水族藥雞胚質(zhì)量控制方法的初步研究*

劉春花， 游景瑞,， 王愛民， 王永林， 陳旭利， 馬雪， 鄭林， 李勇軍**

(1. 貴州醫(yī)科大學(xué) 民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心 & 省部共建藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550025； 3. 貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 4. 貴州水族藥物開發(fā)有限責(zé)任公司， 貴州 黔南布依族苗族自治州 558100)

雞胚為雉科動(dòng)物家雞(GallusgallusdomesticusBrisson)干燥胚胎，是水族常用民間藥物，其用藥史最早可追溯到清朝的中后期，在貴州省黔南州水族民間用藥已有100多年的歷史，廣泛流傳于貴州省黔南州南部地區(qū)。雞胚味甘、咸、腥，性溫，歸脾、胃經(jīng)，用于體虛贏瘦、骨折、筋傷疼痛等，有溫中益氣、補(bǔ)精填髓的功效[1-2]。按照水族醫(yī)藥理論，以血肉之品補(bǔ)益肌肉骨骼，據(jù)《水族骨傷醫(yī)藥》中記載，小雞仔具有療傷生肌的作用，為水族骨傷醫(yī)藥的常用接骨藥物[3-5]，現(xiàn)代研究也報(bào)道雞胚參與的方藥在治療骨傷方面具有較好的療效[5-10]。目前關(guān)于雞胚的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)較少，限制了其廣泛的應(yīng)用和開發(fā)，因此本研究通過對(duì)雞胚藥材的性狀、顯微鑒別、薄層鑒別、檢查(水分、總灰分、揮發(fā)性鹽基氮)及醇溶性浸出物等項(xiàng)目進(jìn)行研究，初步建立雞胚質(zhì)量控制方法，為完善雞胚的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1材料與儀器 超聲波清洗儀(上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠)、XTP-A500多功能粉碎機(jī)(永康市紅太陽(yáng)機(jī)電有限公司)、EL204電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)、WP-MP-II-20實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)(四川沃特爾科技發(fā)展有限公司)、青島海洋硅膠G板(青島海洋化工廠分廠)、煙臺(tái)黃海江友硅膠G板(煙臺(tái)黃海江友化工廠)、青島鼎康硅膠G板(青島鼎康化工廠)、尼康50i顯微鏡及DS-Fi2成像系統(tǒng)(日本尼康公司)、REPROSTAR3薄層數(shù)碼成像系統(tǒng)(瑞士CAMAG公司)、DK-98-Ⅱ型水浴鍋和DH600BII恒溫箱(天津泰斯特儀器有限公司)。

1.1.2試藥 雞胚為家雞蛋經(jīng)(37.9±0.5)℃孵化17～18 d除去蛋殼的胚胎，新鮮胚胎示意圖見圖1。本研究所用雞胚樣品均由貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，批號(hào)分別為20160929、20161124及20170302，樣品均由貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院中藥民族藥標(biāo)本館龍慶德副教授鑒定為雉科動(dòng)物家雞CallusgallusdomesticusBrisson干燥胚胎，憑證標(biāo)本存放于貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。取雞胚(批號(hào)20170302)為對(duì)照藥材。無(wú)水乙醇、95%乙醇、甲醇、水合氯醛、硼酸、碳酸鉀、甘油及溴甲酚綠指示劑(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，三氯甲烷、冰醋酸、丙酮、正丁醇(上海試四赫維化工公司)，茚三酮、甲基紅指示劑(上海馨晟試化工科技有限公司)，丙三醇購(gòu)(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)，阿拉伯樹膠(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，鹽酸(重慶川東化工(集團(tuán))有限公司)，無(wú)水碳酸鈉基準(zhǔn)試劑(天津市化學(xué)試劑研究所有限公司)，以上試劑均為分析純。

圖1 新鮮雞胚

1.2 方法

1.2.1性狀鑒別 采用直尺和游標(biāo)卡尺對(duì)干燥雞胚藥材的大小進(jìn)行測(cè)量并取平均值，采用看、摸、聞及嘗等直觀方法對(duì)樣品的形狀、色澤、表面、質(zhì)地、斷面及氣味等進(jìn)行鑒定。

1.2.2顯微鑒別 取上述3批雞胚藥材分別粉碎(過4號(hào)篩)，得粉末。挑取少許雞胚藥材粉末置于載玻片上，滴加蒸餾水、水合氯醛試液或稀甘油試液等(必要時(shí)加熱進(jìn)行透化)，蓋上蓋玻片，置顯微鏡下(40×10)觀察、測(cè)量和拍照。

1.2.3薄層色譜鑒別 取雞胚藥材粉末(過3號(hào)篩)1 g，加入70%乙醇溶液10 mL，40 kHZ超聲20 min，濾過，收集濾液，即得供試品溶液；另取雞胚對(duì)照藥材1 g，同法操作，制備對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2015年版四部[11]通則0502試驗(yàn)，分別精密吸取上述供試品及對(duì)照藥材溶液各10 μL，點(diǎn)于同一塊硅膠G板上，點(diǎn)成條帶狀，用正丁醇 ∶冰醋酸 ∶水(8 ∶3 ∶2)作為展開劑，進(jìn)行展開，然后取出硅膠板晾干，用茚三酮試液緩慢噴灑在硅膠板上，將硅膠板置于105 ℃下加熱，顯色，直至條帶顯色清晰，于日光下檢視，拍照。

1.2.4水分測(cè)定 參照《中國(guó)藥典》2015年版四部[11]通則0832水分測(cè)定法(第二法烘干法)，取雞胚藥材粉末(過二號(hào)篩)2 g，均勻平鋪于干燥恒質(zhì)量的扁形稱量瓶中，厚度不超過5 mm，開啟瓶蓋在100～105 ℃干燥5 h，蓋好蓋移置干燥器中，放冷30 min，稱質(zhì)量，再在上述溫度干燥1 h，然后放冷并稱定質(zhì)量，連續(xù)兩次干燥的差異值應(yīng)小于5 mg，如未達(dá)到要求，繼續(xù)上述干燥、冷卻和稱質(zhì)量步驟，直至連續(xù)兩次干燥的差異值小于5 mg，根據(jù)減少的質(zhì)量，計(jì)算雞胚藥材中的含水量(%)。

1.2.5總灰分測(cè)定 參照《中國(guó)藥典》2015年版四部[11]通則2302灰分測(cè)定法，取雞胚藥材粉末2 g，置熾灼至恒質(zhì)量的坩堝中，然后稱定質(zhì)量(準(zhǔn)確0.01 g)，于加熱板或電爐上緩緩碳化，注意避免燃燒，使粉末完全炭化，然后將坩堝和碳化好的樣品移至馬弗爐中，逐漸升高溫度至550 ℃，使其完全灰化并恒重，然后根據(jù)殘?jiān)|(zhì)量計(jì)算供試品中總灰分的含量(%)。

1.2.6揮發(fā)性鹽基氮測(cè)定 試驗(yàn)采用“中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.228-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定 第三法(微量擴(kuò)散法)”進(jìn)行。稱取雞胚藥材粉末10 g，置于具塞錐形瓶中，加水100 mL，邊加邊振搖，使試樣勻分散于液體中，浸漬30 min，過濾，取濾液即得供試品溶液。然后將水溶性膠(阿拉伯樹膠10 g、水10 mL、甘油50 mL及碳酸鉀5 g，研勻)均勻涂布于擴(kuò)散皿的邊緣，在擴(kuò)散皿中央內(nèi)室加入2%硼酸水溶液1 mL，并滴加1滴混合指示劑(甲基紅乙醇溶液 ∶溴甲酚綠乙醇溶液 = 1 ∶5)溶液；在擴(kuò)散皿外室精密加入供試品溶液1 mL，蓋上磨砂玻璃蓋，然后迅速加入飽和碳酸鉀溶液1 mL，并立刻蓋密，于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，使溶液充分混勻；置于(37±1)℃溫箱內(nèi)2 h后，取出，放至室溫，用0.01 mol/L鹽酸滴定液滴定至混合指示液終點(diǎn)顏色變?yōu)樽霞t色，記錄消耗的鹽酸體積，同時(shí)做試劑空白。按上述同法平行測(cè)定2次，計(jì)算平均值。鹽基氮含量計(jì)算公式：X={[(V1-V2) ×c×14]/[m×(V/V0) ×100}。X為試樣中揮發(fā)性鹽基氮的含量(mg/100 g或g/L)，V1為試液消耗鹽酸或硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積(mL)，V2為試劑空白消耗鹽酸或硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積(mL)，c為鹽酸或硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度(mol/L)，14為滴定1.0 mL鹽酸[c(HCl)=1.000 mol/L]或硫酸[c(1/2H2SO4)=1.000 mol/L]標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量(g/mol)，m為試樣質(zhì)量(g)，或試樣體積(mL)，V為準(zhǔn)確吸取的濾液體積(mL)。本方法中V=1，V0為樣液總體積(mL)；本方法中V0=100。

1.2.7醇溶性浸出物測(cè)定 按《中國(guó)藥典》2015年版四部[11]通則2201浸出物測(cè)定法中醇溶性浸出物測(cè)定法，取雞胚藥材粉末(過二號(hào)篩)2 g，置100 mL的錐形瓶中，精密加入乙醇50 mL，密塞，并稱定質(zhì)量，室溫靜置1 h后，水浴回流1 h；放冷，稱定質(zhì)量，用乙醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過；精密量取續(xù)濾液25 mL置蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥3 h，然后置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量，以干燥品計(jì)算供試品中醇溶性浸出物的含量(%)。

2 結(jié)果

2.1 性狀鑒別

雞胚藥材呈規(guī)則塊狀，長(zhǎng)3.3～8.5 cm，寬2.0～6.0 cm。表面棕黃色至黑棕色，被深黃色至暗棕色的柔軟羽毛，排列稀疏至致密。質(zhì)地硬脆、易折斷，斷面不平坦。夾雜黃色不規(guī)則大小不等的塊狀物，呈脂肪樣光澤，摸之有滑膩感，氣腥，味微咸。見圖2。

注：A批號(hào)為20160929，B批號(hào)為20161124，C批號(hào)為20170302。

2.2 顯微鑒別

雞胚粉末呈黃色至棕黃色。根據(jù)3批樣品粉末顯微特征表現(xiàn)為：羽毛雜色，多呈灰色；羽桿呈竹節(jié)狀，每節(jié)長(zhǎng)30～175 μm；羽根中間有空隙，細(xì)胞呈長(zhǎng)方形排列，長(zhǎng)34～87 μm；肌纖維組織排列成片狀，纖維多平直或呈微波狀，直徑1.7～5.5 μm；骨碎片組織呈不規(guī)則碎塊狀，表面有細(xì)小裂縫狀或圓形空隙，可見小孔狀骨陷窩。見圖3。

肌纖維組織 骨碎片組織 羽毛

2.3 薄層色譜鑒別

通過對(duì)樣品提取方法和色譜條件的優(yōu)化，通過耐用性實(shí)驗(yàn)的考察，得到 “1.2.3”項(xiàng)下的最佳條件，按上述薄層色譜鑒別方法，對(duì)3批樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示特征條帶清晰，分離度良好，供試品色譜中與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的條帶，見圖4。

注：1為20160929，2為20161124，3為20170302，4為對(duì)照藥材。

2.4 水分、總灰分、揮發(fā)性鹽基氮和醇溶性浸出物測(cè)定

3批雞胚藥材的水分、總灰分、揮發(fā)性鹽基氮和醇溶性浸出物結(jié)果見表1，結(jié)果顯示不同批次的雞胚中水分、總灰分、揮發(fā)性鹽基氮含量和醇溶性浸出物含量存在一定差異，推測(cè)可能與母體的生存環(huán)境、飲食以及藥材的取樣時(shí)間有關(guān)。

表1 雞胚的水分、總灰分、揮發(fā)性鹽基氮和醇溶性浸出物測(cè)定結(jié)果

3 討論

雞胚作為黔南地區(qū)具有典型民族特色的藥材之一，尤其在治療骨傷方面發(fā)揮著重要的作用，具有良好的開發(fā)和應(yīng)用前景。但是目前關(guān)于雞胚質(zhì)量控制的相關(guān)報(bào)道較少，為進(jìn)一步促進(jìn)雞胚藥材的應(yīng)用，建立其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)具有十分重要的意義。

性狀鑒定作為一種傳統(tǒng)的鑒定手段，經(jīng)過我國(guó)中醫(yī)工作者長(zhǎng)期積累的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，具有簡(jiǎn)單、直觀、快速的優(yōu)點(diǎn)[12-14]，于是本研究首先對(duì)雞胚藥材的性狀特征進(jìn)行了描述。中藥顯微鑒定是中藥材鑒別的主要方法之一，主要利用顯微技術(shù)確定中藥品種和質(zhì)量[15-19]，具有快速、專屬性強(qiáng)和成本低等特點(diǎn)，因此本研究通過粉末制片觀察到明顯的特征，如灰色的羽毛、竹節(jié)狀的羽桿、中空的羽根、片狀的肌纖維組織、表面有空隙及陷窩的不規(guī)則骨碎片組織等，這些都可作為雞胚鑒定的依據(jù)。

薄層色譜鑒別中，本研究通過考察不同提取溶劑(三氯甲烷、70%乙醇、95 %乙醇、甲醇、95%乙醇)，不同顯色與檢視方法，結(jié)果表明70%乙醇為提取溶液，點(diǎn)樣、展開后，茚三酮試劑顯色后信息豐富，故選擇70%乙醇為提取溶劑，茚三酮試劑加熱顯色后日光下觀察作為檢視方法。雞胚屬于動(dòng)物藥類，其含有豐富的氨基酸類成分，因此采用正丁醇-冰醋酸-水系統(tǒng)作為展開劑，為了能使樣品中的斑點(diǎn)具有良好的分離度，考察了不同比例的正丁醇 ∶冰醋酸 ∶水(8 ∶2 ∶2、8 ∶3 ∶3、8 ∶2 ∶3、8 ∶3 ∶2)對(duì)樣品的展開效果，結(jié)果顯示，展開劑為正丁醇 ∶冰醋酸 ∶水為8 ∶3 ∶2時(shí)，顯色后信息豐富，條帶Rf值適中，故選擇此比例為展開劑。不同來(lái)源的薄層板于不同溫、濕度下的色譜圖條帶均清晰，表明該方法適用性好，不同廠家來(lái)源的硅膠G板均能較好的鑒別雞胚藥材，同時(shí)相對(duì)濕度和溫度對(duì)該方法的影響不明顯。同一批雞胚藥材供試品溶液制備后，于室溫放置3 d后的色譜圖前后無(wú)明顯差異，說(shuō)明該樣品穩(wěn)定性良好。于是采用上述建立的薄層色譜法對(duì)3批雞胚藥材進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示各批次藥材主條帶明顯、清晰、分離度良好，同時(shí)與對(duì)照藥材主條帶顏色和位置保持一致，進(jìn)一步說(shuō)明該方法專屬性好，可用于不同批次雞胚藥材的有效鑒別；然而不同產(chǎn)地雞胚藥材中主條帶顏色深淺存在差異，提示不同批次雞胚藥材中該類成分含量可能不同，這可能與受精卵的來(lái)源及其具體孵化時(shí)間有關(guān)，具體原因還有待進(jìn)一步研究。

雞胚藥材通常置通風(fēng)干燥、防霉、防蛀的條件下，考慮到雞胚藥材貯藏期間易霉變和蟲蛀，因此，制定水分測(cè)量，最終暫定水分不得過10.0%?？偦曳肿鳛樵u(píng)定藥材純度的重要指標(biāo)，本研究暫定總灰分不超過9.0%。雞胚富含蛋白質(zhì)，動(dòng)物蛋白由于細(xì)菌及酶的作用使之腐敗分解而產(chǎn)生的游離氨和揮發(fā)性羥胺、芳香胺類，如三甲胺、尸胺、酪胺、色胺、吲哚等揮發(fā)性堿性物質(zhì)，為確保臨床用藥安全，對(duì)揮發(fā)性堿性物質(zhì)的檢查是控制其質(zhì)量的一項(xiàng)重要內(nèi)容[20-23]。本研究結(jié)果顯示，雞胚中揮發(fā)性鹽基氮的含量0.25 mg/100 g遠(yuǎn)小于“GB2707-2016 國(guó)家食品安全標(biāo)準(zhǔn)鮮(凍)畜、禽產(chǎn)品”中規(guī)定的15 mg/100 g限度以及“DBS 32/007-2016 江蘇省食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) 熟制雞胚蛋(活珠子)”中規(guī)定的10 mg/100 g，故本品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中暫不考慮列入揮發(fā)性鹽基氮的檢查。由于雞胚在民間常用乙醇加工處理后用藥，因此選擇研究醇溶性浸出物。根據(jù)結(jié)果暫定本品醇溶性浸出物不得少于15.0%。

綜上所述，本研究中雞胚粉末的顯微鑒別和薄層色譜鑒別方法可作為快速鑒別正品雞胚藥材提供依據(jù)，同時(shí)水分、總灰分檢查和醇溶性浸出物測(cè)定為控制雞胚藥材的質(zhì)量提供了參考。