Cry1Ia蛋白N端信號肽對其蛋白表達量的影響

郭俊佩，劉 璇，韓阜志，高建華，史宗勇

（山西農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，山西太谷030801）

Cry蛋白是應用最廣泛的Bt殺蟲蛋白，對雙翅目、鞘翅目和膜翅目等害蟲具有特異、高效的毒殺作用[1]，Cry蛋白的結(jié)構和殺蟲機制已被廣泛研究[2]。Cry殺蟲蛋白主要以伴孢晶體的形式存在于蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）細胞中[3]，其N端含有3個與殺蟲相關的結(jié)構域[4-7]，為Cry蛋白的主要功能域，僅有這3個結(jié)構域的Cry蛋白的分子質(zhì)量約為65 ku[8-9]；另外，部分Cry蛋白C端還有一段長肽，主要幫助Cry蛋白形成晶體結(jié)構，這類蛋白的分子質(zhì)量大小約為135 ku。對于分子質(zhì)量約65 ku的Cry蛋白而言，形成伴孢晶體需要其他蛋白的幫助，如Cry2Aa蛋白需要在cry2Aa操縱子表達的Orf2蛋白（29.4 ku）幫助下才能形成伴孢晶體[10]；cry11A操縱子中orf3基因編碼一個20 ku的蛋白質(zhì)，可充當分子伴侶，輔助Cry11A形成伴孢晶體[11]。

Cry1I類蛋白結(jié)構較為特殊，這類蛋白無C端長肽，在Bt細胞中表達后不形成伴孢晶體[12]，由N端信號肽介導釋放到胞外[8，13]。原核細胞中，常見分泌信號肽一般分為3個部分，即N區(qū)、H區(qū)和C區(qū)[14-15]。其中，N區(qū)由帶正電荷氨基酸組成，可與脂質(zhì)雙層帶負電荷的磷酸基團相互作用，進而促進蛋白質(zhì)的有效轉(zhuǎn)運；H區(qū)是中性氨基酸組成的疏水功能區(qū)，決定信號肽的構象及其對細胞膜的取向、信號肽的裂解以及影響蛋白加工和轉(zhuǎn)運效率；C區(qū)由多個極性氨基酸組成且含有信號肽酶作用位點，其酶切作用位點較保守，切割效率決定蛋白質(zhì)的分泌水平。

Cry1類蛋白通常只對某一種昆蟲有特異殺蟲活性，而Cry1I分泌型蛋白對大多數(shù)鱗翅目和鞘翅目昆蟲均有殺蟲活性，作為廣譜殺蟲蛋白具有良好的應用潛力[16]。如Cry1Ia蛋白能夠毒害鱗翅目和鞘翅目昆蟲[17]，Cry1Ie蛋白對亞洲玉米螟[18]、小菜蛾[19]和棉鈴蟲[20]等具有較高的殺蟲活性。此外，KOSTICHKA等[12]、SCHNEPF等[21]分析認為，Cry1Ia蛋白的N端信號肽Iasp中第1～10個氨基酸為N區(qū)，第11～16個氨基酸為H區(qū)，剩余29個氨基酸為C區(qū)。GAO等[22]將Iasp融合到綠色熒光蛋白eGFP的N端形成融合熒光蛋白IeGFP，其表達量顯著高于eGFP，繼而增強了宿主細胞的熒光強度，說明信號肽融合是基因表達量增強的原因之一，可見Iasp功能非常重要。

為深入了解Iasp完整性對Cry1Ia自身表達量的影響，本研究將Iasp的N端分別截取5、10、13、16、24、32、44、73個氨基酸，構建一系列Iasp缺失突變體，分析N端氨基酸不同程度缺失對Cry1Ia蛋白原核表達的影響，旨在為解析Iasp功能奠定一定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試菌株為大腸桿菌（Escherichia coli）TG1菌株及BL21 Star（DE3）感受態(tài)細胞。

所用試劑為DNA標準分子量1 kb Plus DNA Ladder，購自中科瑞泰（北京）生物科技有限公司；AxyGEN質(zhì)粒小提試劑盒、DNA回收試劑盒、限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ/SacⅠ、蛋白質(zhì)標準分子量PageRuler Prestained Protein Ladder，均購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 表達載體的構建 在含有50μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上劃線接種Tp304-1Ia[23]菌株的菌液，37℃條件下培養(yǎng)10 h。將單克隆接種于LB液體培養(yǎng)基（含有50μg/mL的氨芐青霉素），37℃200 r/min培養(yǎng)10 h，提取質(zhì)粒DNA。

表1 研究所使用的引物

表2 研究所使用的質(zhì)粒

采用SnapGene DNA軟件設計引物（表1）進行PCR擴增，PCR擴增體系為Green mix 12.5μL，上下游引物各0.5μL，DNA模板0.5μL，加ddH2O至總反應體積25μL。PCR擴增程序為94℃預變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸150 s，35次循環(huán)；最后72℃延伸5 min。將擴增產(chǎn)物進行TA克?。╬MD19），測序正確后，用BamHⅠ和SacⅠ限制性內(nèi)切酶進行酶切，回收后接入pET28aDel線性化載體中，并轉(zhuǎn)化TG1感受態(tài)細胞。將轉(zhuǎn)化成功的單克隆提取質(zhì)粒進行酶切鑒定，并將鑒定正確的表達載體分別命名為p28aD-Cry1IaD5、p28aD-Cry1IaD10、p28aD-Cry1IaD13、p28aD-Cry1IaD16、p28aDCry1IaD24和p28aD-Cry1IaD32（表2）。

1.2.2 Cry1Ia蛋白的表達分析 將成功構建的表達載體用熱激法分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 Star（DE3）感受態(tài)細胞，37℃培養(yǎng)10 h。分別將9個菌株的單克隆接種于含有50μg/mL卡那霉素LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)10 h；按1∶1000轉(zhuǎn)接至含有50μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600值為0.8；加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG），使終濃度為1.0mmol/L，16℃125 r/min誘導6 h。對表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE分析。采用Image Lab 6.0.1軟件對蛋白表達結(jié)果進行相對定量。

1.2.3cry1Ia基因的mRNA局部結(jié)構預測 用RNA structure 6.1預測cry1Ia、cry1IaD5、cry1IaD10、cry1IaD13、cry1IaD16、cry1IaD24、cry1IaD32、cry1I-D44和cry1IaD73基因的起始密碼子附近（-4～+37 nt）核苷酸的二級結(jié)構[25]，選擇每個序列具有最低折疊能量的結(jié)構進行比較。利用SPSS 23.0對9種蛋白表達量和9種基因的起始密碼子附近核苷酸的二級結(jié)構熱穩(wěn)定性進行相關性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 載體的構建及鑒定

研究共使用了Cry1Ia蛋白的8種N端缺失表達載體，其中，p28aD-Cry1IaD5、p28aD-Cry1IaD10、p28aD-Cry1IaD13、p28aD-Cry1IaD16、p28aD-Cry1-IaD24和p28aD-Cry1IaD32等6種表達載體是本研究構建（圖1-A）。通過對8種N端缺失表達載體進行雙酶切鑒定，結(jié)果顯示，目的片段的大小與預期一致，表明載體構建成功（圖1-B）。

2.2 N端信號肽缺失對Cry1Ia蛋白表達量的影響

將酶切鑒定正確的表達載體轉(zhuǎn)化BL21 Star（DE3）感受態(tài)細胞原核表達發(fā)現(xiàn)，Cry1Ia和8種突變體蛋白均能成功表達，目的蛋白大小與預期一致（圖2、表2）。用Image Lab軟件對圖2中的目的條帶進行相對定量，將Cry1Ia作為對照（表達量記為1），結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表3），Cry1IaD32和Cry1IaD44的表達量最高，分別約為對照Cry1Ia的1.43倍和1.12倍；Cry1IaD13和Cry1IaD16的表達量與對照Cry1Ia持平，分別為對照Cry1Ia的1.04倍和1.07倍；而Cry1IaD5、Cry1IaD10、Cry1IaD24和Cry1IaD73的表達量均低于對照Cry1Ia。說明Cry1Ia的N端信號肽缺失不同程度影響其蛋白表達，但與對照間差異不顯著。

表3 蛋白表達相對定量

2.3 cry1Ia基因的mRNA分析

利用RNA structure 6.1預測了cry1Ia和8種5′端堿基缺失基因的二級結(jié)構，結(jié)果如圖3所示，cry1IaD24與cry1Ia起始密碼子（-4～+37）附近的核苷酸區(qū)域預測二級結(jié)構相似，均僅包含一個莖環(huán)結(jié)構，且雙股螺旋內(nèi)部僅含有一個GC配對，該結(jié)構導致二者熱穩(wěn)定性接近，ΔG分別為-0.7 kcal/mol和-0.6 kcal/mol；cry1IaD13基因的mRNA也包含一個莖環(huán)結(jié)構，但雙股螺旋中存在2個GC配對，從而增加了該結(jié)構的熱穩(wěn)定性（ΔG＝-4.0 kcal/mol）；其他幾個突變體基因的二級結(jié)構均包含多個莖環(huán)結(jié)構，其中，cry1IaD5和cry1IaD73莖環(huán)結(jié)構最多，且GC含量相對較高，熱穩(wěn)定性也最高。

進一步對Cry1Ia蛋白表達量和對應基因的起始密碼子附近核苷酸的二級結(jié)構熱穩(wěn)定性進行了相關性分析，結(jié)果顯示，2個變量間相關系數(shù)為0.377，在95%水平下不顯著，所以，2個變量間無顯著相關關系。

3 結(jié)論與討論

前期研究表明，Cry1Ia蛋白的N端信號肽Iasp跨膜轉(zhuǎn)運eGFP蛋白的性能較弱，但是具有作為融合標簽的潛力，可改善多種蛋白，比如eGFP、MMP13和GDF8在大腸桿菌BL21 Star（DE3）中的表達[22]。本試驗為了研究Iasp不同區(qū)域?qū)ry1Ia蛋白表達的影響，分析了8種Iasp的缺失突變體，結(jié)果顯示，Cry1Ia蛋白和8種缺失突變體在大腸桿菌中均獲得了較好的表達，且表達產(chǎn)物的大小與預期一致，該結(jié)果與前人研究結(jié)果一致[22，26]。

本研究用Image Lab軟件對目的條帶進行相對定量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Cry1IaD32和Cry1IaD44的表達量高于Cry1Ia，Cry1IaD13和Cry1IaD16的表達量同Cry1Ia基本持平，其余4種蛋白的表達量低于Cry1Ia。但整體而言，Cry1Ia和8種突變體蛋白表達水平差異不大。該結(jié)果表明，Cry1Ia蛋白N端氨基酸序列不同程度缺失對Cry1Ia蛋白表達無顯著影響。有研究發(fā)現(xiàn)，在原核細胞中蛋白表達量受多種因素影響，其中，SD序列與起始密碼子AUG之間的序列及其長度會影響肽鏈的翻譯效率[27]，二者之間的堿基組成和排列順序通過影響雙股螺旋的結(jié)構參數(shù)而改變起始密碼子AUG在核糖體中相對角度，進而影響翻譯效率[28]。值得注意的是，起始密碼子附近的核酸序列二級結(jié)構的熱穩(wěn)定也是關鍵因素之一[22，29-30]。前人研究發(fā)現(xiàn)，熱穩(wěn)定性較低的基因蛋白表達水平較高，比如，KUDLA等[29]研究發(fā)現(xiàn)，在不同GFP編碼序列的5′端添加一段二級結(jié)構熱穩(wěn)定性低的前導序列，獲得的融合基因高水平表達；GAO等[22]研究發(fā)現(xiàn)，iegfp起始密碼子附近核苷酸二級結(jié)構的熱力學穩(wěn)定性低于egfp，而IeGFP蛋白表達量卻高于eGFP。本研究結(jié)果表明，熱穩(wěn)定性從弱到 強 依 次 為Cry1Ia、Cry1IaD24、Cry1IaD32、Cry1IaD10、Cry1IaD44、Cry1IaD13、Cry1IaD16、Cry1IaD73、Cry1IaD5；蛋白表達量從高到低依次為Cry1IaD32、Cry1IaD44、Cry1IaD16、Cry1IaD13、Cry1Ia、Cry1IaD24、Cry1IaD73、Cry1IaD5、Cry1IaD10；關聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)，二者無顯著相關性。這與前人研究結(jié)果不一致[22，29]，可能是由于Cry1Ia信號肽對自身蛋白與其他融合蛋白的影響有所差異，也有可能是由于重復次數(shù)有限且缺少轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的精確定量。因此，本研究中表達量與mRNA二級結(jié)構熱穩(wěn)定性的關系還需進一步研究。

本研究構建了一系列Cry1Ia蛋白N端信號肽缺失突變體，首次研究了不同程度信號肽缺失對其自身蛋白表達的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Iasp不同程度缺失影響其蛋白表達，但表達水平差異不大。以上研究結(jié)果為進一步探究Iasp的功能奠定了一定理論基礎。