苗藥赤脛散乙酸乙酯部位的化學(xué)成分分離及鑒定*

王彬宇， 黃家宇， 杜秋瑩， 陳思憶， 陳菊， 魯婷婷， 李莉*

(貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院， 貴州 貴陽 550025)

苗藥赤脛散(PolygonumruncinatumBuch.- Ham. Var. sinense Hemsl.)為蓼科蓼屬植物赤脛散的干燥根莖，別名花蝴蝶、血當(dāng)歸等，其性寒、味苦、澀、性平及無毒，收載于《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2003年版，是西南苗族地區(qū)常用藥[1-2]。苗藥赤脛散主要分布于貴州、云南及湖北等地，民間常用于治療腹痛、痢疾、急性胃腸炎、吐血咯血、痔瘡出血、赤白帶下、月經(jīng)不調(diào)及跌打損傷等，外用治療乳腺炎和癰癤腫毒[3]。目前文獻(xiàn)對赤脛散的化學(xué)成分報(bào)道較少，主要集中在揮發(fā)油和鞣花酸類成分的研究[4-7]。現(xiàn)代藥學(xué)研究證明，赤脛散提取物具有良好的抑菌作用[8]，本課題組前期對其體外抑菌活性部位進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯萃取部最優(yōu)[9]。為進(jìn)一步明確其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)對赤脛散藥材乙酸乙酯部的化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)研究，分離并鑒定其中的化合物，現(xiàn)將結(jié)果匯報(bào)如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1藥材來源 赤脛散藥材產(chǎn)自貴州省貴陽市開陽縣城關(guān)鎮(zhèn)，經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室龍慶德副教授鑒定為蓼科蓼屬植物赤脛散的干燥根。

1.1.2主要儀器與試劑 超導(dǎo)核磁共振波譜儀(德國BRUKER)，TSQ Quantum三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀(美國Thermo Finnigan)，Sephadex LH-20(美國GE Healthcare)；厚制備板(煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司)，GF254硅膠薄層板、硅膠(80-100目、200-300目)購自青島海洋化工有限公司；氘代甲醇和氘代吡啶(中國薩恩化學(xué))，氘代氯仿(上海泰坦)；有機(jī)試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1赤脛散乙酸乙酯部位的提取 取赤脛散干燥根15 kg，粉碎成粗粉后用10倍量95%乙醇浸泡過夜，加熱回流提取3次、3 h/次，合并提取液，濃縮后得到總浸膏；加水分散，用石油醚、乙酸乙酯及正丁醇依次萃取，濃縮得石油醚部位6.4 g、乙酸乙酯部位1.6 kg及正丁醇部位2.1 kg。

1.2.2乙酸乙酯部位初步分離 取乙酸乙酯部位樣品380.7 g，加入適量二氯甲烷-甲醇混合溶劑進(jìn)行溶解，取80～100目硅膠適量，于恒溫水浴鍋上拌樣(50 ℃)，至溶劑揮干，無明顯顆粒感；取200～300目硅膠，采用濕法裝柱，干法上樣，然后用二氯甲烷-甲醇=(1 ∶0～0 ∶1)進(jìn)行梯度洗脫，采用錐形瓶收集流份，通過薄層色譜法點(diǎn)樣、展開、紫外燈下觀察，合并相似的組分并進(jìn)行編號，得到Fr.1～Fr.7。

1.2.3樣品Fr.1-Fr.5分離與純化 Fr.1重結(jié)晶得化合物1(493.0 mg)，經(jīng)石油醚-乙酸乙酯(80 ∶1)硅膠柱層析得化合物3(594.7 mg)；Fr.2經(jīng)二氯甲烷-甲醇(80 ∶1)硅膠柱層析、Sephadex LH-20(氯仿 ∶甲醇=1 ∶1)凝膠柱層析得化合物2(126.2 mg)；Fr.3經(jīng)二氯甲烷-甲醇(50 ∶1)硅膠柱層析、Sephadex LH-20(氯仿 ∶甲醇=1 ∶1)凝膠柱層析得化合物9(42.3 mg)；Fr.4經(jīng)二氯甲烷-甲醇(30 ∶1～0 ∶1)硅膠柱梯度洗脫得6個組分(Fr.4-1～Fr.4-6)，F(xiàn)r.4-1經(jīng)Sephadex LH-20(氯仿 ∶甲醇=1 ∶1)凝膠柱層析、制備薄層(乙酸乙酯 ∶丙酮=5 ∶1)層析得化合物4(10.8 mg)、化合物5(17.9mg)；Fr.4-2經(jīng)Sephadex LH-20(氯仿 ∶甲醇=1 ∶1)凝膠柱層析得化合物6(23.0 mg)；Fr.5經(jīng)二氯甲烷-甲醇(15 ∶1～0 ∶1)硅膠柱層析、Sephadex LH-20(氯仿 ∶甲醇=1 ∶1)凝膠柱層析得化合物7(11.7 mg)、化合物8(185.6 mg)。

2 結(jié)果

2.1 化合物1

白色片狀結(jié)晶，C29H50O；ESI-MSm/z為437.36 [M+Na]+；1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ為3.49～3.57(1H，m，H-3)、5.32～5.36(1H，m，H-6)、0.68(3H，s，H-18)、1.01(3H，s，H-19)、0.92(3H，d，J=6.4 Hz，H-21)及0.81～0.86(9H，ovelap，H-26,27,29)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δ為37.26(C-1)、29.71(C-2)、71.83(C-3)、42.33(C-4)、140.77(C-5)、121.74(C-6)、31.92(C-7)、31.67(C-8)、50.14(C-9)、36.52(C-10)、21.10(C-11)、39.78(C-12)、42.31(C-13)、56.78(C-14)、24.32(C-15)、28.26(C-16)、56.06(C-17)、11.87(C-18)、19.41(C-19)、36.16(C-20)、18.79(C-21)、33.95(C-22)、26.07(C-23)、45.84(C-24)、29.16(C-25)、19.83(C-26)、19.04(C-27)、23.07(C-28)及11.99(C-29)。鑒定為β-谷甾醇。

2.2 化合物2

淡黃色粉末，C17H12O8；ESI-MSm/z為343.07 [M-H]-；1H NMR (600 MHz, Pyr)δ為7.84(1H，s，H-5)、8.06(1H，s，H-5′)、4.17(3H，s，3-OCH3)、4.22(3H，s，3′-OCH3)、3.88(3H，s，4′-OCH3)；13C NMR (150 MHz, Pyr)δ為111.61(C-1)、141.78(C-2)、141.14(C-3)、154.08(C- 4)、112.60(C-5)、112.90(C-6)、158.93(C-7)、113.60(C-1′)、142.11(C-2′)、141.51(C-3′)、154.31(C-4′)、107.85(C-5′)、114.08(C-6′)、159.03(C-7′)、61.10(3-OCH3)、61.34(3′-OCH3)及56.37(4′-OCH3)。鑒定為3,3′,4 ′-三甲基鞣花酸。

2.3 化合物3

淡黃色油狀物，C16H22O4；ESI-MSm/z為279.12 [M+H]+和301.11[M+ Na]+；1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ為7.68～7.71(2H，m，H-2,5)、7.46～7.49(2H，m，H-3,4)、4.29(2H，t，J=6.8 Hz，H-1′)、1.66～1.73(2H，m，H-2′)、1.37～1.45(2H，m，H-3′)、0.92(3H，t，J=7.6 Hz，H-4′)、4.08(2H，d，J=6.4 Hz，H-1″)、1.99～2.05(1H，m，H-2″)，0.97(6H，d，J=6.8 Hz，H-3″,H-4″)；13C NMR (100 MHz, CDCl3)δ為132.29(C-1,C-6)、130.74(C-2,C-5)、128.66(C-3,C-4)、167.32 (C-7,C-8)、65.20(C-1′)、30.46(C-2′)、18.97(C-3′)、13.54(C-4′)、71.46(C-1″)、27.60 (C-2″)及19.05(C-3″,C-4″)。鑒定為鄰苯二甲酸正丁酯異丁酯。

2.4 化合物4

白色粉末，C8H8O4；ESI-MSm/z為167.02[M-H]-；1H NMR (600 MHz, MeOD)δ為7.55(1H，d，J=1.8 Hz，H-2)、6.71(1H，d，J=7.8 Hz，H-5)、7.46(1H，dd，J=7.8,1.8 Hz，H-6)及3.86(3H，s，3-OCH3)；13C NMR (150 MHz, MeOD)δ為128.07(C-1)、112.56(C-2)、147.16(C-3)、150.38(C-4)、114.25(C-5)、122.97(C-6)、174.49(C-7)及54.82(3-OCH3)。鑒定為香草酸。

2.5 化合物5

白色針狀結(jié)晶，C9H10O5；ESI-MSm/z為197.05[M-H]-；1H NMR (600 MHz, MeOD)δ為7.33(2H，s，H-2,6)和3.88(6H，s，2×OCH3)；13C NMR (150 MHz, MeOD)δ為120.64(C-1)、106.91(C-2,6)、147.42(C-3,5)、140.29(C-4)、168.66(C-7)及55.37(2×OCH3)。鑒定為丁香酸。

2.6 化合物6

白色針狀結(jié)晶，C7H6O3；ESI-MSm/z為137.07[M-H]-；1H NMR (400 MHz, MeOD)δ為7.90(2H，d，J=8.8 Hz，H-2,6)和6.84(2H，d，J=8.8 Hz，H-3,5)；13C NMR (100 MHz, MeOD)δ為121.41(C-1)、114.64(C-2,6)、131.61(C-3,5)、161.93 (C-4)及168.82(C-7)。鑒定為對羥基苯甲酸。

2.7 化合物7

淡黃色粉末，C7H6O4；ESI-MSm/z為153.01[M-H]-；1H NMR (400 MHz, MeOD)δ為7.43～7.46(2H，m，H-2,6)和6.82(1H，d，J=8.4 Hz，H-5)；13C NMR (100 MHz, MeOD)δ為121.78(C-1)、116.32(C-2)、144.66(C-3)、150.11(C-4)、114.35(C-5)、122.48(C-6)及168.90(C-7)。鑒定為原兒茶酸。

2.8 化合物8

無色針狀結(jié)晶，C7H6O5；ESI-MSm/z為169.11[M-H]-；1H NMR (400 MHz, MeOD)δ為7.08(2H，s，H-2,6)；13C NMR (100 MHz, MeOD)δ為120.55(C-1)、108.92(C-2,6)、144.99(C-3,5)、138.20(C-4)及169.00(C-7)。鑒定為沒食子酸。

2.9 化合物9

白色粉末，C9H10O5；ESI-MSm/z為197.03[M-H]-；1H NMR (600 MHz, MeOD)δ為7.05(2H，s，H-2,6)，4.27(2H，q，J=7.2 Hz，H-8)，1.34(3H，t，J=7.2 Hz，H-9)；13C NMR (150 MHz, MeOD)δ為120.37(C-1)，108.61(C-2,6)，145.08(C-3,5)，138.30(C-4)，167.18(C-7)，60.29(C-8)，13.25(C-9)。鑒定為沒食子酸乙酯。

3 討論

本研究從苗藥赤脛散乙酸乙酯部位中分離鑒定了9個化合物，將分離化合物的波譜數(shù)據(jù)與國內(nèi)外文獻(xiàn)[5,10-21]進(jìn)行比對，再通過質(zhì)譜與化合物理化性質(zhì)進(jìn)一步分析，最終確定化合物1～9的結(jié)構(gòu)歸屬。其中化合物3(鄰苯二甲酸正丁酯異丁酯)、化合物4(香草酸)、化合物5(丁香酸)、化合物6(對羥基苯甲酸)及化合物7(原兒茶酸)等5個化合物為首次在該植物中分離得到，進(jìn)一步完善了苗藥赤脛散的化學(xué)成分信息，為其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定了一定的理論基礎(chǔ)，為赤脛散資源開發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)前期使用混合有機(jī)溶劑溶解樣品，采用石油醚-乙酸乙酯、二氯甲烷-甲醇、乙酸乙酯-甲醇、石油醚-丙酮、三氯甲烷-甲醇分別作為展開劑進(jìn)行薄層色譜分析，結(jié)果表明二氯甲烷-甲醇和三氯甲烷-甲醇的分離效果較好，具有良好的成點(diǎn)性，因三氯甲烷對光敏感，在光照下易被氧化生成劇毒光氣且屬于易制毒管制化學(xué)品，故選擇二氯甲烷-甲醇作為赤脛散乙酸乙酯部位初步分離的洗脫劑。初步分段后根據(jù)各組分樣品的極性大小和分離效果再進(jìn)行洗脫劑的選擇。

由于乙酸乙酯萃取部位的化合物為中大極性，故采用正相硅膠和葡聚糖凝膠 LH-20交替使用，通過反復(fù)柱層析使分離效果得到提高。經(jīng)初步分離后Fr.1組分中觀察到大量固體，重結(jié)晶后即得到化合物1，剩余母液中存在較多雜質(zhì)，通過薄層色譜分析后采用石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)進(jìn)行梯度硅膠柱層析，再通過反復(fù)凝膠純化得到化合物3。因化合物4和化合物5極性相似、分子量大小相近，硅膠柱層析及凝膠均無法使其完全分離且樣品量較少，嘗試多種混合有機(jī)溶劑后最終選用乙酸乙酯-丙酮作為展開劑，通過厚制備薄層層析板進(jìn)行分離與純化。其余化合物大都經(jīng)不同比例的二氯甲烷-甲醇系統(tǒng)通過正相硅膠柱多次梯度洗脫，再由葡聚糖凝膠 LH-20純化得到。

在單體確定的過程中，使用多種不同極性的混合展開劑分別展開，在紫外燈下進(jìn)行觀察。同時(shí)，借助碘、10%硫酸乙醇等廣譜顯色劑及高效液相色譜等手段進(jìn)行綜合判斷分析。最后，通過波譜與質(zhì)譜等技術(shù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

本實(shí)驗(yàn)首次在該植物中分離得到的香草酸(4)、丁香酸(5)、對羥基苯甲酸(6)及原兒茶酸(7)已被證實(shí)具有抗菌、抗病毒及抗氧化等藥理作用[22-24]，為苗藥赤脛散的抑菌活性物質(zhì)，但當(dāng)前對于酚酸類化合物的抗菌機(jī)制尚未完全明確[25]，有待深入研究。