革蘭氏陽性與陰性細(xì)菌基因組DNA提取方法的優(yōu)化

云飛 梁林 鮑彥彬 石雅麗 孫亞超 李永麗 蘭輝

摘要 在分析現(xiàn)有提取微生物基因組DNA的原理和方法基礎(chǔ)上，對(duì)SDS-NaCl法進(jìn)行了改良，以商品化微生物基因組提取試劑盒提取的基因組結(jié)果為對(duì)照，利用改良的SDS-NaCl法，分別提取大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的基因組DNA。結(jié)果表明，改良的SDS-NaCl法提取的大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌基因組DNA的 OD260/OD280分別為1.88、1.89、1.81，濃度分別為61.67、64.32、53.22 μg/mL;而商品化試劑盒提取大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌基因組DNA OD260/OD280分別為1.85、1.87、1.83，濃度分別為64.07、58.43 、52.34 μg/mL。結(jié)果證明改良SDS-NaCl法提取的革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌的基因組DNA可用于后續(xù)試驗(yàn)如全基因組測(cè)序和PCR等，同時(shí)可快速獲得大量的高質(zhì)量微生物基因組。

關(guān)鍵詞 細(xì)菌基因組DNA;革蘭氏陽性細(xì)菌;革蘭氏陰性細(xì)菌;SDS-NaCl法

中圖分類號(hào) Q933文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2021）10-0098-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.10.026

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Optimization of Methods for Genomic DNA Extraction from Bacteria

YUNFei1，LIANG Lin2，BAO Yan-bin2 et al

（1. Department of Mining Technology， Inner Mongolia University of Technology， Hohhot， Inner Mongolia 010051;2. School of Chemical Engineering and Technology， Inner Mongolia University of Technology， Hohhot， Inner Mongolia010051）

Abstract Based on the analysis of the principles and methods of genomic DNA extraction， the SDS-NaCl method was modified. The results of genomic DNA extraction by commercial genomic extraction kit were compared with those by SDS-NaCl method modified by our laboratory. The results showed that the OD260/OD280 of the genomic DNA of Escherichia coli， Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus were 1.88， 1.89 and 1.81， and the concentration were 61.67，64.32and 53.22 μg/mL respectively.The OD260/OD280 by commercial genomic extraction kit were 1.85， 1.87 and 1.83， and the concentration were 64.07，58.43 and 52.34 μg/mL respectively. The results showed that the genomic DNA extracted by the modified nacl method could be used in subsequent experiments such as whole genome sequencing and PCR， and a large number of high quality microbial genomes could be obtained rapidly.

Key words Genomic DNA;Gram positive bacterium;Gram negative bacterium;SDS-NaCl method

目前，隨著高通量測(cè)序技術(shù)日益成熟，微生物全基因組DNA的完成圖測(cè)序和重測(cè)序已成為微生物分子生物學(xué)與代謝組學(xué)研究中的重要手段，其中微生物基因組DNA的質(zhì)量對(duì)測(cè)序結(jié)果影響很大。

目前，提取微生物基因組DNA的方法主要有液氮研磨法[1-4]、凍融法[5]、加熱煮沸法[6]、堿裂解法、溶菌酶法[7-9]、SDS（十二烷基磺酸鈉）法[6，10]、CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法[10]、Chelex-100煮沸法[11]、吸附柱法[12]、磁珠法[13-14]。

SDS-NaCl法具有裂解細(xì)菌徹底和提取基因組DNA純度較好的特點(diǎn)。筆者利用改良的SDS-NaCl法，分別提取大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的基因組DNA（其中大腸桿菌是革蘭氏陰性菌，枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌是革蘭氏陽性菌），同時(shí)以商品化細(xì)菌基因組提取試劑盒提取結(jié)果為對(duì)照，通過與商品化試劑盒提取效果進(jìn)行比較，獲得一種操作簡(jiǎn)單、成本低廉，且可快速獲得較高質(zhì)量的革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌的基因組DNA。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

菌種來自內(nèi)蒙古工業(yè)大學(xué)基因工程實(shí)驗(yàn)室保存的大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購買于北京天根生化科技有限公司。蛋白酶K、溶菌酶、SDS、苯酚、氯仿和無水乙醇均為國產(chǎn)試劑。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 商品化試劑盒的提取。

提取步驟參見北京天根生化科技有限公司細(xì)菌基因組DNA試劑盒說明書。

1.2.2 改良的SDS-NaCl法。

將細(xì)菌在LB培養(yǎng)基中（酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，1 000 mL去離子水，用5 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)其pH至7.0，121 ℃蒸汽滅菌20 min）培養(yǎng)8～10 h后，取1 mL新鮮菌液放入離心管，10 000 r/min離心1 min后盡可能除凈上清;加入200 μL溶菌酶，懸浮菌體;加入10 μL RNaseA輕輕混勻;加入20 μL蛋白酶K（20 mg/mL），室溫靜置1 min;然后加入500μL的裂解液（100 mmol/L pH 7.0 Tris-HCl，500 mmol/L pH 8.0 EDTA，20 mmol/L NaCl，10%SDS），50 ℃溫浴20 min;加入300 μL的苯酚，上下混勻;再加入氯仿300 μL，混勻;10 000 r/min，5 min;轉(zhuǎn)移上清液至新離心管;加入300 μL的氯仿，混勻，離心10 000 r/min，5 min，轉(zhuǎn)移上清液到新離心管;加入1 mL無水乙醇，在-20 ℃中沉淀10 min;離心10 000 r/min，15 min，棄上清液;加入1 mL 70%的乙醇洗滌，離心10 000 r/min，5 min，棄上清液;在室溫下干燥15 min;然后加入30 μL ddH2O。取1 μL DNA溶液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，同時(shí)通過紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 商品化試劑盒提取的3種細(xì)菌基因組DNA

利用商品化試劑盒提取大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的基因組DNA，經(jīng)凝膠電泳后檢測(cè)DNA的質(zhì)量，結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，3種細(xì)菌的基因組DNA經(jīng)電泳后條帶整齊清晰，無蛋白和RNA殘留，DNA質(zhì)量較好。

2.2 改良SDS-NaCl法提取的3種細(xì)菌基因組DNA

利用改良SDS-NaCl法提取大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）的基因組DNA，經(jīng)凝膠電泳后檢測(cè)DNA的質(zhì)量，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，3種細(xì)菌的基因組DNA經(jīng)電泳后條帶整齊清晰，與商品化試劑盒提取結(jié)果相比，DNA條帶較

粗，說明改良SDS-NaCl法提取DNA的量更多，DNA的質(zhì)量更好。

2.3 基因組DNA 的濃度及純度

根據(jù)紫外分光光度法結(jié)果（表1）分析這2種方法提取細(xì)菌基因組DNA的質(zhì)量，商品化試劑盒法提取大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）基因組DNA的OD260/OD280分別是1.85、1.87和1.83，OD260/OD230分別是2.06、1.94和2.02，濃度分別是64.07、58.43和52.34 ng/mL;改良SDS法提取的大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）基因組DNA的OD260/OD280分別是1.88、1.89和1.81，濃度分別是61.67、64.32和53.22 ng/mL。結(jié)果表明，經(jīng)改良的SDS 法提取的3種細(xì)菌基因組 DNA 純度和濃度均較好（圖3），且操作步驟簡(jiǎn)單，成本低，可用于大量提取細(xì)菌基因組DNA。

3 結(jié)論

微生物基因組提取是進(jìn)行微生物分子生物學(xué)與代謝分析的基本操作，基因組的質(zhì)量與數(shù)量直接影響下游試驗(yàn)的結(jié)果，因此根據(jù)試驗(yàn)樣品的特點(diǎn)對(duì)微生物基因組提取方法進(jìn)行不斷改良是必需的，這樣可以有效提高試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性與可信度。如對(duì)于特殊環(huán)境微生物基因組的提取，如瘤胃微生物等，就必須對(duì)試驗(yàn)方法進(jìn)行改良。該研究將目前常用的微生物基因組提取方法進(jìn)行比較，同時(shí)將革蘭氏陽性細(xì)菌與陰性細(xì)菌的基因組提取特點(diǎn)進(jìn)行比較，以便今后對(duì)于特殊環(huán)境微生物基因組進(jìn)行提取方法的摸索與改良。

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