不同抗生素對(duì)卷葉貝母鱗片葉誘導(dǎo)生長的影響

馬濤 陳芳 王躍華 李含霜 王帥 王銘愉

摘要 [目的]研究不同種類和濃度的抗生素對(duì)卷葉貝母鱗片葉誘導(dǎo)生長的影響。[方法]分別將不同濃度的頭孢霉素、頭孢曲松鈉和頭孢噻肟鈉抗生素添加到卷葉貝母鱗片葉的生長培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，研究不同種類和濃度的抗生素對(duì)卷葉貝母鱗片葉生長的影響。[結(jié)果]不同濃度的3種抗生素對(duì)卷葉貝母鱗片葉誘導(dǎo)生長作用的影響是不同的。與對(duì)照試驗(yàn)比較，在培養(yǎng)基中添加不同濃度的頭孢霉素對(duì)其愈傷組織的誘導(dǎo)均有抑制作用，以添加濃度為800 mg/L的頭孢霉素對(duì)其愈傷組織的抑制作用最強(qiáng)，其愈傷組織的誘導(dǎo)率最低，僅為25.18%，但當(dāng)其添加濃度為200 mg/L時(shí)，芽的誘導(dǎo)率最高，為47.50%;在培養(yǎng)基中添加頭孢曲松鈉的濃度為200 mg/L時(shí)，其卷葉貝母鱗片葉的愈傷組織誘導(dǎo)率和芽誘導(dǎo)率均最高，分別為100%和82.52%;在培養(yǎng)基中添加400 mg/L的頭孢噻肟鈉時(shí)，誘導(dǎo)愈傷組織的效果最好，誘導(dǎo)率為100%;而在添加濃度為200 mg/L時(shí)，其芽誘導(dǎo)率最高，為92.53%。[結(jié)論]該研究為下一步開展卷葉貝母植物遺傳轉(zhuǎn)化工作提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 卷葉貝母;鱗片葉;抗生素;誘導(dǎo);生長;影響

中圖分類號(hào) S567.23+1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2021）10-0161-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.10.043

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Effects of Different Antibiotics on the Growth of Scaly Leaf of Fritillaria cirrhosa

MA Tao，CHEN Fang，WANG Yue-hua et al

（School of Pharmacy and Bioengineering，Chengdu University，Chengdu，Sichuan 610106）

Abstract [Objective]To study the effects of antibiotics under different kinds and concentrations on the induced growth of Fritillaria cirrhosa scaly leaf.[Method]Different concentrations of cephalosporin， ceftriaxone sodium and cefotaxime sodium antibiotics were added to the growth medium of Fritillaria cirrhosa scaly leaves for induction culture， to study the effects of different kinds and concentrations of antibiotics on the growth of Fritillaria cirrhosa's scales.[Result]Different concentrations of 3 antibiotics had different effects on the growth induction of Fritillaria cirrhosa scaly leaf. Compared with the control experiment， adding different concentration of cephalosporins in culture toxin on the callus induction has inhibitory effect， to add a concentration of 800 mg/L of cephalosporins drug the strongest inhibitory effect of the callus， the callus induction rate lowest was only 25.18%， but when added concentration of 200 mg/L， bud induction rate was as high as 47.50%;when ceftriaxone sodium was added to the medium at a concentration of 200 mg/L， the callus induction rate and bud induction rate of Fritillaria cirrhosa scales were at the highest of 100% and 82.52% respectively;when 400 mg/L cefotaxime sodium was added to the medium， the callus induction effect was the best， with the induction rate of 100%;when the concentration was 200 mg/L， the highest bud induction rate was 92.53%.[Conclusion]This research provides a theoretical basis for the next step of genetic transformation of Fritillaria cirrhosa.

Key words Fritillaria cirrhosa;Scaly leaf;Antibiotics;Induction;Growth;Effect

卷葉貝母是百合科植物，其鱗莖是名貴中藥材，具有療效卓著的潤肺止咳作用。近年來，因其價(jià)格上漲，加之無計(jì)劃地盲目采挖，致使其自然資源日趨枯竭。而采用生物工程的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，可有效地改變藥用植物的基因型及性狀，培育出優(yōu)良的卷葉貝母植物新品種。當(dāng)前在藥用植物的遺傳轉(zhuǎn)化過程中，常采用操作方法簡單、轉(zhuǎn)化效率高和獲得拷貝數(shù)少的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法[1]。而在采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化植物的過程中，選擇出特定種類和濃度的抗生素來有效抑制其菌類的生長是非常必要的[2]。

實(shí)現(xiàn)藥用植物遺傳轉(zhuǎn)化的成功，在考慮選擇出能有效抑制農(nóng)桿菌生長的抗生素種類和濃度的同時(shí)，還要考慮到選擇出的抗生素種類和濃度對(duì)已轉(zhuǎn)化的植物生長不能造成危害。研究表明，向培養(yǎng)基中加入不適宜的抗生素種類和濃度會(huì)對(duì)成功轉(zhuǎn)化植物的正常生長和分化造成嚴(yán)重的影響[3-6]。因此，筆者主要研究頭孢霉素、頭孢噻肟鈉和頭孢曲松鈉3種抗生素在不同濃度條件下對(duì)卷葉貝母鱗片葉誘導(dǎo)和生長情況的影響，以期為下一步開展卷葉貝母植物遺傳轉(zhuǎn)化工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

卷葉貝母植物的鱗莖，來自川貝母野生撫育基地（位于康定折多山），由成都恩威集團(tuán)提供。

細(xì)胞分裂素（6-BA）、生長素（NAA），成都市科隆化學(xué)品有限公司;頭孢霉素、頭孢噻肟鈉和頭孢曲松鈉抗生素藥品由哈藥集團(tuán)生產(chǎn)。

1.2 外植體的處理

將卷葉貝母鱗莖從撫育基地采回后，清洗干凈，挑選質(zhì)量優(yōu)良（無病、無損傷）的鱗片葉，再用堿性洗液清洗，要求在流水中清洗2 h左右。然后將鱗片葉表面的水擦干，進(jìn)入超凈工作室，用升汞處理卷葉貝母鱗片葉（濃度0.1%，消毒時(shí)間8～10 min）。再用無菌水清洗3～5次，切成0.5 cm2大小，備用。

1.3 不同抗生素對(duì)卷葉貝母鱗片葉誘導(dǎo)生長的影響

將鱗片葉切成0.5 cm×0.5 cm大小，分別接種到添加了濃度為200、400、600和800 mg/L的頭孢霉素、頭孢曲松鈉、頭孢噻肟鈉的MS培養(yǎng)基中，并以不加入抗生素為對(duì)照。培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度1 500 lx，培養(yǎng)溫度20 ℃[7]，經(jīng)30 d培養(yǎng)后統(tǒng)計(jì)鱗片葉的愈傷組織誘導(dǎo)率、芽誘導(dǎo)率和鱗片葉外植體褐化率。

愈傷組織誘導(dǎo)率=（產(chǎn)生愈傷組織的鱗片葉數(shù)/接種鱗片葉總數(shù)）×100%

芽誘導(dǎo)率=（產(chǎn)生芽的鱗片葉數(shù)/接種鱗片葉總數(shù)）×100%

鱗片葉外植體褐化率=（褐化鱗片葉外植體數(shù)/接種鱗片葉外植體數(shù)）×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抗生素對(duì)卷葉貝母誘導(dǎo)率的影響

由圖1可知，頭孢霉素抗生素對(duì)卷葉貝母鱗片葉的愈傷組織產(chǎn)生抑制作用，并且隨著頭孢霉素抗生素濃度逐漸增高，其抑制作用更加明顯;當(dāng)培養(yǎng)基中添加的頭孢霉素濃度為800 mg/L時(shí)，其愈傷組織誘導(dǎo)率僅為25.18%，明顯低于對(duì)照組的97.51%。通過觀察還發(fā)現(xiàn)，在此條件下產(chǎn)生的愈傷組織質(zhì)地疏松、顏色多為白色，很難在后續(xù)的繼代中快速生長。

頭孢曲松鈉和頭孢噻肟鈉2種抗生素在卷葉貝母鱗片葉培養(yǎng)生長過程中，都表現(xiàn)出低濃度促進(jìn)生長和高濃度抑制生長的狀況，但2種抗生素對(duì)卷葉貝母鱗片葉生長的具體影響是不完全相同的。

在培養(yǎng)基中添加頭孢曲松鈉濃度為200 mg/L 時(shí)，在培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)，其鱗片葉的愈傷組織誘導(dǎo)率為最高，達(dá)100%，相對(duì)于對(duì)照組增長了2.55%;但隨著頭孢曲松鈉濃度再進(jìn)一步升高，其抑制作用逐漸顯現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中添加頭孢曲松鈉濃度為800 mg/L時(shí)，對(duì)其鱗片葉產(chǎn)生愈傷組織的抑制作用最強(qiáng)，即愈傷組織的誘導(dǎo)率最低，僅為40.47%。

在培養(yǎng)基中添加濃度為200和400 mg/L的頭孢噻肟鈉時(shí)，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)鱗片葉的愈傷組織誘導(dǎo)率均高于對(duì)照組，分別為98.79%和100%，由此說明濃度為200和400 mg/L的頭孢噻肟鈉都可促進(jìn)卷葉貝母鱗片葉產(chǎn)生愈傷組織，并且以濃度為400 mg/L的頭孢噻肟鈉促進(jìn)鱗片葉誘導(dǎo)愈傷組織的作用最強(qiáng);另外，通過觀察發(fā)現(xiàn)在此條件下產(chǎn)生的愈傷組織呈淡黃綠色、質(zhì)地緊密，并在后續(xù)的繼代培養(yǎng)過程中增速度也快。但隨著頭孢噻肟鈉濃度進(jìn)一步提高，逐漸顯現(xiàn)抑制作用，當(dāng)培養(yǎng)基中添加頭孢噻肟鈉濃度為800 mg/L時(shí)，對(duì)卷葉貝母鱗片葉愈傷組織生長的抑制作用最強(qiáng)，愈傷組織的誘導(dǎo)率最低，為47.45%。

2.2 不同抗生素對(duì)卷葉貝母芽誘導(dǎo)率的影響

根據(jù)圖2的芽誘導(dǎo)率試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析可知，在培養(yǎng)基中添加濃度為200 mg/L 的頭孢霉素、頭孢曲松鈉和頭孢噻肟鈉3種抗生素均有利于卷葉貝母鱗片葉產(chǎn)生不定芽，在培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)其芽誘導(dǎo)率分別為47.50%、82.52%和92.53%，都高于對(duì)照組（30.38%）;其中以200 mg/L的頭孢噻肟鈉抗生素促進(jìn)作用最強(qiáng)，其次為頭孢曲松鈉，而頭孢霉素對(duì)卷葉貝母鱗片葉誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽的促進(jìn)作用相對(duì)最弱。但當(dāng)3種抗生素在培養(yǎng)基中的添加濃度達(dá)到和超過400 mg/L以上時(shí)，對(duì)其鱗片葉誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽的促進(jìn)作用逐漸減弱，當(dāng)培養(yǎng)基中添加的頭孢霉素、頭孢曲松鈉和頭孢噻肟鈉3種抗生素的濃度為800 mg/L時(shí)，其對(duì)不定芽的誘導(dǎo)作用均表現(xiàn)為抑制，其中以頭孢霉素抗生素的抑制作用表現(xiàn)為最強(qiáng)，在培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)其芽誘導(dǎo)率僅為5.27%，相對(duì)于對(duì)照組下降了82.65%。而3種抗生素對(duì)卷葉貝母鱗片葉愈傷組織的芽誘導(dǎo)率均表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)生長和高濃度抑制生長。

2.3 不同抗生素對(duì)卷葉貝母褐化率的影響

從圖3試驗(yàn)結(jié)果中鱗片葉外植體受到的褐化情況來看，3種抗生素對(duì)鱗片葉外植體的褐化都起促進(jìn)作用，即在培養(yǎng)基中添加抗生素都會(huì)使外植體產(chǎn)生褐化。在培養(yǎng)基中添加濃度為200 mg/L 的3種抗生素對(duì)鱗片葉外植體均不產(chǎn)生明顯的褐化;但隨著在培養(yǎng)基中添加抗生素濃度的逐漸升高，3種抗生素也均會(huì)促使外植體的褐化產(chǎn)生。3種抗生素對(duì)卷葉貝母外植體褐化的具體影響是不完全相同的。其中頭孢曲松鈉和頭孢噻肟鈉在濃度為200 mg/L時(shí)，褐化率為0，當(dāng)超過200 mg/L 時(shí)，頭孢曲松鈉對(duì)卷葉貝母外植體褐化的影響十分明顯，呈現(xiàn)直線上升狀態(tài)。而頭孢噻肟鈉對(duì)卷葉貝母外植體褐化的影響有一個(gè)緩沖，但當(dāng)頭孢曲松鈉和頭孢噻肟鈉的添加濃度為800 mg/L 時(shí)，二者對(duì)其褐化的影響達(dá)到最高，即褐化率最高，分別為57.51%和47.51%，嚴(yán)重影響卷葉貝母鱗片葉誘導(dǎo)生長。

觀察分析試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加的頭孢霉素、頭孢曲松鈉和頭孢噻肟鈉3種抗生素中，以頭孢霉素對(duì)卷葉貝母鱗片葉的褐化程度影響為最小，在培養(yǎng)基中添加濃度小于600 mg/L時(shí)，不會(huì)造成鱗片葉外植體的褐化產(chǎn)生，但當(dāng)其濃度升高達(dá)到600 mg/L以上時(shí)，鱗片葉外植體也出現(xiàn)了褐化，褐化率為10.72%，當(dāng)添加濃度最高為800 mg/L時(shí)，頭孢霉素對(duì)卷葉貝母外植體褐化的影響也僅有15.32%。

3 討論與結(jié)論

在農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化中，將外植體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后，必須要選擇出適宜的抗生素來進(jìn)行有效除菌，以防止大量生長的農(nóng)桿菌對(duì)轉(zhuǎn)化植物產(chǎn)生的危害?？股夭粌H在植物遺傳轉(zhuǎn)化過程中具有很好的除菌作用，能有效確保成功轉(zhuǎn)化的植物材料存活，而且有的抗生素會(huì)直接影響植物組織的生長和分化，表現(xiàn)出類似植物激素的效應(yīng)[8]。為探究這種影響進(jìn)行抗生素種類和濃度的篩選是很必要的。該研究采用卷葉貝母的鱗片葉作為外植體，研究不同濃度的頭孢霉素、頭孢曲松鈉、頭孢噻肟鈉對(duì)卷葉貝母愈傷組織誘導(dǎo)和生長的影響。

該試驗(yàn)結(jié)果表明，不同質(zhì)量濃度的頭孢霉素對(duì)卷葉貝母鱗片葉愈傷組織誘導(dǎo)和生長有一定的抑制作用。隨著頭孢霉素質(zhì)量濃度的提高，頭孢霉素對(duì)愈傷組織的抑制作用加重，這與楊鳳美等[9]研究葡萄風(fēng)信子愈傷組織和高行英等[10]研究韭菜根愈傷組織得到的結(jié)果一致。而頭孢霉素質(zhì)量濃度低于200 mg/L對(duì)芽誘導(dǎo)影響不大，但是隨著濃度增加，逐漸開始對(duì)分化產(chǎn)生較大抑制作用。從褐化情況看，低于200 mg/L的頭孢霉素對(duì)愈傷組織幾乎無影響，隨著濃度加大有輕微褐化現(xiàn)象。根據(jù)頭孢霉素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)生長和分化再生能力的影響，綜合考慮，初步確定用頭孢霉素進(jìn)行處理時(shí)，當(dāng)頭孢霉素的濃度為200 mg/L時(shí)是比較好的培養(yǎng)濃度，即卷葉貝母愈傷組織的敏感濃度為200 mg/L。

植物離體培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基中植物激素添加的比例會(huì)影響愈傷組織的形成和分化出苗[11]。相對(duì)于頭孢霉素，頭孢噻肟鈉、頭孢曲松鈉對(duì)卷葉貝母愈傷組織毒性較小，并且在較低濃度時(shí)對(duì)愈傷組織都表現(xiàn)出植物生長激素類似效應(yīng)。在頭孢噻肟鈉質(zhì)量濃度低于400 mg/L時(shí)，對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)都有促進(jìn)作用;而頭孢曲松鈉在低于200 mg/L對(duì)愈傷組織也有促進(jìn)作用，其原因是抗生素與生長素2，4-D和NAA等的化學(xué)結(jié)構(gòu)有相似之處，因而在組織培養(yǎng)中也具有與激素類似的效應(yīng)，適當(dāng)濃度的該類抗生素能促進(jìn)愈傷組織的分化與生長[12]。而從芽誘導(dǎo)率看，與胡雨逸[13]在研究木瓜不定芽再生時(shí)得到類似規(guī)律，隨著頭孢曲松鈉濃度逐漸增加，愈傷組織誘導(dǎo)率和叢生芽平均增殖率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，200 mg/L處最高，達(dá)100%;低于400 mg/L的頭孢噻肟鈉誘導(dǎo)率也明顯高于對(duì)照組，表現(xiàn)出對(duì)芽分化具有強(qiáng)促進(jìn)作用，這與茹磊等[14]研究頭孢噻肟鈉對(duì)大白菜不定芽分化的影響結(jié)果一致。頭孢曲松鈉和頭孢噻肟鈉都表現(xiàn)出對(duì)芽分化有強(qiáng)烈促進(jìn)作用，有類似于細(xì)胞分裂素的作用，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究;而從褐化情況看，這2種抗生素在高濃度時(shí)，愈傷組織會(huì)出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，證明抗生素對(duì)愈傷組織產(chǎn)生毒害作用，迫使愈傷組織褐化直至死亡。綜合試驗(yàn)結(jié)果，初步認(rèn)為200 mg/L是愈傷組織對(duì)頭孢曲松鈉的敏感質(zhì)量濃度，而400 mg/L則為頭孢噻肟鈉的敏感質(zhì)量濃度。

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