兩株豬鏈球菌血清9型菌株的生物特性分析

王召賀 陳波 徐高原 張華偉 郝根喜 潘建剛 周明光

摘要 為了解豬鏈球菌血清9型菌株KQ-1株、KQ-2株的生物特性，對其進行了菌種鑒定、生長曲線繪制、毒力因子鑒定和小鼠致病性試驗。首先采用革蘭氏染色、PCR鑒定的方法對2株菌進行菌種鑒定，然后利用豬鏈球菌的主要毒力基因mrp、epf、sly、gadph、orf2、fbps、89k的引物對2株菌的毒力基因進行鑒定;將2株菌在TSB培養(yǎng)基（含10%新生牛血清）中進行培養(yǎng)，繪制其生長曲線，初步了解這2株菌的生長特性;選取45只健康的昆明鼠注射2株菌的菌液，進行致病性試驗，了解其致病性。結(jié)果顯示，KQ-1株、KQ-2株革蘭氏染色呈陽性，PCR鑒定結(jié)果為豬鏈球菌血清9型;2株菌均在37 ℃培養(yǎng)6 h時菌液密度達到最高值。對2株菌毒力基因的鑒定結(jié)果如下：KQ-1株的基因型為mrp+/epf-/sly+/gadph+/orf2-/fbps-/89k-，KQ-2株的基因型為mrp-/epf-/sly-/gadph+/orf2+/ fbps-/ 89k-;對2株菌的小鼠致病性試驗表明，2株菌均為強毒株。

關(guān)鍵詞 豬鏈球菌;血清9型;毒力基因;致病性試驗

中圖分類號 S855.1+1文獻標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）10-0092-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.10.025

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Biological Characteristics Analysis of Two Streptococcus suis Serotype 9 Strains

WANG Zhao-he，CHEN Bo，XU Gao-yuan et al （Wuhan Keqian Biology Co.，Ltd.，Wuhan，Hubei430000）

Abstract In order to understand the biological characteristics of Streptococcus suis serotype 9 strains（KQ-1 and KQ-2），the identification of strains and their virulence genes，drawing of growth curves，mouses pathogenicity test were conducted.Those two strains were identified by Gram staining and PCR，then the primers of the main virulence genes （mrp，epf，sly，gadph，orf2，fbps，89k） of S.suis were used to identify the virulence genes of the two strains.The two strains were cultured in TSB medium （containing 10% newborn calf serum），and their growth curves were drawn to get a preliminary understanding of the growth characteristics of the two strains.45 healthy Kunming rats were injected with two strains of bacteria for the pathogenicity test to understand their pathogenicity.The results showed that the Gram staining results of KQ-1 strain and KQ-2 strain were positive，they were identified as S.suis serotype 9 strains by PCR identification.The bacterial liquid density of the two strains both reached the peak at 6 h when cultured at 37 ℃.The results of virulence factors of the two strains showed that the genotype of KQ-1 strain was mrp+/epf-/sly+/gadph+/orf2-/fbps-/89k-，while that of KQ-2 strain was mrp-/epf-/sly-/gadph+/ orf2+/fbps-/89k-.The results of pathogenicity test on mice showed that the two strains were highly virulent.

Key words Streptococcus suis;Serotype 9;Virulence genes;Pathogenicity test

豬鏈球菌（Streptococcus suis）是一種革蘭氏陽性菌，能引起感染豬只的腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、敗血癥等癥狀，屬于人畜共患病原體[1]。1998和2005年，在江蘇南通和四川資陽等地發(fā)生豬鏈球菌感染暴發(fā)事件，并引發(fā)工作人員感染，造成了重大的經(jīng)濟損失和人員傷亡[2-3]。根據(jù)莢膜多糖抗原性的不同，豬鏈球菌可分為35個血清型，即血清1～34型和1/2型。在世界范圍內(nèi)以血清2型最為流行，其次是血清9型、3型等，血清2型也是目前研究最多的血清型，而關(guān)于其他血清型的研究較少[4]。目前我國雖然沒有血清9型的暴發(fā)事件發(fā)生，但經(jīng)常從病豬體內(nèi)分離出血清9型菌株，且近年來血清9型有擴大流行趨勢[5-7]，需要引起相關(guān)研究人員和養(yǎng)殖業(yè)從業(yè)人員的注意。

武漢科前生物股份有限公司從送檢的病料中分離出2株病原菌，經(jīng)鑒定為豬鏈球菌血清9型。筆者通過革蘭氏染色、PCR鑒定的方式驗證菌種和血清型，并進行其毒力基因的鑒定、生長曲線的繪制和小鼠致病性試驗，進一步了解了2株菌的生長特性和致病特性，以期為后期開發(fā)針對性的疫苗、制定防治策略奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種 試驗菌種由武漢科前生物股份有限公司從送檢的病料中分離，并鑒定、保存，分別命名為KQ-1株、KQ-2株。

1.2 主要試劑 TSA（Tryptic Soy Agar）、TSB（Tryptic Soy Broth）培養(yǎng)基購自DB Biotech生物科技有限公司;新生牛血清購自內(nèi)蒙古金源康生物工程有限公司;革蘭氏染液購自南京建成科技有限公司;引物合成由擎科生物技術(shù)有限公司完成;PrimeSTAR Max DNA Polymerase購自TaKaRa公司。

1.3 試驗動物 SPF級昆明小鼠45只，4～6周齡，購自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物中心。

1.4 革蘭氏染色 將凍干保存的菌種取一小塊固體于TSA平板（含10%新生牛血清）上，待其溶解后，用經(jīng)酒精燈火焰燒過的接種環(huán)沾取菌液，在平板上劃線，將平板倒置，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。挑取針尖大小、表面光滑、灰白色、半透明的疑似單菌落，繼續(xù)在TSA平板（含10%新生牛血清）上劃線、傳代。重復(fù)1次，挑取疑似單菌落，進行革蘭氏染色，染色步驟按照操作說明書完成。

1.5 菌種鑒定 按照參考文獻[8]設(shè)計豬鏈球菌血清9型的莢膜多糖合成基因cps9H引物，引物序列如下：P1為GGCTACATATAATGGAAGCCC，P2為CCGAAGTATCTGGGCTACT-G。預(yù)計擴增片段大小為389 bp。引物由擎科生物技術(shù)有限公司合成。

用經(jīng)酒精燈火焰燒過的接種環(huán)從TSA平板（含10%新生牛血清）上挑取疑似單菌落，在50 μL的PBS緩沖液中攪動，使菌體從接種環(huán)上洗脫至PBS緩沖液中。水浴煮沸10 min，置于冰上2 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液作為PCR的模板。PCR體系如下：模板0.5 μL，引物P1、P2各0.5 μL，2×PrimeSTAR MAX 5 μL，用ddH2O補足10 μL。PCR程序如下：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性15 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，30個循環(huán);72 ℃延伸10 min;4 ℃下保存。將PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，120 V電泳20 min，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察有無條帶。

1.6 毒力基因鑒定

按照參考文獻[9-10]，選擇豬鏈球菌的主要毒力因子溶菌酶釋放蛋白（mrp）、胞外蛋白因子（epf）、溶血素（sly）、纖連蛋白/血纖蛋白原結(jié)合蛋白（fbps）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（gadph）、毒力相關(guān)因子（orf2）、89k毒力島作為鑒定基因，合成相應(yīng)引物，引物序列見表1。以KQ-1、KQ-2株的基因組DNA作為模板，用合成的相應(yīng)引物進行PCR擴增，鑒定菌株的基因型。

1.7 生長曲線的繪制

在無菌操作臺中挑取TSA平板（含10%新生牛血清）上經(jīng)過傳代、純化的單菌落，接種于50 mL TSB培養(yǎng)基（含10%新生牛血清）中，37 ℃ 180 r/min培養(yǎng)5～8 h，作為種子液。將種子液按2%的比例接入100 mL TSB培養(yǎng)基（含10%新生牛血清）中，37 ℃ 180 r/min培養(yǎng)，每隔2 h取出1 mL菌液，用PBS（pH 7.2，0.15 mol/L）以10倍的梯度倍比稀釋106倍，取100 μL菌液均勻涂在TSA平板（含10%新生牛血清）上，涂3個平板，約12 h后統(tǒng)計菌落數(shù)，以3個平板的平均值為準(zhǔn)，計算菌液濃度。重復(fù)3次，取平均值，繪制生長曲線。

1.8 小鼠攻毒試驗 分別挑取2個菌株在TSA平板（含10%新生牛血清）上經(jīng)過傳代、純化的單菌落，接種于50 mL TSB培養(yǎng)基（含10%新生牛血清）中，37 ℃ 180 r/min培養(yǎng)5～8h，作為種子液。將種子液按2%的比例接入100 mL TSB培養(yǎng)基（含10%新生牛血清）中，37 ℃ 180 r/min培養(yǎng)8 h，按“1.7”中菌液計數(shù)的方法計算細菌密度。收獲菌液，4 ℃下放置12 h，5 000 r/min離心，棄去上清液，以原培養(yǎng)基0.1倍體積的PBS溶液重懸菌體。將45只昆明小鼠分為9組，每組5只，每個菌株的菌液分4個濃度梯度20×108、10×108、5×108、1×108 CFU/只，以腹腔注射的方式對小鼠進行攻毒，每只小鼠注射0.2 mL，對照組5只小鼠注射0.2 mL的PBS溶液。連續(xù)觀察7 d，記錄每組死亡數(shù)，死亡小鼠立即進行解剖，對各臟器進行分菌、PCR菌種鑒定。將死亡小鼠解剖后，取心血、腦、肝、肺、脾等組織于TSA平板（10%新生牛血清）上劃線、分離細菌，用無菌接種環(huán)沾取少量腹水，按照同樣的方式于平板上劃線、分離細菌。37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取單菌落，按“1.5”中的方法，以從各器官及腹水中分離出的單菌落的基因組DNA為模板，用豬鏈球菌血清9型的特異性引物進行PCR菌種鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 革蘭氏染色 2株菌均能在TSA平板（含10%新生牛血清）上生長良好，菌落呈灰白色，光滑整齊，呈針尖大小，在燈光下可見熒光。經(jīng)革蘭氏染色后，菌體在顯微鏡下呈紫色，短桿狀或棒狀，多由3個以上菌體連結(jié)成鏈狀（圖1、2），表明這2株菌均為革蘭氏陽性菌。

2.2 菌種鑒定

如圖3所示，以cps9H引物對2株菌的基因組DNA進行PCR擴增，2株菌均能擴增出389 bp大小的片段，陰性對照無條帶，表明2株菌均為豬鏈球菌血清9型。

2.3 毒力基因鑒定

以KQ-1、KQ-2株的基因組DNA為模板，用mrp、epf、sly、gadph、orf2、fbps、89k基因的引物進行PCR擴增后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像系統(tǒng)下得到凝膠圖像。如圖4所示，KQ-1株的基因組DNA由mrp、sly、gadph基因的引物擴增后，分別在316、1 099、571 bp處有條帶出現(xiàn)，其余引物的泳道內(nèi)無條帶;KQ-2株的基因組DNA由gadph、orf2基因的引物擴增后，分別在825和571 bp處有條帶出現(xiàn)，其余引物的泳道內(nèi)無條帶;陰性對照組無條帶出現(xiàn)。這表明KQ-1株的基因型為mrp+/epf-/sly+/gadph+/orf2-/fbps-/89k-，KQ-2株的基因型為mrp-/epf-/sly-/gadph+/orf2+/fbps-/89k-，基因型的不同提示了2株菌的毒力和感染宿主后引起的癥狀可能有所不同。

2.4 生長曲線的繪制

將2株豬鏈球菌血清9型的種子液按2%的比例接種到TSB培養(yǎng)基（含10%新生牛血清）中，每2 h計數(shù)1次，重復(fù)3次，用平均值繪制出生長曲線。從圖5、6可以看出，2株菌在37 ℃下培養(yǎng)2 h即進入對數(shù)期，培養(yǎng)6 h 進入穩(wěn)定期，活菌數(shù)達到峰值，KQ-1株的活菌數(shù)達到8.7×108 CFU/mL，KQ-2株的活菌數(shù)達到8.1×108 CFU/mL，12 h后活菌數(shù)明顯下降，進入衰亡期。

2.5 小鼠致病性試驗

KQ-1菌株、KQ-2菌株分別以20×108、10×108、5×108、1×108 CFU/只的菌液濃度對昆明小鼠進行攻毒試驗。攻毒后7 d，每組小鼠的存活情況見表2。參考Wei等[11]的方法對2株豬鏈球菌血清9型菌株的毒力進行判定，攻毒劑量為5×108 CFU/只的試驗組出現(xiàn)50%（含）以上的菌株為強毒（HV）;攻毒劑量為30×108 CFU/只的試驗組

出現(xiàn)50%（含）以上死亡，攻毒劑量5×108 CFU/只的試驗組50%（不含）以上不死亡的為中等毒力（MV）;攻毒劑量30×108 CFU/只的試驗組50%（不含）以上不死亡的為低毒（LV）。該試驗中KQ-1株攻毒小鼠5×108 CFU/只的試驗組有80%死亡，KQ-2株攻毒小鼠1×108 CFU/只的試驗組有60%死亡，均可判定為強毒株。攻毒數(shù)小時后，KQ-1菌株20×108 CFU/只的試驗組有1只小鼠急性死亡;至攻毒后第3天，攻毒劑量20×108 CFU/只的試驗組與攻毒劑量10×108 CFU/只的試驗組小鼠已全部死亡，攻毒劑量5×108 CFU/只的試驗組有4只小鼠死亡，攻毒劑量1×108 CFU/只的試驗組無小鼠死亡，至攻毒后7 d內(nèi)不再有小鼠死亡。攻毒劑量1×108 CFU/只的試驗組無小鼠死亡，但有2只小鼠出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，頭部傾斜（圖7A），將出現(xiàn)神經(jīng)癥狀的小鼠以頸椎脫臼的方式處死，經(jīng)剖檢發(fā)現(xiàn)小鼠腦部有水腫、出血現(xiàn)象（圖7B）。

KQ-2菌株20×108 CFU/只試驗組在攻毒后第1天有1只小鼠死亡;從攻毒后第1天至第5天陸續(xù)有小鼠死亡，至攻毒后7 d，20×108 CFU/只試驗組死亡4只，10×108 CFU/只試驗組死亡4只，5×108 CFU/只試驗組有3只死亡，1×108 CFU/只試驗組有3只死亡。10×108CFU/只試驗組有2只小鼠出現(xiàn)明顯的關(guān)節(jié)炎癥狀，無法行走（圖8A），另有1只小鼠出現(xiàn)十分少見的眼結(jié)膜蒼白現(xiàn)象;5×108 CFU/只試驗組有1只出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎癥狀，與10×108 CFU/只試驗組出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎的小鼠癥狀相似，另有1只小鼠出現(xiàn)稍輕的眼結(jié)膜蒼白現(xiàn)象（圖8B）;1×108 CFU/只試驗組有1只小鼠出現(xiàn)稍輕的眼結(jié)膜蒼白現(xiàn)象。剖檢后發(fā)現(xiàn)，KQ-1株攻毒的小鼠雖然死亡速度較KQ-2更快，但KQ-2株攻毒的小鼠腦水腫更明顯，腦部呈果凍樣，并伴有明顯出血（圖8C）。

在無菌工作臺上，從死亡小鼠挑取一小部分的器官接種到TSA平板（含10%新生牛血清）上，37 ℃恒溫培養(yǎng)過夜，待長出菌落（圖9、10），按“1.5”中的方法進行PCR鑒定，以ddH2O為陰性對照。從2菌株攻毒死亡小鼠體內(nèi)各器官和腹水接種平板后長出的菌落均可擴增出389 bp大小的條帶，表明分離出的菌落均為豬鏈球菌血清9型（圖11）。

3 討論

豬鏈球菌是一種人畜共患病原菌，對我國養(yǎng)殖業(yè)危害嚴重，對豬鏈球菌的研究有助于人們進一步了解這種病原菌，掌握其發(fā)病特性，有針對性地研發(fā)治療豬鏈球菌病的藥物和預(yù)防豬鏈球菌病的疫苗，更好地制訂防治策略和方法。目前世界上豬鏈球菌流行最多的是血清2型，致病力也最強，而在歐洲、大洋洲一些地區(qū)最流行的是血清9型[12]，其致病力較血清2型稍弱，近幾年血清9型在我國有擴大流行趨勢。目前國內(nèi)對血清9型的研究很少，市場上也沒有針對血清9型的疫苗問世，需要加強對血清9型流行病學(xué)的關(guān)注，對其進行更深入的研究，并研制有針對性的疫苗，防止出現(xiàn)血清9型的大范圍流行。

該研究對武漢科前生物股份有限公司分離、鑒定、保存的2株豬鏈球菌血清9型進行了菌種鑒定、毒力基因鑒定、生長曲線繪制、毒力試驗等研究，對其菌種特性和致病力有了初步的了解。通過對2個菌株的革蘭氏染色和菌種的PCR鑒定，可以確定2菌株均為豬鏈球菌血清9型。從生長曲線可看出，2菌株在TSB培養(yǎng)基（含10%新生牛血清）中培養(yǎng)時，均在6～10 h達到菌體含量最高值，提示可在這一時間收集菌液，得到最大含量的抗原。

對2菌株毒力基因的鑒定結(jié)果顯示，KQ-1株的基因型為mrp+/epf-/sly+/gadph+/orf2-/fbps-/89k-，KQ-2株的基因型為mrp-/epf-/sly-/gadph+/ orf2+/fbps-/89k-。溶菌酶釋放蛋白（mrp）又稱為M蛋白，被普遍認為與豬鏈球菌的吸附能力有關(guān)。曾巧英等[13]研究發(fā)現(xiàn)，mrp+的菌株對HEp-2細胞的最大黏附菌數(shù)顯著高于mrp-株，認為其是主要的黏附素。胞外因子（epf）只在培養(yǎng)上清中發(fā)現(xiàn)，表明其是一種分泌蛋白。mrp和epf被認為是豬鏈球菌2種重要的毒力因子，與豬鏈球菌的致病性有密切關(guān)系，Vecht等[14]對108株分離的豬鏈球菌的mrp、epf基因的研究發(fā)現(xiàn)，從病豬體內(nèi)分離出的菌株80%都是mrp+/epf+表型，而健康豬體內(nèi)分離出的菌株86%都是mrp-/epf-表型。但需要指出的是這2種毒力因子對株鏈球菌的致病性并非必需，所以不能簡單地以這2種毒力因子作為致病性的標(biāo)志[15]。毒力因子的鑒定結(jié)果表明，KQ-1株為mrp+/epf-表型，KQ-1株為mrp-/epf-表型。小鼠致病性試驗結(jié)果顯示，KQ-1株比KQ-2株具有更高的致病性，在注射20×108 CFU含量的菌液后幾個小時即可引起小鼠的急性死亡，這可能是mrp賦予了KQ-1株對細胞更強的吸附能力，可以更容易突破血腦屏障，引發(fā)小鼠的腦膜炎，使小鼠死亡。

溶血素（sly）也稱豬溶素，最早是由Jacobs等[16]進行了純化、鑒定和相關(guān)研究。溶血素對包括上皮細胞、巨噬細胞在內(nèi)的多種細胞均有細胞毒性[17-18]，但其機制和在疾病中的作用尚不清楚。這表明溶血素與豬鏈球菌的毒力可能有緊密關(guān)系，然而在敲除溶血素基因的試驗中，只有小鼠模型中發(fā)現(xiàn)了毒力下降的情況[19]，而對豬的攻毒模型研究中敲除溶血素基因?qū)Χ玖缀鯖]有影響[20]。該研究中的小鼠致病性試驗結(jié)果顯示，

2菌株均為強毒株，KQ-1株具有sly基因，KQ-2株不具有sly基因，KQ-2株沒有小鼠全部死亡的小組，出現(xiàn)小鼠死亡的時間也較KQ-1株滯后，可能與sly基因有一定關(guān)系。

甘油醛-3-磷酸脫氫酶（gadph）多現(xiàn)于細菌胞漿中，是糖分解途徑中的一種酶，其作用是將GAP磷酸化，生成1，3-二磷酸甘油酯。gadph在豬鏈球菌的有毒株和無毒株中均有發(fā)現(xiàn)，與白蛋白有結(jié)合活性，發(fā)揮一定的黏附作用。在小鼠模型中，隨著gadph表達量的增加，豬鏈球菌的毒力也隨之增加[21]。李麗等[22]從廣東某豬場中分離出的1株豬鏈球菌血清9型，發(fā)現(xiàn)其也具有g(shù)adph基因，通過對比發(fā)現(xiàn)其gadph基因與GenBank中國內(nèi)外分離株的同源性為98.7%～99.6%，序列十分保守。該研究中的2株豬鏈球菌血清9型都具有g(shù)adph基因，說明該基因可能在豬鏈球菌血清9型中普遍存在。gadph蛋白與細菌的黏附作用有關(guān)，其機制仍需進一步研究。

orf2基因來自于Smith等[23]發(fā)現(xiàn)的一段毒力相關(guān)序列，這段序列通過計算機分析后，發(fā)現(xiàn)其含有4個開放閱讀框，其中orf1、orf3和orf4都與其他已知基因有部分相似性，orf2與其他已知基因均無相似性，由此被認為是一種新的毒力因子。李干武等[24]對31株豬源鏈球菌的檢測中發(fā)現(xiàn)，orf2基因存在于約87.5%的豬鏈球菌血清2型中，其他豬源鏈球菌中有約39.1%具有orf2基因，在A、B、C、D等群中均有出現(xiàn)，表明orf2基因在豬源鏈球菌中普遍存在。

通過對2株豬鏈球菌血清9型的7種毒力基因的檢測可以看出，2菌株有4種毒力基因表型是相同的，其他3種毒力基因表型不同，這表明同一血清型的豬鏈球菌其基因型仍有可能存在很大差異。它們在小鼠上所引起的癥狀不同，可能與其毒力因子的差異有關(guān)。該研究的小鼠致病性試驗中，2株豬鏈球菌均為強毒株，KQ-1株攻毒小鼠主要表現(xiàn)為急性死亡和神經(jīng)癥狀，初步判定為腦膜炎型;KQ-2株攻毒小鼠則主要表現(xiàn)出關(guān)節(jié)炎癥狀，初步判定為關(guān)節(jié)炎型，這些癥狀與菌株的毒力因子的聯(lián)系需要更深入的研究。它們對豬的致病性需要通過進一步的試驗進行驗證，下一步需要摸索出適合的攻毒模型，為疫苗的研制、制定防疫策略奠定基礎(chǔ)。

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