ARR21基因在擬南芥生長發(fā)育和離體再生過程中的功能分析

衛(wèi)云豐，張樹偉，程金金，王興春

（1.山西農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，山西太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，山西太谷030801）

細胞分裂素是五大經(jīng)典激素之一，在植物生長發(fā)育、脅迫響應和離體再生等諸多過程中起著極其重要的調(diào)控作用[1-8]。在過去的20多年中，科學家利用模式植物擬南芥系統(tǒng)研究了細胞分裂素的生物合成、轉(zhuǎn)運及信號轉(zhuǎn)導過程。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了3種組蛋白激酶（Arabidopsis histidine kinases，AHKs）為細胞分裂素受體，分別為AHK2、AHK3和AHK4[3，9]，這些受體通過磷酸化的方式將細胞分裂素信號經(jīng)組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移蛋白（Arabidopsis histidine-phosphot transfer proteins，AHPs）傳遞至B型應答調(diào)節(jié)因子（Arabidopsis response regulators，ARRs）[4-6]。B-ARRs作為一型MYB蛋白，其N端信號區(qū)含有天冬氨酸（D）、天冬氨酸（D）和賴氨酸（K）3個保守的氨基酸殘基，該結構也被稱為DDK結構域，該結構域的第2個天冬氨酸具有接受磷酸基團的功能[3，9-10]。B-ARRs的DDK結構域接收到上游AHP傳遞來的磷酸基團后，被磷酸化激活，從而啟動包括A-ARRs在內(nèi)的下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，進而調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育[3，9-12]。

擬南芥中共編碼12個B-ARR，N端均有1個保 守 的 信 號 接 收 域（Receiver domain，RD），除ARR23外C端均含有典型的MYB類轉(zhuǎn)錄因子結構域（GARP）[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，單突變體arr1、arr2、arr10、arr11和arr18等與野生型均無明顯的表型差異，而arr10/12雙突變體對細胞分裂素的響應變?nèi)?，arr1/10/12三突變體完全喪失了對細胞分裂素的響應且植株矮小[14]，表明B-ARRs基因家族存在功能冗余[13]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，B-ARRs的N端信號區(qū)的DDK結構域?qū)端轉(zhuǎn)錄激活區(qū)具有抑制作用，而過表達DDK結構域缺失突變基因（ΔDDK）會解除轉(zhuǎn)錄抑制，導致B-ARRs介導的細胞分裂素信號途徑組成型激活，從而使轉(zhuǎn)基因植物呈現(xiàn)典型的細胞分裂素表型[10，15-17]。

ARR21作為B型ARR家族中的一員，與ARR13具有較高的相似性[16]，但其功能尚待深入研究。本試驗利用雌激素誘導表達系統(tǒng)和T-DNA插入突變體研究了ARR21基因表達對擬南芥幼苗生長發(fā)育和離體再生的影響，旨在為深入解析ARR21基因的功能奠定基礎，為利用ARR21基因提高植物離體再生和遺傳轉(zhuǎn)化效率奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

研究用的野生型擬南芥（Arabidopsis thaliana）為Columbia-0（Col-0）。載體為pER10和pER8[18]。T-DNA插入突變體arr13（SALK_042719c）和arr21（SALK_005772c）由陳受宜研究員饋贈。arr13/21雙突變體由arr13和arr21單突變體雜交獲得。擬南芥播種在1/2 MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件為：光周期16 h光/8 h暗，光照強度80～120μmol/（m2·s），溫度22℃。

1/2 MS培養(yǎng)基：2.3 g/LMurashige and Skoog Basal Medium w/Vitamins（PhytoTechnology Laboratories，貨號M519）、2%蔗糖和0.8%的瓊脂粉，pH值5.8。

雌激素誘導培養(yǎng)基為1/2 MS培養(yǎng)基添加10μmol/L的17-β雌二醇（Sigma，貨號E8875）。

1.2 試驗方法

1.2.1 擬南芥B-ARRs進化關系分析 從擬南芥的基因組數(shù)據(jù)庫TAIR（www.arabidopsis.org）中獲得B型ARR家族12個成員序列，利用MEGA 7.0軟件構建系統(tǒng)進化樹，Bootstrap參數(shù)設置為1000。

1.2.2ARR21基因過量表達載體的構建和擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化 以Col-0基因組DNA作為模板，利用東洋紡（上海）生物科技有限公司的高保真DNA聚合酶KOD-plus v2以及引物ARR21XhoI和ARR21XbaI（表1）擴增ARR21，經(jīng)XhoⅠ和XbaⅠ雙酶切后連接pER8載體，構建雌激素誘導的pER8-ARR21過量表達載體。PCR擴增體系為DNA模板3μL，dNTP 5μL，MgSO43μL，上下游引物各1.5μL，DNA聚合酶5μL，10×Buffer 5μL。擴增程序為：94℃2 min；94℃10 s，55℃30 s，68℃1 min，30個循環(huán)；68℃10 min，4℃保存。

利用ARR21ΔDDKXhoⅠ和ARR21XbaⅠ引物擴增缺失5′端438 bp（146個氨基酸）的ARR21基因，即ARR21ΔDDK片段。將該片段利用XhoⅠ和XbaⅠ雙酶切后連接雌激素誘導表達載體pER10，構建成pER10-ARR21ΔDDK載體。PCR擴增體系和擴增程序同上。

表1 引物序列

將pER8-ARR21載體及pER10-ARR21ΔDDK載體通過電激法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中，并利用農(nóng)桿菌介導的花序浸染法[19]將其轉(zhuǎn)入Col-0野生型中；進行轉(zhuǎn)化后，將獲得的擬南芥種子種植于篩選培養(yǎng)基中，并施加篩選壓力，篩選符合3∶1分離比的抗性擬南芥植株，獲得轉(zhuǎn)化成功突變體。

1.2.3 RNA提取和實時定量PCR反應 擬南芥總RNA的提取、cDNA第1鏈合成和實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）均采用寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司的試劑盒。其中，RNA提取采用柱式法植物RNA小量提取試劑盒（貨號9769），cDNA第1鏈合成采用PrimeScriptTMRT reagent Kit（貨號RR047A），RT-qPCR采用TB GreenRPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒（貨號RR820A），所有操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。RT-qPCR所用的ARR21基因特異引物為ARR21qF和ARR21qR，內(nèi)參基因ACTIN7（AT5G09810）的引物為ACT7qF和ACT7qR。采用2-ΔΔCt法計算相對表達量。

1.2.4 擬南芥離體再生 擬南芥離體再生試驗以弱光下培養(yǎng)的下胚軸為外植體，采用兩步法進行[20]。

2 結果與分析

2.1 ARR21基因的系統(tǒng)進化分析

擬南芥基因組中共有12個B-ARRs基因，分別為ARR1、ARR2、ARR10、ARR11、ARR12、ARR13、ARR14、ARR18、ARR19、ARR20、ARR21和ARR23。系統(tǒng)進化樹結果表明，12個B-ARRs聚為3個亞類，其 中，ARR1、ARR2、ARR10、ARR11、ARR12、ARR14和ARR18為第Ⅰ亞類，ARR13、ARR21和ARR23為第Ⅱ亞類，ARR19和ARR20為第Ⅲ亞類。其中，ARR23序列較短，僅有信號接收域RD，無MYB結合域（GRAP）（圖1-A），同一亞類中的ARR13和ARR21親緣關系較近（圖1-B），預測其可能具有相同或相似的功能。

2.2 過量表達擬南芥ARR21基因?qū)τ酌缟L發(fā)育的影響

為了研究ARR21基因在擬南芥生長和發(fā)育過程中的功能，構建了ARR21基因過量表達擬南芥pER8-ARR21（圖2-A），在MS培養(yǎng)基和雌激素誘導培養(yǎng)基生長情況結果顯示，過表達植株在無誘導劑的培養(yǎng)基上均生長良好，而在雌激素誘導培養(yǎng)基上生長發(fā)育嚴重受阻。其中，24號株系長出真葉，生長發(fā)育受阻較輕（圖2-C）；14號和31號株系生長發(fā)育受阻較重，且31號受阻表型最為嚴重，根系較短，且沒有真葉長出（圖2-B、D）。RT-qPCR結果表明，野生型擬南芥中ARR21基因幾乎不表達，而在過表達的轉(zhuǎn)基因擬南芥中，24號植株的表達量最低，31號株系中表達量最高，這與其生長發(fā)育受阻表型是一致的（圖2-E）。由此預測，ARR21基因過量表達抑制了擬南芥的生長發(fā)育。

2.3 ARR21信號接收域缺失對其功能的影響

B-ARRN端含有負調(diào)控功能的DDK結構域。為研究該結構域的功能，構建了刪除N端160個氨基酸殘基的雌激素誘導表達載體pER10-ARR21ΔDDK，結果顯示，與pER8-ARR21轉(zhuǎn)基因幼苗表現(xiàn)一致，過量表達缺失信號接收域的ARR21ΔDDK基因抑制了擬南芥幼苗的生長發(fā)育（圖3-A、B），且這種生長發(fā)育抑制表型與ARR21ΔDDK基因的表達量相關（圖3-C）。

2.4 ARR21基因功能缺失對擬南芥生長發(fā)育的影響

為了進一步了解ARR21基因在擬南芥生長發(fā)育過程中的功能，研究了ARR21功能缺失突變體arr21的表型，在arr21突變體中，T-DNA插入在第5個外顯子中，導致該基因功能完全喪失（圖4-A）。在本試驗條件下，arr21突變體與Col-0野生型無明顯差異，表明ARR21基因功能缺失對擬南芥生長發(fā)育無影響（圖4-B、C）。由于ARR21基因與ARR13基因有較高的相似性（82%），可能存在功能冗余。為此，進一步分析了arr13及arr13/21雙突變體的表型，結果表明，arr13和arr13/21突變體幼苗與野生型Col-0也無明顯差異（圖4-D、E）。

2.5 擬南芥ARR21基因過表達和缺失對離體再生的影響

細胞分裂素在植物離體器官再生過程中起著極其重要的作用，進一步分析了ARR21基因過表達和功能缺失對擬南芥離體再生的影響，結果顯示（圖5），過表達ARR21基因顯著提高了離體再生能力，但arr21功能缺失對離體再生無顯著影響；此外，arr13單突變體和arr13/21雙突變體離體再生效率均低于野生型。

3 結論與討論

B-ARR為細胞分裂素信號途徑的關鍵樞紐，探究其生物學功能對于闡明細胞分裂素途徑的調(diào)控機制有重要意義。擬南芥基因組中共編碼12個B-ARRs，其中，ARR1、ARR10、ARR12等的功能已有了清晰的認識[5]。本研究表明，B型ARR基因ARR21過量表達抑制了幼苗的生長發(fā)育，促進了離體再生；雖然arr21單突變體對離體再生無顯著影響，但arr13/21雙突變體離體再生能力低于野生型。

有研究發(fā)現(xiàn)，由于DDK結構域?qū)端轉(zhuǎn)錄激活域的抑制，組成型表達DDK結構域缺失的B型ARR基因會導致細胞分裂素信號激活，抑制幼苗生長發(fā)育，導致難以獲得轉(zhuǎn)基因后代[10，15-18，21]。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達DDK缺失突變體在雌激素誘導培養(yǎng)基上，幼苗生長發(fā)育異常，無法收獲轉(zhuǎn)基因種子，與前人對組成型表達ARR21ΔDDK的研究結果完全一致。值得注意的是，該結果與過量表達ARR21全長基因的研究結果相似，二者突變體幼苗均出現(xiàn)典型的細胞分裂素表型，即幼苗生長發(fā)育嚴重受阻[15]；盡管如此，arr21單突變體和arr13/21雙突變體幼苗生長發(fā)育完全正常，推測ARR21基因可能不參與營養(yǎng)生長階段的調(diào)控，這與其表達譜一致[13]。

細胞分裂素是植物離體器官再生的關鍵決定因素。本研究發(fā)現(xiàn)，arr21單基因突變對擬南芥離體再生無顯著影響，而arr13/21雙基因突變后離體再生效率顯著降低，表明B型ARR參與調(diào)控擬南芥離體再生，且存在明顯的功能冗余；相反，結構缺失導致的ARR21基因組成型表達可以顯著提高離體再生效率。因此，ARR21基因有望用于難以組培的植物，以提高其遺傳轉(zhuǎn)化效率。

本研究初步解析了ARR21基因在植物生長發(fā)育和離體再生過程中的功能，但其具體調(diào)控機制有待進一步研究。隨著高通量測序技術的發(fā)展，未來可以利用基于高通量測序的ChIP-Seq等技術，篩選和鑒定ARR21的下游靶基因，闡明其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。