止血精膠囊的制備工藝及質量標準的建立*

梅瑤， 徐國波， 關煥玉， 廖尚高， 何迅， 席曉嵐

(貴州醫(yī)科大學 藥學院， 貴州 貴安新區(qū) 550025； 國家苗藥工程技術中心 & 民族藥與中藥開發(fā)應用教育部工程研究中心， 貴州 貴陽 550004)

白芨為蘭科植物白芨(Bletillastriata)的干燥塊莖，其味苦、甘、澀，性微寒，具有清熱利濕、收斂止血、消腫生肌之功效[1-3]，臨床上主要用于吐血、止血、外傷出血、瘡瘍腫毒以及皮膚皸裂等治療[3-5]。近幾年來，針對白芨多糖化學成分、藥理學、制劑學等方面進行研究，董永喜等[6]發(fā)現(xiàn)白芨多糖(BSP)可通過升高血小板聚集率來調節(jié)纖溶系統(tǒng)，發(fā)揮止血作用；武桂娟等[7]通過小鼠實驗模型，發(fā)現(xiàn)BSP止血機制主要是增強血小板第Ⅲ因子活性、縮短凝血酶生成時間，形成人工血栓發(fā)揮止血作用。BSP中以白芨膠入藥時，可制成散劑、乳膏劑、涂膜劑片劑、膜劑、凝膠劑和口腔黏附片等[8-10]。白芨藥材中除了含有多糖組分外，還有較多非多糖物質，如三萜類、聯(lián)菲類、二氫菲類、聯(lián)菲醚類、聯(lián)菲葡萄糖苷類以及菲并吡喃類等[11-13]。本課題在前期研究中，發(fā)現(xiàn)白芨非多糖組分也具有較好的止血藥效，可顯著縮短肝素化的小鼠凝血時間和出血時間，其止血機制與刺激血小板活化、增強血小板聚集、抑制纖維蛋白降解有關[14-17]；同時發(fā)現(xiàn)白芨非多糖組分中單體化合物4-hydroxymeth ylphenylβ-D-glucoside、白藜蘆苷(blestroside)、裸子苷Ⅰ (gymnoside Ⅰ)、裸子苷Ⅸ(gymnoside Ⅸ)和armatuside能顯著促進血小板聚集作用。白芨苷、1-對羥基芐基-4-甲氧基菲-2,7-二醇(1-p-hydroxybenzyl-4-methoxyphenanthrene-2,7-diol)、α-異蘋果酸(α-isobutylmalic acid)、裸子苷Ⅰ (gymnoside Ⅰ)、裸子苷Ⅸ(gymnoside Ⅸ)和白藜蘆苷(blestroside)可顯著縮短肝素化小鼠的CT值[18]。除白芨非多糖組分藥理研究之外，其在制劑方面的研究未見報道，且臨床上使用的白芨藥品多為含白芨的中藥復方制劑，缺乏有關白芨止血有效組分(除多糖外)或有效成分的研究，嚴重制約了白芨產(chǎn)品的深度開發(fā)。因此，為了開發(fā)白芨相關制劑產(chǎn)品，本課題在前期研究基礎上，將白芨非多糖部分與輔料混合制成硬膠囊——止血精膠囊，并對止血精膠囊的質量控制進行研究，為其工藝生產(chǎn)和臨床使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1藥材與主要試劑 藥材白芨(批號20180906，安龍縣欣蔓生物科技有限責任公司)由貴州醫(yī)科大學藥學院生藥學與藥用植物學教研室龍慶德副教授鑒定為蘭科植物白芨Bletillastriata(Thunb.) Reichb. F.的干燥塊莖，藥用淀粉、糊精、微晶纖維素以及甘露醇(貴州欣紫鴻藥用輔料有限公司)，3號明膠空心膠囊(浙江省康奧健膠囊有限公司)、D101大孔樹脂(青島海洋化工有限公司)、95%食用酒精(批號180816，東新化工有限公司)、白芨苷對照品(批號DST-190219-100，成都德思特生物技術有限公司)，氯仿、乙酸乙酯為分析純，甲醇為色譜純，水為超純水。

1.1.2主要儀器 XB-HP中藥材粉碎機(山東臨清宏源制藥設備有限公司)、OSB-2100旋轉蒸發(fā)儀(日本EYELA，東京理化器械株式會社)、Aglient 1260高效液相色譜(HPLC，安捷倫科技有限公司)、AE 2401十萬級電子天平(梅特勒，托利多儀器上海有限公司)、KQ-250 DB型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、SC082768型純水機(四川沃特水設備有限公司)、DZF-6050型真空干燥箱(上海博訊有限公司醫(yī)療設備廠)、升降崩解儀(南京溫諾儀器有限公司)、DK-98-11電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)、DZF-6050型真空干燥箱(上海博訊有限公司醫(yī)療設備廠)、膠囊板(浙江省康奧健膠囊有限公司)。

1.2 方法

1.2.1止血精膠囊的提取工藝 白芨塊莖經(jīng)粉碎機打成粉末(過4號篩)，稱取白芨粉末6.5 kg，用4倍量95 %乙醇回流提取，2 h/次，提取3次；合并3次濾液后濃縮至浸膏，浸膏用水溶解后上大孔樹脂D101柱色譜(樹脂6 cm,75 cm)，經(jīng)水洗脫后，用80%乙醇溶液洗脫；收集并合并80%乙醇洗脫液，濃縮至稠膏，55 ℃真空干燥，制得止血精膠囊內容物，提取率為2.6%。

1.2.2止血精膠囊的制備工藝 稱取白芨非多糖浸膏粉(過60目篩)與稀釋劑微晶纖維素按1 ∶1混勻，加入一定量的75%乙醇作為潤濕劑(噴灑加入、少量多次)制軟材直至“手握成團、觸之即散”；過20目篩擠壓制粒，將濕顆粒于60 ℃下干燥，取干燥好的顆粒整粒，過40～80目篩，去除細粉，即得粒度40～80目的膠囊填充物，裝入3號空心膠囊，即得止血精膠囊。

1.2.3止血精膠囊的質量標準研究 (1)依照《中國藥典》2015 年版四部通則0103 膠囊劑[19]，檢查膠囊水分、裝量差異和崩解時限;(2)薄層鑒別：稱取3批膠囊內容物40 mg研細，加入甲醇10 mL，超聲30 min后過濾，獲得供試品溶液。取白芨苷對照品適量，加甲醇超聲溶解后制成濃度為1 g/L的對照品溶液。以空白輔料的甲醇溶液作為陰性對照溶液，選擇氯仿 ∶乙酸乙酯 ∶甲醇 ∶水=4 ∶3 ∶3 ∶0.25為展開劑，顯色劑為10%硫酸乙醇溶液；吸取配制好的上述溶液分別點樣于同一硅膠板上，放置于層析缸中展開，取出晾干，噴上顯色劑后，于電爐上方105 ℃烘烤加熱至顯色清晰。

1.2.4白芨苷含量的測定 (1)色譜條件 ：Waters Symmetry C18色譜柱(4.6 mm×150 nm×5 μm)，保護柱為Phenomenex Security Guard C18，柱溫40 ℃，流動相為甲醇 ∶水(40 ∶60)，檢測波長為223 nm，流速1.0 mL/min，進樣體積10 μL；理論塔板數(shù)以白芨苷計數(shù)應不低于5 000，白芨苷與其它色譜峰分離度>1.5，對照品溶液、供試品溶液與陰性樣品溶液色譜圖見圖1;(2)對照品溶液的制備：稱取白芨苷標準品5.09 mg，置于10 mL量瓶中，甲醇溶解定容后，制成濃度為0.509 g/L的儲備溶液，搖勻，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?(3)供試品溶液的制備：稱取膠囊內容物0.2 g，置于圓底燒瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質量，加熱回流處理2 h，冷卻至室溫，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾。量取續(xù)濾液5 mL轉移至25 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，即得;(4)陰性樣品溶液的制備：按照止血精膠囊處方比例及制備工藝，制成缺白芨非多糖組分的陰性樣品溶液，按“(3)”方法處理，即得。

注：A為白芨苷對照品溶液，B為供試品溶液，C為陰性樣品溶液。

2 結果

2.1 性狀

膠囊劑每粒間無黏結，外觀干凈整潔、沒有滲漏和囊殼破裂，膠囊內容物均為黃棕色顆粒、沒有結塊現(xiàn)象，味微苦、無異味。

2.2 薄層鑒別

供試品溶液與對照品溶液在對應位置上均顯示相同顏色的斑點，且輔料對其無干擾。見圖2。

注：1為對照品溶液，2、3、4為不同批次供試品溶液，5為陰性對照溶液。

2.3 水分、裝量差異和崩解時限

3批樣品(S1、S2和S3)含水量均<9.0%。裝量差異中取3批止血精膠囊各10粒，進行檢查，由表1可知，3批膠囊劑裝量差異均在±10%內，符合規(guī)定。依據(jù)《中國藥典》2015 年版四部通則0921崩解時限檢查法，3批止血精膠囊均在30 min內崩解，符合藥典對硬膠囊劑崩解時限的要求。

表1 3批膠囊(每批10粒)裝量差異結果

2.4 白芨苷的含量測定

2.4.1線性關系考察 精密量取“1.2.4(2)”項下制備的對照品儲備液2.0、1.6、1.0、0.8、0.5和0.25 mL，分別置于25 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，混勻，制得濃度為40.72、32.58、20.36、16.29、10.18和5.09 mg/L的系列對照品溶液。按“1.2.4(1)”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以峰面積(Y)為縱坐標，對照品濃度為橫坐標(X)，進行線性回歸。白芨苷回歸方程：Y=13 933X+24.413(r=0.999 9)，表明白芨苷檢測濃度線性范圍為5.09～40.72 mg/L，在上述濃度范圍內，白芨苷峰面積與對應濃度線性關系良好。

2.4.2精密度試驗 取“1.2.4(3)”項下供試品溶液(編號S6)，按照“1.2.4(1)”項色譜條件下連續(xù)進樣6次，測定白芨苷峰面積，計算得到白芨苷峰面積的RSD為0.23%，表明儀器精密度良好。

2.4.3重復性試驗 取樣品S6共6份，每份約0.2 g，按“1.2.4(3)”項下方法制備供試品溶液，按“1.2.4(1)”項色譜條件，于223 nm波長下測定峰面積按照外標法計算樣品含量，測定6份樣品含量的RSD。計算得到白芨苷的平均含量為26.27 mg/g，RSD為0.33%，表明該方法重復性良好。

2.4.4加樣回收率試驗 稱取已知含量的樣品(編號S6)9份(每份約0.1 g)，按樣品中白芨苷本底含量加入50%(3份)、100%(3份)、150%(3份)質量的對照品，按照“1.2.4(3)”項下方法制成低、中、高3個質量濃度的加樣回收樣品溶液，在“1.2.4(1)”項色譜條件下進樣測定，計算回收率和RSD。由表2結果計算得出白芨苷的加樣回收率平均值為100.48%，RSD為2.52%。

表2 加樣回收率試驗結果

2.4.5穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液S6，分別于室溫下放置0、2、4、8、16 h按照“1.2.4(1)”項色譜條件下，于223 nm波長下測定白芨苷峰面積，經(jīng)計算白芨苷峰面積RSD為0.38%，表明供試品溶液在室溫條件下16 h內穩(wěn)定。

2.4.6樣品含量測定 分別取10批止血精膠囊膠囊樣品，按“1.2.4(3)”項下方法制備供試品溶液，按“1.2.4(1)”項下色譜條件下，于223 nm波長下測定白芨苷峰面積，按外標法計算膠囊中白芨苷的含量，每份樣品測定3次，取平均值，結果見表3。

表3 白芨苷含量測定結果

3 討論

白芨具有很重要的臨床藥用價值，特別是在止血方面，前期已經(jīng)證明其主要成分非多糖表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢，故本研究在前期基礎上將白芨非多糖部分制備為膠囊劑，結果表明制備工藝穩(wěn)定、質量可控，也提高了藥物穩(wěn)定性。

通過粉體學研究，發(fā)現(xiàn)白芨非多糖浸膏粉極易吸潮，直接罐裝會影響其質量，故進行了輔料和潤濕劑的考察，而輔料的篩選、用量是實驗的關鍵所在。本實驗根據(jù)參考文獻[20-21]，進行了輔料用量和種類的考察，先后考察了淀粉、糊精、甘露醇和微晶纖維素，浸膏粉與不同輔料混勻后，其吸濕性和流動性均降低。其中，以微晶纖維素為輔料時，休止角為30.28 ℃，小于選用其余3種輔料時的休止角；且在濕度環(huán)境為75 %下，12 h后，仍呈粉末狀(吸濕率為11.13 %，均小于其余3種輔料)，故選擇微晶纖維素作為輔料制備膠囊劑?？疾炝瞬煌壤乃幏叟c微晶纖維素混合(10 ∶1、5 ∶1和1 ∶1)，發(fā)現(xiàn)藥粉與微晶纖維素為1 ∶1混合時，休止角最小，浸膏粉的流動性得到了改善，吸濕性最低。

有研究表明，乙醇的濃度與用量對顆粒劑的成型具有直接的影響[22]，故進行了乙醇濃度的考察，發(fā)現(xiàn)乙醇濃度為75%時，黏性適中、不起團、易過篩，制成的顆粒收率達到了80 %，且流動性和吸濕性均符合膠囊劑的要求。

結合白芨非多糖提取率及白芨臨床用量，表明止血精多糖膠囊每天的服用劑量為0.78 g，若每天服用3次，每次2粒，則每粒膠囊質量為0.13 g(含生藥量2.5 g),則所需膠囊體積為0.28 mL,而3號膠囊體積為0.3 mL,故用3號膠囊灌裝。

本實驗在對TLC條件進行篩選時，考察了氯仿:乙酸乙酯 ∶甲醇 ∶水、氯仿 ∶甲酸 ∶甲醇以及正丁醇 ∶乙酸乙酯 ∶水體系，發(fā)現(xiàn)后兩者萃取得到的色譜圖均出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，且分離時間長。而前者分離度良好，得到的色譜圖斑點清晰分明，且重現(xiàn)性好。故最終確定展開劑為氯仿 ∶乙酸乙酯 ∶甲醇 ∶水(4 ∶3 ∶3 ∶0.25)。

研究表明，白芨非多糖中的主要成分為白芨苷[18,23]。因此采用HPLC控制白芨苷的含有量，在進行檢測波長的確定時，通過采用二極管陣列檢測器，對白芨苷在200～400 nm處進行紫外吸收全波長掃描，發(fā)現(xiàn)白芨苷在223 nm檢測波長條件下基線平穩(wěn)，色譜豐度較好；在進行柱溫考察時，通過考察色譜柱溫在25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃時的分離效果，發(fā)現(xiàn)當柱溫為30 ℃時，白芨苷以及各樣品溶液分離效果最佳。HPLC法簡便、準確，重復性良好，可用于白芨非多糖止血精膠囊的質量控制。