙醇溶劑提取法[11],果膠的得率也較其他采用酸提醇沉法略高[8],因此,雙水相同時(shí)萃取分離火龍果皮中的色素和果膠,較其他只提取單一物質(zhì)的工藝具有一定的優(yōu)勢(shì)。

圖4 PEG分子量和質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)PEG/(NH4)2SO4 雙水相溶液相比、色素和果膠得率的影響Fig.4 Effect of relative molecular weight and weight fraction of PEG on phase volume ratio,yield of pigment and pectin under PEG/(NH4)2SO4 aqueous two-phase system

圖5 火龍果皮經(jīng)PEG/(NH4)2SO4雙水相系統(tǒng)分離后 上相色素提取物的可見吸收光譜Fig.5 Visible absorption spectrum of pigment extract from upper phase of aqueous two-phase system of PEG/(NH4)2SO4 from pitaya peel

2.5 色素提取液的可見吸收光譜

火龍果皮色素提取液經(jīng)適當(dāng)倍數(shù)稀釋后,于紫外-可見分光光度計(jì)400～650 nm進(jìn)行掃描,得到吸收光譜曲線。由圖5可見,火龍果皮中紅色素的最大吸收波長(zhǎng)538 nm,與已有文獻(xiàn)報(bào)道一致[10-11]。鑒于對(duì)火龍果中甜菜苷色素的基本性質(zhì)及結(jié)構(gòu)已有報(bào)道[19-21]。初步推斷雙水相體系分離出的紅色提取液含有甜菜紅素。

2.6 提取果膠的紅外光譜

火龍果皮采用雙水相系統(tǒng)分離得到的下相提取物,經(jīng)乙醇沉淀后的干燥物采用紅外光譜儀掃描(圖6)。3100～2800 cm-1間的吸收峰是由C-H吸收引起的,主要包括-CH、-CH2和-CH3的伸縮振動(dòng)。1760～1730和1630～1600 cm-1間的吸收峰,分別是酯化的羰基和未酯化的羰基紅外吸收引起[8-9],此處的吸收峰很弱,說明所得果膠為低酯果膠[22]。此外,1394 cm-1附近還有一個(gè)較強(qiáng)的羰基(-COOH)對(duì)稱吸收峰;1300～800 cm-1間有一些中等強(qiáng)度吸收峰,這些峰是果膠的指紋區(qū),1100～1000 cm-1之間還有R-O-R和C-C的吸收峰,樣品在1045 cm-1的特征峰是C-O-C的伸縮振動(dòng)峰,表明有甲氧基存在。甲氧基是果膠的主要官能團(tuán),王雪等[8-9]也發(fā)現(xiàn)火龍果皮中果膠屬于低酯、低甲氧基果膠。因此,經(jīng)對(duì)比可知所測(cè)樣品具有果膠的特征吸收峰,火龍果皮中提取的樣品為低酯果膠。

圖6 火龍果皮經(jīng)PEG/(NH4)2SO4 雙水相系統(tǒng)分離后下相提取物的紅外光譜Fig.6 Infrared spectroscopy of extract from lower phase of aqueous two-phase system of PEG/(NH4)2SO4 from pitaya peel

3 結(jié)論

采用PEG/(NH4)2SO4雙水相體系在室溫條件下可以同時(shí)分離富集火龍果皮中色素和果膠。通過考察PEG相對(duì)分子量、PEG和硫酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)和體系pH對(duì)PEG/硫酸鹽雙水相體系分離火龍果皮中紅色素和果膠萃取的影響。發(fā)現(xiàn)PEG相對(duì)分子量、PEG和硫酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,均有利于紅色素在上相,果膠在下相富集;但是PEG相對(duì)分子量和PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)的進(jìn)一步增加,會(huì)導(dǎo)致溶液體系的粘度增大,不利于后續(xù)的精制過程。研究建立了優(yōu)化的PEG/硫酸鹽雙水相體系分離條件,即采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)16%的PEG6000,質(zhì)量分?jǐn)?shù)19%硫酸銨,pH4.0,在此條件下火龍果皮中色素和果膠的得率分別為1.82%±0.04%、3.68%±0.13%。論文研究工作可以為火龍果皮中紅色素和果膠的開發(fā)利用提供參考。