HPLC測定大豆皂苷方法的建立和優(yōu)化

殷叢叢，李文帥，徐海軍，談美霞，王 敏，趙晉忠，杜維俊，岳愛琴

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)部，山西太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801）

大豆（Glycine maxL.Merr.）皂苷是大豆種子中一類重要的次生代謝產(chǎn)物[1]，屬三萜齊墩果酸型皂苷。由大豆皂醇A、皂醇B這2種苷元結(jié)合β-D-葡萄糖、β-D-木糖、β-D-半乳糖、β-D-葡萄糖醛酸、α-L-阿拉伯糖、α-L-鼠李糖等6種糖基及其乙?；腔M成。依據(jù)其苷元的結(jié)構(gòu)差異，分為A類、B類、E類和DDMP類大豆皂苷[2-4]。研究表明，大豆皂苷具有抗癌、抗炎、抗氧化、降低膽固醇、增強免疫和保護肝臟等多種對人體有益的生理功能[5-10]，可開發(fā)成藥品和保健品。在植物體中皂苷參與自身的防御反應(yīng)[11]，使植物具有抗病毒和抗蟲害等抗性[12]，同時它還是一種重要的殺菌劑、發(fā)泡劑和穩(wěn)定劑[13-15]，還可作為高級化妝品和食品的添加劑，具有很大的市場潛力和應(yīng)用前景[16]。

GESTETNET等采用薄層色譜法分析水解純化后的大豆皂苷，運用重量法測定脫脂豆粕中皂苷含量[17]。AMAROWICZ等采用Lichrosorb RP18柱配制甲醇-丙醇-水-甲酸（32∶4∶63∶0.1）的流動相，在RI檢測器中分析大豆皂苷[17]。黃賢校等[18]以齊墩果酸標準品繪制標準曲線，建立相應(yīng)的回歸方程，測定大豆總皂苷含量。KRISHNAMURTHY等[19]利用HPLC-ESI-MS（Q）檢測出各類型大豆皂苷的含量。目前，國內(nèi)外對于大豆皂苷分析尚未建立標準方法，對于檢測大豆皂苷主要采用分光光度法、高效液相色譜法（HPLC）[20]和高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-ESI-MS/MS）[21-22]。分光光度法主要是對總大豆皂苷含量進行測定，無法測定大豆樣本的皂苷組成；HPLC法主要是對大豆皂苷的水解產(chǎn)物大豆皂醇A和B進行測定[23]，無法對大豆皂苷進行直接檢測；而HPLC-ESI-MS/MS雖然可以準確測定大豆皂苷各組分含量，但費用昂貴。因此，建立一種操作簡單、測定時間短、準確度高、成本低廉的大豆皂苷檢測方法，對大豆的特異種質(zhì)資源挖掘和遺傳改良非常重要。

目前，發(fā)現(xiàn)的大豆皂苷種類共有54種，最主要有Aa、Ab、Ba、Bb等4種皂苷。筆者利用HPLC法建立和優(yōu)化測定大豆皂苷Aa、Ab、Ba、Bb的方法，以實現(xiàn)操作簡便、成本低廉、快速、準確測定大豆皂苷成分分析及含量，旨在為大豆皂苷類型的鑒定和含量的測定提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

大豆皂苷標準品Aa（≥98%）、Ab（≥98%）、Ba（≥98%）、Bb（≥98%）、乙腈、冰醋酸均為色譜純。

Agilent 1260高效液相色譜（配二極管陳列檢測器），色譜柱ZORBAX SB-C18（250mm×4.6mm，5μm），30μL定量環(huán)，GT200高通量組織振蕩研磨儀（GRINOER，GT200），ZX-LGJ-18真空冷凍干燥機。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液配制

1.2.1.1 樣品溶液的制備 將大豆種子冷凍干燥，球磨儀研磨成粉末，4℃?zhèn)溆谩蚀_稱取0.1 g大豆粉，加1 mL 70%乙醇（含乙酸0.01%），超聲提取10 min，室溫避光浸提24 h，3000 r/min離心10 min，上清液用2倍體積的正己烷萃取脫脂，經(jīng)0.22μm濾膜過濾后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 標準溶液的制備 準確稱取大豆皂苷標準品Aa、Ab、Ba、Bb各1 mg，分別加入1 mL甲醇，配成1mg/mL的儲備液，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 液相色譜條件的優(yōu)化

1.2.2.1 流動相中乙酸含量的選擇優(yōu)化 參考ZHAO等[24]色譜條件，設(shè)乙酸含量為0、0.05%、0.10%共3個水平進行試驗。

1.2.2.2 檢測波長的選擇優(yōu)化 據(jù)文獻[25]報道，A類和B類皂苷在205、210 nm處有最大吸收，DDMP類在295 nm處有最大吸收。本試驗分別在205、210、295 nm波長下進行檢測，尋找最佳檢測波長。

1.2.2.3 大豆皂苷分型 采用優(yōu)化后的色譜條件對大豆皂苷標準品Aa、Ab、Ba和Bb進行檢測分析，通過比對保留時間，對大豆樣品皂苷類型進行定性檢測。

1.2.2.4 標準曲線的繪制 將配制好的儲備液逐級稀釋為0.1、0.2、0.4、0.8、1.0mg/mL的標準溶液。按優(yōu)化后的色譜條件繪制峰面積—質(zhì)量濃度標準曲線。

1.2.2.5 線性關(guān)系及檢測下限的測定 準確吸取混合標準溶液，用甲醇逐級稀釋，信噪比（S/N）為3時對應(yīng)的質(zhì)量濃度為檢測下限。

1.2.2.6 精密度及檢出率的測定 取大豆皂苷標準品（Aa、Ab、Ba、Bb）儲備液，用甲醇稀釋為60μg/mL，按優(yōu)化后的色譜條件進行分析，6次重復(fù)，計算精密度及檢出率。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相中最佳乙酸體積分數(shù)的選擇

從圖1可以看出，流動相中不加乙酸時，大豆皂苷在205 nm處吸收很弱，甚至檢測不到大豆皂苷（圖1-a）；流動相中含有0.05%乙酸時，吸收增強，可以將大豆皂苷色譜峰與噪聲分離（圖1-b）；當乙酸體積分數(shù)為0.10%時，背景吸收增強，噪聲增大，基線也出現(xiàn)嚴重波動（圖1-c）。所以，選擇0.05%乙酸的乙腈溶液和0.05%乙酸的超純水溶液作為流動相。

2.2 檢測波長的選擇

由圖2可知，大豆皂苷各組分在波長205 nm處均有較好的吸收峰，檢測效果優(yōu)于210、295 nm波長。大豆皂苷各組分在波長210 nm處雖均有吸收峰，但吸收強度均低于波長205 nm。波長295 nm時只有DDMP類皂苷有強吸收峰，其他類型大豆皂苷均沒有吸收峰。因此，本試驗選檢測波長為205 nm。

2.3 色譜條件及其適用性分析

由以上試驗結(jié)果表明，流動相A為0.05%乙酸乙腈溶液，B為0.05%乙酸超純水溶液；流速1.0 mL/min，檢測波長205 nm；柱溫30℃；進樣量30μL（表1為梯度洗脫程序的最優(yōu)條件）。在該色譜條件下，對大豆樣品和4種大豆皂苷標準品（Aa、Ab、Ba、Bb）進行檢測，從HPLC-DAD色譜圖可以看出，各色譜峰出峰均勻，分離效果好，并且峰型尖銳，能夠達到分離檢測4種大豆皂苷的目的（圖3、4）。

表1 不同洗脫時間下流動相的體積分數(shù)情況 %

由表2可知，樣品中除4號峰（Ab）的分離度為1.21、9號峰（Bb）的分離度為1.29外，各色譜峰之間的分離度均大于2.0，選擇性都接近1.0，多數(shù)峰的對稱因子在0.7～0.9，各組分能夠完全分離。說明該方法能夠?qū)Υ蠖乖碥者M行分型和定量檢測，滿足同時對多種大豆皂苷組成測定的要求。

表2 樣品中檢測到的大豆皂苷各色譜峰的參數(shù)

2.4 定性分析及種質(zhì)資源篩選

由圖5可知，依據(jù)大豆皂苷標準品Aa、Ab的保留時間，對A類大豆皂苷類型進行了檢測，篩選出了只含大豆皂苷Aa或Ab以及同時含有大豆皂苷Aa、Ab的大豆種質(zhì)資源。

2.5 標準曲線的繪制和檢測下限分析

圖6為4種大豆皂苷標準品（Aa、Ab、Ba、Bb）的標準曲線，樣品中4種大豆皂苷的含量可通過大豆樣品的色譜峰面積進行計算。由表3可知，大豆皂苷標準品（Aa、Ab、Ba、Bb）的回歸方程的線性范圍為100～1000μg/mL，相關(guān)系數(shù)均接近1。其中，大豆皂苷Aa、Ab的檢測下限為20μg/mL，Ba、Bb的檢測下限為10μg/mL，檢測具有較高靈敏度，可滿足分析要求。

2.6 精密度及檢出率分析

4種大豆標準品（Aa、Ab、Ba、Bb）加料量為60μg/mL，分別對其檢出量進行分析，試驗重復(fù)6次，結(jié)果顯示（表4），4種大豆標準品（Aa、Ab、Ba、Bb）的加料量與檢出量之間差異不顯著，平均檢出率為89.9%～105.6%，精密度為1.06%～2.31%。表明該方法精密度高，檢出率高。

表3 大豆皂苷標準品線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢測下限

表4 大豆皂苷標準品的檢出率

3 結(jié)論與討論

大豆皂苷結(jié)構(gòu)復(fù)雜，組成成分多，又受品種及大豆產(chǎn)地等因素的影響，各自的含量存在差異，很難分離種類完全的大豆皂苷單體作為測試標準品，使得無法有效利用HPLC開展大豆皂苷全部組成和含量的評價工作，成為限制大豆育種工作者深入研究大豆皂苷的瓶頸。以往用分光光度法雖然速度快，但只能測定出大豆皂苷總含量，無法確定大豆皂苷組成及各組成的含量。TLC應(yīng)用于大豆皂苷檢測，可以快速檢測大豆皂苷組成的變化，且以上方法都不能將檢測樣本中的大豆皂苷快速分離出來。近年來，大豆皂苷單體不斷分離出來，HPLC、HPLC-MS分析測定技術(shù)的不斷完善，為育種工作者展開大豆皂苷品質(zhì)研究提供了技術(shù)保證。本研究建立了一種利用HPLC法檢測4種大豆皂苷Aa、Ab、Ba、Bb含量的方法，可為今后大豆種質(zhì)資源的鑒定和品質(zhì)育種提供技術(shù)支持。受大豆皂苷標準品限制，該方法仍無法實現(xiàn)對全種類皂苷的檢測和分離。下一步計劃對大量大豆樣本進行檢測分析，制備新的以及具有重要研究價值的大豆皂苷標準品，進一步完善HPLC檢測方法，為大豆皂苷的開發(fā)以及種質(zhì)資源的篩選提供手段。

本研究建立了一種操作簡單、檢測時間短、準確度高的大豆皂苷HPLC-DAD檢測方法，在該色譜條件下，采用梯度洗脫，可以對Aa、Ab、Ba、Bb大豆皂苷進行定性定量檢測，大豆皂苷Aa、Ab的檢測下限為20μg/mL，Ba、Bb的檢測下限為10μg/mL，平均檢出率為89.9%～105.6%，精密度為1.06%～2.31%，相關(guān)系數(shù)均不低于0.997。該檢測方法可在大豆皂苷功能性產(chǎn)品開發(fā)以及大豆種質(zhì)資源篩選等方面發(fā)揮重要作用。